CC BY
40© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Т.А.Данилова, Г.А.Данилина, А.А.Аджиева, А.Г.Минко, Н.В.Алексеева
ФОРМИРОВАНИЕ БИОПЛЕНОК СТРЕПТОКОККАМИ ГРУППЫ А РАЗНЫХ ТИПОВ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АНТИБИОТИКОВ НА ЭТОТ ПРОЦЕСС
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Оценка способности к формированию биопленок у разных М, Т и МТ-типов стрептококка группы А (СГА), а также изучение влияния различных антибиотиков на формирование биопленок. Материалы и методы. Изучено 43 штамма различных М и Т-типов СГА. Культуры выращивали на бульоне Todd-Hewitt c добавлением 0,5% экстракта дрожжей. Сравнительную оценку способности к формированию биопленки проводили с помощью фотометрии. Использованы антибиотики бензилпенициллин, окса-циллин, цефалоспорин, цефуроксим и цефтриаксон в различных концентрациях. Результаты. СГА существенно различаются по способности к формированию биопленок. Наиболее высокая способность отмечена у 8 штаммов 2М, 9М, 12М, 13М, 19М, 30М, 36М типов и типа 6МТ. Одновременное внесение в лунку культур СГА и антибиотиков, за исключением цефтриаксона, приводило к ингибиции роста как планктонных клеток, так и биопленок. Заключение. Способность СГА к формированию биопленки зависит от серо-типа стрептококка. При одновременном внесении в лунку СГА с антибиотиком биопленка не образуется.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 50—54
Ключевые слова: стрептококки группы А, биопленки, антибиотики T.A.Danilova, G.A.Danilina, A.A.Adzhieva, A.G.Minko, N.V.Alekseeva
BIOFILM FORMATION BY GROUP A STREPTOCOCCI OF VARIOUS TYPES AND STUDY OF ANTIBIOTICS EFFECT ON THIS PROCESS
Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
Aim. Evaluation of the ability to form biofilms by various M, T and MT-types of group A streptococci (GAS), as well as study of the effect of various antibiotics on biofilm formation. Materials and methods. 43 strains of various M and T type GAS were studied. The cultures were grown in Todd-Hewitt broth with the addition of 0.5% yeast extract. Comparative evaluation of the ability to form biofilm was carried out using photometry. Benzylpenicillin, oxacillin, cephalosporin, cefuroxime and ceftriaxone antibiotics were used at various concentrations. Results. GAS differ significantly by their ability to form biofilms. The highest ability was noted in 8 strains — 2М, 9М, 12М, 13М, 19М, 30М, ЗбМ-types and 6МТ type. Simultaneous introduction of GAS cultures and antibiotics into the culture well, except for ceftriaxone, resulted in growth inhibition of both plankton cells and biofilms. Conclusion. The ability of GAS to form biofilm depends on streptococci serotype. During simultaneous introduction of GAS with antibiotics into the well, the biofilm does not form.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 2, P. 50—54 Key words: group A streptococci, biofilms, antibiotics
Стрептококк группы А (СГА) (Streptococcus pyogenes) вызывает широкий спектр заболеваний у человека — фарингит, тонзиллит, пиодермию, скарлатину, рожу, сепсис, инвазивную инфекцию, которая иногда сопровождается развитием некротического фасцита и синдромом токсического шока. К постстрептококковым осложнениям относят такие тяжелые заболевания как ревматизм и гломерулонефрит[1, 2, 14]. Кроме
того, колонии СГА обнаруживают у здоровых людей без признаков заболевания, что играет большую роль в распространении инфекции [15]. В настоящее время известно более 100 типов СГА, различающихся по М-белку. В ряде случаев типирование проводится по Т-белку, причем Т-тип не всегда совпадает с М-типом.
До недавнего времени развитие стрептококковой инфекции не связывали с формированием биопленок. Одно из первых сообщений относится к 2003 г., когда японский исследователь Akiyama H. при анализе кожных поражений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии обнаружил микроколонии СГА, окруженные гликокаликсом [5]. В дальнейшем было показано, что СГА способны формировать биопленки in vivo и in vitro и что эта способность присуща разным типам стрептококка группы А, но в различной степени[16].
Образование биопленки всегда начинается с адгезии бактерии к поверхности клетки хозяина, где она связывается с углеводными или белковыми рецепторами. В состав адгезинов СГА входят липотейхоевая кислота, гиалуроновая капсула, М-белки, ламинин-, коллаген- и фибронектин-связывающие белки [7]. Некоторые адгезины СГА, в том числе Т-антиген, связаны с пилями и фибриллами, которые обусловливают более интенсивное связывание с тканями хозяина [10].
Многочисленными исследованиями показано, что биопленки значительно менее чувствительны к антибиотикам, чем те же бактерии в планктонной форме [3]. Хотя СГА чувствительны к пенициллину при тестировании in vitro, примерно треть больных ангиной не поддается лечению этим и другими антибиотиками [6]. Поэтому представляло интерес изучить влияние антибиотиков различных групп на процесс формирования биопленок.
Цель исследования — оценка способности к формированию биопленок у разных М, Т и МТ типов СГА, а также изучение влияния различных антибиотиков на этот процесс.
В работе использовали 43 штамма СГА из музейной коллекции лаборатории стрептококковых инфекций ФНЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Из них: 22 типированных по М-белку, 15 штаммов Т-типа и 6 штаммов МТ-типа. Культуры СГА выращивали на бульоне Todd-Hewitt (TH) в течение 18 часов при 37°C. Исследования по формированию биопленок проводили по [13] в стерильных полистироловых 96-луночных планшетах фирмы ^star. Суточную культуру тестируемого штамма разводили в стерильном 0,9% физиологическом растворе до мутности, эквивалентной 10,0 по стандарту McFarland (Den-1 McFarland Densitometre, Biosan, Латвия), затем 1:40 бульоном ТН, обогащенным 0,5% дрожжевым экстрактом, и вносили в лунки планшета по 100 мкл на лунку ( 4 повтора для каждого штамма). В качестве отрицательного контроля использовали питательную среду. Планшеты помещали в термостат при 37°C с 5% СО2 на 2 суток. Затем планктонные клетки удаляли отсасыванием. Для окрашивания в лунки вносили по 100 мкл 1% водного раствора кристалл виолета и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Краситель удаляли, лунки промывали трижды дистиллированной водой (по 400 мкл на лунку). Затем в лунки, отмытые от несвязавше-гося красителя, вносили по 150 мкл 96° этилового спирта. Экстракцию проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. Интенсивность окрашивания спиртового раствора после экстракции определяли на фотометре iEMS Reader MF (Labsystems, Швеция) при длине волны 540 нм. Более детальное исследование биопленок проводили с помощью люминесцентной микроскопии. Стрептококки выращивали на покровном стекле, помещенном в чашку Петри с питательной средой, в течение 48 часов при 37°C. Сформировавшуюся биопленку окрашивали красителем Dead/Live в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, отмывали дважды дистиллированной водой и просматривали в люминесцентном микроскопе при увеличении х10х40.
Изучение влияния антибиотиков на процесс формирование биопленок проводили с использованием штамма М 30 типа. В эксперимент взяты ß-лактамные анти-
биотики (бензилпенициллин, оксациллин) и цефалоспорины (цефтриаксон, цефу-роксим и цефалоспорин. Суточную культуру штамма 30М, предварительно разведенную 1:40 в бульоне TH c экстрактом дрожжей, вносили в лунки 96-луночно-го планшета. Антибиотики в соответствующем разведении добавляли в лунку одновременно с бактериальной суспензией так, чтобы конечный объем составлял 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 2 суток при 37°C. После этого проводили стандартную процедуру окрашивания биопленок с последующей фотометрией. В качестве положительного контроля использовали стрептококковую культуру без добавления антибиотиков, отрицательным контролем являлась стерильная питательная среда.
Статистическую обработку проводили по результатам не менее трех независимых опытов. Средние значения и величину стандартной ошибки подсчитывали в программе Excel.
В результате проведенных исследований установлено, что стрептококки группы А заметно различаются по способности к формированию биопленок. Следует отметить, что все штаммы с высокой способностью к образованию биопленок (OD выше 1,0) относились к М-типам. Таких штаммов обнаружено 7 из 22.
Среди Т-типов такие штаммы не обнаружены, найдены штаммы с более низкой пленкообразующей способностью (OD ниже 1,0).
Изучено также 6 штаммов, относящихся одновременно к М и Т типам. Среди них штамм типа МТ6 отличался высокой способностью к образованию биопленки (OD 1,4), остальные 5 штаммов имели более низкие величины ОБ.
Самой высокой пленкообразующей способностью обладал тип 30 М, поэтому он был выбран для проведения серии опытов с антибиотиками. Несколько ниже показатели OD (1,5 — 1,6) отмечены у штаммов М12, М13 и М9. Самый высокий показатель OD среди Т-типов отмечен у Т14, ниже (около 0,65) — у Т19 и Т29. У остальных Т-типов пленкообразующая способность была выражена еще слабее (OD 0,3 и ниже).
Интересно отметить, что типы 1М и 3MT, которые наиболее часто выделяются при стрептококковых инфекциях, в том числе при инвазивной инфекции, обладали низкой способностью к формированию биопленок. То же можно сказать о типе М5, в М-белке которого обнаружены эпитопы, перекрестно-реагирующие с тканями млекопитающих и который считается индуктором аутоиммунных реакций при ревматизме.
При использовании метода люминесцентной микроскопии для окрашивания биопленок на покровном стекле с красителем Dead /Live, который позволяет определять наличие живых бактерий, обнаружены ярко-зеленые конгломераты стрептококков разной формы и размера.
В следующей серии опытов проводили изучение влияния антибиотиков на формирование биопленок. Бензилпенициллин (исходная концентрация 1 млн ЕД во флаконе) испытывали в концентрации 1:10 000 ЕД — 0,0001 ЕД, остальные антибиотики — в концентрации 10 000 мкг/мл — 0,0001 мкг/мл. Антибиотики вносили в среду одновременно с культурой стрептококка и инкубировали планшет, как описано ранее. На вторые сутки с помощью фотометра определяли количество планктонных клеток в лунках, после чего их удаляли и проводили стандартную процедуру окрашивания биопленок. При использовании широкого спектра доз бензилпенициллина не наблюдали роста как планктонных клеток, так и биопленок.
Такие же результаты были получены при использовании разных доз оксациллина, цефуроксима и цефотаксима. Исключением явился цефтриаксон. При добавлении малых доз этого препарата, начиная с 0,01 мкг/мл, наблюдали рост планктонных клеток и биопленок, который увеличивался по мере уменьшения дозы антибиотика.
При использовании более высоких доз антибиотика не наблюдали роста планктонных клеток и формирования биопленки. При добавлении тех же доз антибио-
тиков к уже сформировавшейся биопленке эффект ингибиции отсутствовал. Однако эти данные носят предварительный характер и требуют дальнейшего изучения.
В результате проведенных исследований установлено, что стрептококки группы А разных М- и Т-типов обладают различной способностью к формированию биопленок in vitro. Наиболее выраженная способность к биопленкообразованию отмечена у 8 штаммов из 43, причем все они относились к М-типам. У Т-типов пленкообразующая способность выражена слабее. Интересно отметить, что типы 1М и 3М (в наших экспериментах 3ТМ), которые наиболее часто выделяются при инвазивной стрептококковой инфекции, обладали невысокой способностью к формированию биопленок. Сходные данные получены другими авторами. Так, Lembke C. et al. [9] было показано, что при анализе 9 клинически значимых серотипов только 4 (2М, 6М, 14М и 18М) обладали выраженной способностью к формированию биопленки на поверхности полистирола и стекла. У типов 1М и 3М пленкообразующая способность была выражена в значительно меньшей степени. Кроме того, авторы показали, что способность к биопленкообразованию варьирует у разных штаммов в пределах одного серотипа [9].
Чувствительность к антибиотикам различна у бактерий, находящихся в планктонном состоянии и в виде биопленок. Бактерии в составе биопленки могут быть в 1000 раз более устойчивыми к антибиотикам, чем планктонные формы. Повышенная резистентность бактерий в составе биопленки связана, прежде всего, с наличием углеводного матрикса, который затрудняет проникновение как антимикробных факторов, так и факторов иммунитета хозяина [3, 4, 11, 12].
В наших опытах по изучению влияния антибиотиков на процесс формирования биопленки при одновременном внесении в лунку культуры стрептококка и антибиотика отсутствовал рост как планктонных клеток, так и биопленок. Таким образом, использованный нами штамм типа М30 в планктонной форме оказался чувствительным ко всем использованным антибиотикам, причем даже в очень малых дозах. Определить минимальную ингибирующую концентрацию удалось только для цеф-триаксона (0,01 мкг/мл).
Формирование биопленки является одним из механизмов хронизации инфекционного процесса. Стрептококковый фарингит часто переходит в хроническую или возвратную форму в результате недостаточного лечения антибиотиками примерно у 30% больных [6]. Авторы показали, что штаммы, взятые от недолеченных больных, образуют биопленки in vitro, и эти биопленки требуют значительно больших доз антибиотиков по сравнению с планктонными культурами.
В настоящее время установлено, что многие хронические инфекции вызываются бактериями, растущими в виде биопленок. Это бактериальное сообщество имеет сложную структуру, существует в динамике и может развиваться на абиотических (пластик, стекло, металл) и биотических (растения, животные, человек) поверхностях. Первый этап формирования биопленки представляет собой адгезию планктонных клеток к поверхности сначала с помощью электростатических связей, а затем более прочного контакта бактериальных поверхностных структур с белковыми или углеводными структурами тканей хозяина. На втором этапе происходит пролиферация бактериальных клеток и созревание биопленки. В ее состав могут входить клетки одного вида или при формировании в нее включаются бактерии других видов. В это же время происходит образование экстрацеллюлярного матрикса, стабилизирующего структуру биопленки. Однако рост сообщества ограничен размером поверхности, количеством питательных веществ и т.д. Наступает третий этап — полная или частичная деградация пленки с возможным образованием новых очагов другой локализации [11]. Межклеточные взаимодействия между бактериями в биопленке осуществляются с помощью специального механизма Quorum Sensing (QS). Для этого существуют специальные сигнальные молекулы, которые называются аутоиндукторами. У стрептококков это — олигопептиды [7, 11]. QS дает бактериям возможность проводить
мониторинг окружающей среды и менять поведение на уровне клеточной популяции, изменяя число и количество клеток, а также воздействуя на защитные системы хозяина, модулируя активность различных систем организма.
Л ИТЕРАТУРА
1. Данилова Т.А. Инвазивная инфекция, вызываемая стрептококками группы А, и синдром
стрептококкового токсического шока. Журн. микробиол. 2001, 3: 99-105.
2. Клейменов Д.А., Брико Н.И., Аксенова А.В. Стрептококковая (группы А) инфекция в Российской Федерации: характеристика эпидемиологических детерминант и оценки современных масштабов проблемы. Эпидемиол. и вакцинопроф. 2011, 2: 5-12.
3. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журн. микробиол.
2011, 3: 99-109.
4. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М. Образование биопленок симбионтными представителями микробиоты кишечника как форма существования бактерий. Вестник СПбГУ, 2013, сер. 11, вып. 1: 179-186.
5. Akiama H., Morisane S., Yamasake et al. Assessment of Streptococcus pyogenes microcolony
formation in infected skin by confocal laser scanning microscopy. J. Dermatol. Sci. 2003, 32: 193-199.
6. Conley J., Olson M.E., Cook L.S. et al. Biofilm formation by group A streptococci: is there a
relationship with treatment failure? J. Clin. Microbiol. 2003, 41: 4043-4048.
7. Courtney H.S., Ofek I., Penfound T. et al. Relationship between expression of the family of M
proteins and lipoteichoic acid to hydrophobicity and biofilm formation in Streptococcus pyogenes. PLoS One. 2009, 4 (1) : e4166.
8. LaSarre B., Chang J.C., Federle M.J. Redundant group A signaling peptides exhibit unique activation potential. J. Bacteriol. 2013, 195: 4310-4318.
9. Lembke C., Podbielsky A., Hidalgo-Grass C. et al. Characterization of biofilm formation by
clinically relevant serotypes of group A streptococci. Appl. Environ Microbiol. 2006, 72: 28642875.
10. Manetti A.G.O., Zingaretti C., Falugi F. et al. Streptococcus pyogenes pili promote pharyngeal cell adhesion biofilm formation. Mol. Microbiol. 2007, 64: 968-983.
11. Marks L.R., Mashburn-Warren L., Federle M.J. et al. Streptococcus pyogenes biofilm growth in vitro and in vivo and its role in colonization, virulence and genetic exchange. J. Infect. Dis. 2014: 1-10.
12. Nobbs A.H., Lamont R.J., Jenkinson H.F. Streptococcus adherence and colonization. Micro-biol. Mol. Biol. Rev. 2009, 73: 407-450.
13. O'Toole G.A., Kolter R. Initiation ofbiofilm formation in Pseudomonas fluorescence WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 1998, 28: 449-461.
14. Ralph A.P., Carapetis J.R. Group A streptococcal diseases and their global burden. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2013, 368: 1-27.
15. Roberts A.L., Connolly K.L., Kirse D.J. et al. Detection of group A streptococcus in tonsils from pediatric patients reveals high rate of asymptomatic streptococcal carriage. BMC Pediatr.
2012, 12: 3.
16. Thenmozhi R., Balagi K., Rao T.S., Pandian S.K. Characterization of biofilms in different clinical M serotypes of Streptococcus pyogenes. J. Basic Microbiol. 2011, 51: 196-204.
Поступила 20.04.14
Контактная информация: Данилова Т.А., д.б.н., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-58-61
