CC BY
110
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.371:579.841.95].015.46.076.9
Фирстова В.В., Павлов В.М., Горбатов А.А., Комбарова Т.И., Караулов А.В., Дятлов И.А.
ФОРМИРОВАНИЕ АНТИТУЛЯРЕМИйНОГО КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ответа, индуцированного У мышей F.TULARENSIS 15 НИИЭг
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279, Оболенск, Россия
Противотуляремийный иммунитет формируется после заболевания туляремией или иммунизации вакцинным штаммом F.tularensis 15 НИИЭГ У мышей в зависимости от дозы и пути введения живой туляремийной вакцины формируется вакцинальный процесс с различным уровнем воспаления.
Цель исследования - оценить влияние иммунизирующей дозы и пути введения вакцинного штамма F.tularensis 15 НИИЭГ на степень воспаления и формирование противотуляремийного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей.
Результаты анализа динамики изменения массы тела у мышей, иммунизированных подкожно или внутрикожно бактериями F.tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5, 15, 45 или 135 КОЕ/мышь, показали выраженное снижение массы у мышей, иммунизированных высокой дозой вакцины. Определяли уровень антител (АТ) к кислотонерастворимому комплексу (КНК) F.tularensis 15 НИИЭГ в сыворотке крови мышей. Сравнивали пролиферативную активность лимфоцитов, количество CD69+-субпопуляций В-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов, концентрацию интерлейкина (ИЛ)-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17 в культуре иммунных спленоцитов, активированных антигенами туляремийного микроба.
В зависимости от степени воспаления, регистрируемого по уровню падения массы и изменению цитокиновой активности у мышей наблюдали усиление (при низких дозах иммунизации) или подавление (при дозе 135 КОЕ/мышь) клеточных реакций in vitro на КНК, а уровень гуморального ответа усиливался по мере увеличения иммунизирующей дозы. При низких дозах иммунизации у мышей появлялась популяция специфических В-лимфоцитов, активирующихся в присутствии КНК, но не синтезирующих АТ к КНК. Наличие специфически активированных Т- и В- лимфоцитов (без АТ) было достаточным для защиты животных от заражения высоковирулентным штаммом F.tularensis.
Ключевые слова: Francisella tularensis; иммунитет; антитела; лимфоциты; цитокины; рецепторы.
Firstova V.V., Pavlov VM., Gorbatov A.A., Kombarova N.I., Karaulov A.V., Dyatlov I.A.
the formation of cell articulating and humoral immune response induced it mice
F. TULARENSIS 15 NIIEG
Federal State Institution of Science State Research Center for Applied Microbiology & Biotechnology, obolensk, Russia Vaccination with F. tularensis 15 NIIEG or prior encounter with F. tularensis generally results in antitularemia immunity. By use of different doses and routs of immunization murine tularemia models may be used to explore a picture of vaccine process with various level of inflammation.
The goal of this study was estimation of doses and routs of immunization with F.tularensis 15 NIIEG on the development of inflammation, cellular and humoral antitularemia immune response in mice.
We analyzed weight of mice immunized with F.tularensis 15 NIIEG intracutaneously or subcutaneously in doses 5, 15, 45 or 135 CFU per mice. We also analyzed antibody level in mice blood, lymphocyte proliferation, percent of CD69+ B-lymphocytes, T-helpers and cytotoxic lymphocytes, concentration of IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17 in culture of splenocytes activated with F.tularensis antigens.
Level of inflammation after immunization was estimated on the bases of mice weight loss and changing in cytokine activities response to tularemia antigens. The most decrease in weight appeared in mice groups immunized with high doses of vaccine. It was found that specific cellular immune response increased after immunization with low doses and decreased after immunization with high dose (135 CFU/mice) of F.tularensis 15 NIIEG. Antibody level increased in proportion to immunization dose. After low dose of immunization B-lymphocytes didn't produced antitularemia antibodies although it activated in response to tularemia antigens. Appearance of specifically activated T- and B-lymphocytes conferred to mice defense against challenge with high virulent strain of F.tularensis.
Key words: Francisella tularensis; immunity; antibody; lymphocytes; cytokines; receptors
Туляремия - антропозоонозная инфекция, вызываемая факультативными внутриклеточными грамотрицательными бактериями F. tularensis. Для профилактики туляремии в России используют живую туляремийную вакцину, приготовленную на основе вакцинногоштаммаF tularensis 15НИИЭГ. После вакцинации или туляремийной инфекции у людей через несколько недель формируется длительный про-тективный иммунитет [1]. Основным звеном защиты организма от туляремии является клеточный иммунитет [2]. Гуморальное звено иммунитета в защите от туляремийной
Для корреспонденции: Фирстова Виктория Валерьевна, e-mail: firstova@obolensk.org
For correspondence: Firstova Viktoriya Valer’yevna, e-mail: firstova@obolensk.org
инфекции играет второстепенную, но существенную роль особенно при аэрозольном пути проникновения возбудителя [3, 4].
Наиболее распространенной моделью, используемой для изучения иммуногенеза туляремии, являются лабораторные мыши [5-7]*. В зависимости от дозы и пути введения живой туляремийной вакцины у мышей формируется вакцинальный процесс с различным уровнем воспаления, который может привести к гибели животного [8].
Цель исследования - оценить влияние иммунизирующей дозы и пути введения вакцинного штамма F.tularensis 15 НИИЭГ на степень воспаления и формирование противоту-
* При работе учтены «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
- 147 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014
ляремийного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей.
Материалы и методы. Штаммы. Туляремийный вакцинный штамм F.tularensis 15 НИИЭГ, природный вирулентный штамм F.tularensis 503 были получены из “ГКПМ Обо-ленск”. Бактерии F.tularensis выращивали на FT-агаре (ГНЦ ПМБ, Оболенск) 18 ч при 37°С.
Животные. Мышей линии BALb/c массой 18-20 г иммунизировали живой туляремийной вакциной однократно, подкожно или внутрикожно в дозах 5, 15, 45 и 135 КОЕ/мышь. На 28-е сутки после иммунизации у половины иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и спленоциты на исследования. Вторую половину экспериментальных животных заражали вирулентным штаммом F.tularensis 503 в дозе 1-103 КОЕ/мышь подкожно. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут, погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Все зараженные туляремией исходно интактные мыши погибли на 4-6-е сутки после заражения, все иммунные выжили.
Кислотонерастворимый комплекс (КНК) F.tularensis -белково-липополисахаридная фракция, полученная из осветленного лизата бактерий F.tularensis 15 линии НИИЭГ в результате его закисления до рН 4,5.
Определение уровня АТ к КНК. Выявление специфического связывания КНК с АТ в сыворотках мышей проводили общепринятым методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). КНК адсорбировали по 10 мкг/мл в лунках 96-луночных плоскодонных полистирольных планшетов для ИФА. Результаты ИФА оценивали по оптической плотности окрашенного раствора на микропланшетном спектрофотометре “Униплан” (“Пикон”, Россия) при длине волны 450 нм.
Инкубирование спленоцитов. Спленоциты (5-105 кл/мл) каждой группы мышей выделяли и инкубировали в лунках 96-луночного планшета по 200 мкл при 37°С во влажной атмосфере 5% СО2 в присутствии 10 мкг/мл КНК в течение 24 ч для выявления субпопуляций активированных лимфоцитов по поверхностным маркерам; 72 ч для анализа уровня цитокинов в надосадочной жидкости; 6 сут для определения пролиферативной активности лимфоцитов.
Определение содержания поверхностных маркеров. Спленоциты окрашивали моноклональными АТ к поверхностным маркерам CD3 PerCP (BD Biosciences Farmigen), CD4 APC, CD8 PE, CD69 FITC, CD19APC (Caltag, Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы ана-
a
Рис. 1. Динамика изменения веса у мышей, иммунизированных подкожно (а) или внутрикожно (б) F tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5, 15, 45 и 135 КОЕ/мышь.
лизировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD), используя программу Cell QuestPro. Сравнивали количество CD69-позитивных клеток в субпопуляциях CD19+-, CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцитов, не активированных и активированных in vitro КНК.
Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом цитофлюориметрии с использованием красителя CFSE (карбоксифлюоресцеинсукцимидиловый эфир). Окрашивание CFSE проводили до начала культивирования спленоцитов в соответствии с инструкцией производителя (BD e-Bioscince).
Определение уровня цитокинов методом ИФА. Выявле-
ИЛ-4 (пкг/мл)
ИЛ-6 (пкг/мл)
ИЛ-17 (пкг/мл)
ИЛ-10 (пкг/мл)
■ Подкожная
—к— Внутрикожная иммунизация
Рис. 2. Влияние дозы и способа иммунизации мышей штаммом F tularensis 15 НИИЭГ на уровень синтеза провоспалительных (ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-17) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов спленоцитами животных под влиянием КНК in vitro.
- 148 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
а
♦ Контроль —о— 5пк 15пк
45пк —*■— 135пк
♦ Контроль —о— 5вк 1 145вк
--*--5вк —*— 135вк
Рис. 3. Влияние иммунизирующей дозы F. tularensis 15 НИИЭГ на количество антител к КНК в сыворотке крови мышей.
Мыши, иммунизированные подкожно (ПК) (а) и внутрикожно (ВК) (б).
ние ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17 (Bender System) проводили в соответствии с инструкцией производителя.
Статистика. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel 2007.
Результаты. На рис. 1 приведена динамика изменения массы у мышей, иммунизированных подкожно или внутрикожно бактериями F.tularensis 15 НИИЭГ в разных дозах.
Изменение массы является одним из интегральных показателей степени воспаления организма. Сохранение нормальных показателей массы животных при внутрикожном введении бактерий в дозах 5 и 15 КОЕ/мышь свидетельствует об отсутствии значимого воспалительного процесса. При подкожном введении живой туляремийной вакцины независимо от дозы иммунизации у мышей происходило снижение массы и формирование выраженного воспалительного процесса. Среди мышей с выраженным снижением массы наблюдали гибель единичных животных на 6-8-е сутки после иммунизации (по 1 из 5 мышей в группах, иммунизированных по 45 и 135 КОЕ/мышь, независимо от способа введения вакцины).
Основными регуляторами иммунного ответа и воспалительных реакций являются цитокины. У мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной как подкожно, так и внутрикожно, отмечали специфическое усиление синтеза спленоцитами провоспалительных цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и некоторое увеличение количества ИЛ-10 противовоспалительного цитокина под влиянием КНК (рис. 2). У мышей, иммунизированных F.tularensis 15 НИИЭГ подкожно, спле-ноциты в присутствии КНК усиливали также синтез ИЛ-4 и статистически более выраженно синтез ИЛ-6.
Для оценки специфического гуморального иммунитета у животных после иммунизации штаммом F.tularensis 15 НИИЭГ выявляли специфические АТ к туляремийным антигенам в сыворотках крови. Подкожный способ введения живой туляремийной вакцины мышам индуцировал высокую концентрацию специфических АТ в сыворотках у животных, иммунизированных бактериями в дозе 135 КОЕ/мышь, а внутрикожный - в дозах от 15 до 135 КОЕ/мышь (рис. 3). Уровень специфических АТ в сыворотке крови мышей, иммунизированных подкожно в дозе 135 КОЕ/мышь, был существенно выше, чем у мышей, иммунизированных внутрикожно в той же дозе.
Одним из индикаторов наличия специфических клеток памяти к F.tularensis является усиление пролиферативной активности лимфоцитов после их стимуляции туляремий-ным антигеном. Результаты анализа пролиферативной активности лимфоцитов, выделенных из селезенок иммунизированных мышей, показали, что под влиянием КНК достоверно увеличивалась пролиферативная активность лимфоцитов (см. таблицу). Лимфоциты мышей, иммунизированных внутрикожно F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5-15 КОЕ/мышь, проявляли более выраженную пролиферативную активность в присутствии КНК, чем лимфоциты животных, иммунизированных этой же вакциной в тех же дозах подкожно. Максимальный пролиферативный ответ лимфоцитов на КНК независимо от способа иммунизации наблюдали у мышей, иммунизированных F.tularensis
Изменение процентного содержания активированных лимфоцитов, полученных от интактных и иммунизированных живой туляре-мийной вакциной мышей, после инкубирования in vitro с КнК
Доза иммунизации КОЕ/мышь Условия инкубирования Подкожная иммунизация Внутрикожная иммунизация
пролифе- рирующие лимфоциты CD3+ CD4+ CD69+ CD3+ CD8+ CD69+ CD19+ CD69+ пролифе- рирующие лимфоциты CD3+ CD4+ CD69+ CD3+ CD8+ CD19+ CD69+
0 Среда 4,84 ± 0,23 0,7 ± 0,20 0,4± 0,12 0,5 ± 0,02 4,84 ± 0,23 0,7 ± 0,20 0,4± 0,12 0,57± 0,02
Среда + КНК 10 ± 3,56 1,5 ± 0,23 4,1± 0,62 4,5± 0,54 10 ± 3,56 1,5 ± 0,32 4,1± 0,15 4,53± 0,24
5 Среда 7,4 ± 0,36 0,5 ± 0,21 0,5± 0,21 0,6 ± 0,23 5,45 ± 1,25 0,8 ± 0,24 0,6 ± 0,01 0,86 ± 0,25
Среда + КНК 16,84 ± 1,2 2,8 ± 0,15 12,9± 0,2 28,6± 0,89 37,34 ± 3,5 2,9 ± 0,22 15,7 ± 2,1 27,7 ± 2,2
15 Среда 8,2 ± 1,23 0,6 ± 0,02 0,5± 0,02 0,8 ± 0,25 4,47 ± 2,51 0,9 ± 0,02 0,4 ± 0,11 1,4 ± 1,01
Среда + КНК 23,6 ± 3,65 3,6 ± 0,14 21,5± 0,9 36,1 ± 2,5 33,98 ± 4,2 4,7 ± 0,21 21,6 ± 3,2 37,1 ± 5,1
45 Среда 8,4 ± 2,10 0,8 ± 0,12 0,9± 0,02 0,4 ± 0,23 5,89 ± 3,12 1,2 ± 0,12 0,6 ± 0,02 0,98 ± 0,6
Среда + КНК 60,4 ± 8,59 4,1 ± 0,56 23,7 ± 3,1 44,12 ± 5,4 48,25 ± 6,4 4,6 ± 0,98 19,6 ± 2,1 33,32 ± 3,6
135 Среда 5,6 ± 0,98 0,4 ± 0,21 1,3±0,14 0,89±0,12 4,58 ± 3,22 1,2 ± 0,12 1,1 ± 0,25 0,25 ± 0,19
Среда + КНК 46,92± 5,68 4,4 ± 0,24 13,1± 2,2 17,1± 3,51 8,7 ± 1,02 4,6 ± 0,45 17,9 ± 1,25 27,81 ± 1,45
- 149 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014
15 НИИЭГ в дозе 45 КОЕ/мышь. Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных в дозе 135 КОЕ/мышь F.tularensis 15 НИИЭГ, проявляли менее выраженную пролиферативную активность в ответ на КНК. Вероятно, при введении мышам 135 КОЕ/мышь F.tularensis 15 НИИЭГ в организме животных развиваются выраженные воспалительные реакции, которые приводят к иммуносупрессии.
У лимфоцитов, имеющих специфические рецепторы, при контакте с антигенами возбудителя инфекции происходит стимуляция TcR/OcR-рецептора, а затем экспрессия маркера cD69 на поверхности клетки [9]. В спленоцитах, полученных от иммунизированных мышей в отличие от интактных, процентное содержание CD19+CD69+-субпопуляции В-клеток в присутствии КНК достоверно повышалось по сравнению с популяцией лимфоцитов, не активированных КНК (см. таблицу). Максимальную активацию В-клеток отмечали у мышей, иммунизированных в дозах 15 и 45 КОЕ/мышь, хотя максимальные титры АТ к КНК наблюдали после иммунизации животных 135 КОЕ/мышь.
В спленоцитах, полученных от мышей, которых иммунизировали подкожно или внутрикожно F.tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5 или 15 КОЕ/мышь, в присутствии КНК наблюдали увеличение субпопуляции Т-хелперов, экспрессирующих CD69-рецептор (см. таблицу). При увеличении иммунизирующей дозы бактерий уровень клеток с CD69-рецептором не повышался.
КНК F.tularensis индуцировал некоторое усиление экспрессии CD69-рецептора на поверхности цитотоксических лимфоцитов в группах интактных мышей (см. таблицу). Однако активация КНК спленоцитов иммунных мышей приводила к еще более выраженному и достоверному повышению количества CD3+CD8+CD69+-лимфоцитов вне зависимости от дозы препарата по сравнению с таковым у интактных животных. Максимальную активацию цитотоксических лимфоцитов наблюдали в группах мышей, иммунизированных в дозе 15-45 КОЕ/мышь.
Заключение. После внутрикожной иммунизации мышей F.tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь не обнаруживали АТ к КНК в крови животных, но выявляли клеточный ответ на стимуляцию спленоцитов КНК в реакциях in vitro (усиление пролиферативной активности, синтез ИЛ-17, появление CD69-рецептора на поверхности Т- и В-лимфоцитов). Сформированный специфический клеточный иммунитет был способен защитить животных от заражения высоковирулентным штаммом F.tularensis. При низких дозах иммунизации у мы-
шей возникает популяция специфических В-лимфоцитов, активирующихся в присутствии КНК, но не синтезирующих АТ к КНК.
В зависимости от степени воспаления, регистрируемого по уровню падения массы и изменению цитокиновой активности, у мышей наблюдали усиление (при низких дозах иммунизации) или подавление (при дозе 135 КОЕ/мышь) клеточных реакций in vitro на КНК, а уровень гуморального ответа усиливался по мере увеличения иммунизирующей дозы.
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Cowley S.C., Elkins K.L. Immunity to Francisella. Frontiers in Microbial. 2011; 2 (26): 1-20.
2. Eneslatt K., Rietz C., Ryden P., Stoven S., House R.V, Wolfraim L.A. et al. Persistence of cell-mediated immunity three decades after vaccination with the live vaccine strain of Francisella tularensis. Eur. J. Immunol. 2011; 41(4): 974-80.
3. Lee K.R., Zhao X., Austin J., Harris G., Conlan J.W., Chen W. Mouse model of oral infection with virulent type A Francisella tularensis. Infect. andImmun. 2007; 75:1651-60.
4. Conlan J. W., Shen H., Webb A., Perry M. B. Mice vaccinated with the O-antigen of Francisella tularensis LVS lipopolysaccharide conjugated to bovine serum albumin develop varying degrees of protective immunity against systemic or aerosol challenge with virulent type A and type B strains of the pathogen. Vaccine. 2002; 20: 3465-71.
5. Conlan J.W., Chen W., Bosio C.M., Cowley S.C., Elkins K.L. Infection of mice with Francisella as an immunological model. Curr Protoc. Immunol. 2011; 4 (CHAPTER): Unit-19.14.
6. Elkins K.L., Cowley S.C., Bosio C.M. Innate and adaptive immune responses to an intracellular bacterium Francisella tularensis live vaccine strain. Microbes Infect. 2003; 5: 135-42.
7. Green M., Choules G., Rogers D., Titball R.W. Efficacy of the live attenuated Francisella tularensis vaccine (LVS) in a murine model of disease. Vaccine. 2005; 23: 2680-6.
8. Gao J.J., Diesl V, Wittmann T., Morrison D.C., Ryan J.L., Vogel S.N., Follettie M.T. Regulation of gene expression in mouse macrophages stimulated with bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharide. J. Leukoc. Biol. 2002; 72: 1234-45.
9. Clausen J., Vergeiner B., Enk M. Functional significance of the activationassociated receptor CD25 and CD69 on human NK-cells and NKlike Tcells. Immunobiology. 2003; 207 (2): 85-93.
Поступила 21.02.14 Received 21.02.14
- 150 -
