CC BY
92
УДК 581.1
ФОРМИРОВАНИЕ АДАПТАЦИОННЫХ МЕХАНИЗМОВ У ПШЕНИЦЫ И КУКУРУЗЫ К ПОВЫШЕННОМУ СОДЕРЖАНИЮ ЦИНКА
© З. Ф. Рахманкулова *, В. В. Федяев, О. А. Абдуллина, И. Ю. Усманов
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел. +7 (347) 273 12 67.
E-mail: zulfirar@mail.ru
Исследовали влияние токсической концентрации цинка на устойчивость Triticum aestivum L. и Zea mays L. Снижение относительной скорости роста было более выражено у кукурузы. Выявлены дополнительные дыхательные затраты за счет адаптационной составляющей, смена соотношений альтернативных путей дыхательного метаболизма и, как следствие, изменение энергетической эффективности окислительных процессов. Растения пшеницы характеризовались большей эффективностью функционирования антиоксидантной системы. Обсуждаются различные аспекты физиологического воздействия цинка на исследуемые растения.
Ключевые слова: метаболизм, физиологическое воздействие цинка, окислительные процессы.
Соли металлов в окружающей среде являются мощным экологическим фактором, оказывающим влияние на физиолого-биохимические процессы в живых организмах. Цинк, с одной стороны, является одним из основных элементов минерального питания растений, как микроэлемент играет важную роль в обмене веществ, а с другой - относится к тяжелым металлам и в высокой концентрации обладает большой токсичностью [1, 2]. Показано, что цинк - кофактор или стабилизатор многих ферментов [3], участвует в регуляции азотного метаболизма, клеточного деления, фотосинтеза и биосинтеза гормонов [4], играет важную роль в синтезе нуклеиновых кислот и белков [1, 5]. В то же время токсические концентрации цинка подавляют рост [1], ингибируют процесс фотосинтеза, воздействуя на фотосистемы, биосинез хлорофилла, изменяя ультраструктуру хлоропластов [6], вызывают цитогенетические изменения в форме хромосомных аберраций [7].
Общей реакцией живых систем на отклонение условий среды от оптимальных является активизация адаптивных механизмов к изменившимся условиям. Ранее было показано, что для каждого вида растений вырабатываются характерные механизмы устойчивости, представляющие комплекс морфофизиологических и биохимических приспособлений, через которые реализуется адаптивная стратегия [8, 9, 10]. Известно, что от эффективности использования растением материально-энергетических ресурсов зависит успех адаптации растений [11]. Однако оценка энергетической эффективности таких затрат представляет собой сложную задачу [13, 10]. При изменении условий среды может происходить смена соотношений альтернативных путей дыхательного метаболизма [14]. Изменение направления и величины соотношений альтернативных путей дыхательного метаболизма характеризует энергетическую эффективность трат на адаптацию [15]. Вопрос о влиянии избытка цинка на процесс дыхания, его ферментные системы, функциональные и био-
химические составляющие в настоящее время изучен недостаточно.
Одним из главных проявлений токсического действия избытка тяжёлых металлов является окислительный стресс [16]. Усиление образования при стрессе активных форм кислорода (АФК) изменяет активность ферментных антиоксидантных систем [17, 18]. Имеются данные об увеличении степени вовлечённости альтернативной оксидазы в дыхание при стрессе, что препятствует накоплению АФК [14, 19].
Целью данной работы явилось изучение влияния токсических концентраций цинка на особенности формирования адаптации представителями разных видов растений на уровне основных энерготрансформирующих и антиоксидантных процессов.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования были растения пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Симбирка и кукурузы (Zea mays L.) сорта Катерина СВ.
Растения выращивали в условиях водной культуры на светоплощадке: освещенность 15 кЛк, све-топериод 14 часов. Средняя температура воздуха составляла 25±3 °С.
В контрольном варианте растения выращивали на растворе Хогланда-Арнона. В условиях опыта использовали повышенное 1.5-кратное превышение ориентировочно допустимой концентрации (ОДК) Zn (1.2-10-3 M) [20]. Исследования проводили на 14-суточных растениях.
Определение интенсивности суммарного тем-нового дыхания (SR) и его функциональных составляющих проводили манометрическим методом на аппарате Варбурга WA 0110 [21]. Определяли сырую и сухую массу побегов и корней и их относительную скорость роста (RGR) [22]. Рассчитывали: гросс-фотосинтез (Pg, мг О2/раст. сут) [23] - по сумме затрат на дыхание (R, мг О2/раст. сут,) и приросту биомассы (AW, мг/сут); соотношение ды-
* автор, ответственный за переписку
хательных затрат и гроссфотосинтеза (SR/Pg); величину дыхательных затрат на адаптацию (Ra) [10]. Составляющие темнового дыхания растений определяли с использованием специфических ингибиторов: гликолиза - NaF и иодоацетамид, окислительного пентозофосфатного пути (ОПФП) - N-этил-малеимида и Na2B4O7, цитохромоксидазного и циа-нидрезистентного пути - NaN3 и салицилгид-роксамовой кислоты (СГК) соответственно [21].
Содержание цинка в образцах определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре в воздушно-ацетиленовом пламени на аппарате Hitachi 508. При подготовке пробы сухие части растений подвергали озолению в муфельной печи и растворяли в растворе соляной кислоты. Конечная концентрация кислоты не превышала 1 мМ.
При определении активности гваяколперокси-дазы [24] и каталазы [25] предварительно получали гомогенат тканей в экстрагирующем буфера (фосфатный буфер (смесь Серенсена): рН 7.0; 60 тМ), содержавшем 0.1% Triton X-100 и 0.1 мМ ЭДТА. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 10 тыс. об./мин, супернатант использовали для определения активности ферментов.
Определение содержания малонового диальдегида проводили методом, основанным на реакции с тиобарбитуровой кислотой (Малый практикум..., 1990). Каждый опыт проводили в 4-х биологических и 3-х аналитических повторностях. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Excel пакета Microsoft Office.
Результаты и обсуждение
Рост растения является интегральной характеристикой, отражающей степень адаптации растения к условиям окружающей среды [7]. Относительная скорость роста (RGR) является одним из главных критериев экологических адаптивных стратегий, который косвенно отражает комплексную систему устойчивости данного растения к конкретному виду стресса [27].
В оптимальных условиях растения T. aestivum характеризовались меньшей относительной скоростью роста по сравнению с Z. mays, имеющей наибольшее значение RGR, что вероятно обусловлено их принадлежностью к разным типам фотосинтети-ческого метаболизма (С3- и С4-типам соответственно) (рис. 1). При 1.5-кратном превышении ОДК Zn в среде растения Z. mays снизили RGR в 9 раз, T. aestivum - в 4 раза, проявив себя как более устойчивый по сравнению с Z. mays вид к данному типу стресса.
Индекс устойчивости растений T. aestivum имел значение 0.7 ± 0.02, Z. mays - 0.5 ± 0.007. Таким образом, основываясь на данных о процессах роста и особенно на величине аллометрического параметра RGR, исследуемые растения можно расположить по нарастанию устойчивости следующим образом: Z. mays ® T. аestivum.
Т. aestivum Z. mays
Рис. 1 Величина относительной скорости роста (RGR) растений Т. aestivum и Z. mays. В норме (ЕИ) и при воздействии цинка ( ).
Доля суммарных дыхательных затрат от гросс-фотосинтеза независимо от типа фотосинтетиче-ского метаболизма в норме составляла 52-65%, а при стрессе была значительнее у растений, выращенных в условиях повышенного содержания Zn (70-79%) (рис. 2). Известно, что адаптация растений к условиям обитания связана с дополнительными энергетическими затратами, т. е. имеет определенную «дыхательную цену», которая тем больше, чем менее данное растение адаптировано к условиям местообитания [28]. Расчет адаптационных затрат (Ra) позволил оценить долю суммарного дыхания, не связанную с ростом и сильно возрастающую при стрессе [10]. Значения Ra исследуемых видов были примерно одинаковыми и составили 62 и 64% соответственно.
Рис. 2. Соотношение интенсивности дыхания к гросс-фотосинтезу (R/Pg) у растений T. aestivum и Z. mays в норме (1) и под воздействием цинка (2). Ra - адаптационная составляющая дыхания.
Изучение изменения в соотношении путей суммарного темнового дыхания при стрессе с помощью ингибиторного анализа позволяет косвенно судить о доле биохимических составляющих суммарного дыхания и соответственно об энергетической эффективности дыхания растительного организма. Из рис. 3 видно, что в контрольных условиях доля гликолиза варьировалась приблизительно на одном уровне у пшеницы и кукурузы. На цинксодержащей среде соотношение ОПФП: гликолиз смещалось в сторону первого. При стрессе доля суммарных дыхательных затрат от гросс-фотосинтеза возрастала за счет энергетически выгодного цитохромного пути, и особенно сильно это проявлялось у растений пшеницы (рис. 4). Увеличение цитохромного пути при избытке цинка (рис. 4) можно объяснить потребностью в энергии для адаптации при данном стрессе, то есть 1) возможно, в данном случае не происходит насыщения и как следствие торможения основного цитохромного пути интермедиатами [14]; 2) в работе УозЫёа с сотр. (2005) показана корреляция между защитными системами сброса избытка энергетических эквивалентов, а именно при ингибировании альтернативной оксидазы (АО) происходило снижение активности фотосистемы II (ФС II). Также известно об ингибировании ФС II избытком цинка [30]. Таким образом, уменьшение доли альтернативного пути в варианте с пшеницей и кукурузой при избытке Zn (рис. 4), скорее всего, связано с ингибированием ФС II.
Известно, что избыток тяжелых металлов инициирует окислительный стресс в растительном организме [16], вызывая изменения активности энзиматических антиоксидантных защитных систем [17].
Рис. 3. Соотношение величин активности гликолиза (Г) и окислительного пентозофосфатного пути (+ остаточное дыхание) (ОП) у растений T. aestivum и Z. mays в норме (1) и под воздействием цинка (2).
Рис. 4. Соотношение величин активности альтернативного цианидрезистентного (А), цитохромоксидазного (Ц) и остаточного (О) дыхания у растений T. Aestivum и Z. mays в норме (1) и под воздействием цинка (2).
Биохимический анализ исследуемых растений показал различия в работе некоторых ферментных элементов антиокислительной системы растений (пероксидазы и каталазы). В контроле растения T. aestivum характеризовались более высокой пе-роксидазной активностью по сравнению с Z. mays. При избытке в среде цинка активность пероксидазы у растений T. aestivum возросла в 2.4 раза, что компенсировало снижение активности каталазы (табл.) и косвенно свидетельствовало о значительном накоплении АФК. Подобное изменение активности пероксидазы и каталазы объясняется тем, что их функционирование связанно с одним веществом -H2O2, содержание которого контролируют оба фермента [31]. У растений Z. mays не хватало генетического потенциала для формирования защитного механизма от избытка цинка: активность перок-сидазы не изменялась под воздействием цинка, активность каталазы снижалась в 3 раза.
Содержание малонового диальдегида (МДА) свидетельствует о поражении мембранных липидов в результате их перекисного окисления активными формами кислорода. На среде с Zn происходило усиление образования МДА у обеих культур. У растений Z. mays L. наблюдалось более значительное увеличение содержания МДА (в 2.7 раза), которое происходило на фоне низкой активности пероксидазы и каталазы (табл.).
Таблица
Реализация адаптивного поведения растений T. aestivum L. и Z. mays L. на уровне ответа антиоксидантной системы при избытке Zn
Параметр
T. aestivum L.
Z. mays L.
Направление и величина изменения
Активность пероксидазы Активность каталазы Содержание МДА Содержание Zn в побегах / корнях
ф в 2.4 раза ф в 2.4 раза ф в 1.6 раз
ф в 1.09 раза ф в 3 раза ф в 2.7 раза
ф в 5.5 / 2.5 раза ф в 3 / 2.5 раза
Примечание:ф/ф - возрастание / снижение значения параметра
Анализ содержания металла в органах исследуемых растений показал, что значительная часть цинка накапливалась в побегах (табл.), что согласуется с данными других авторов [32]. Chardonnens с сотр. (1999) установили, что Zn-устойчивые экотипы аккумулируют больше цинка, чем менее устойчивые. В наших экспериментах пшеница аккумулировала металл больше, чем кукуруза (табл.).
Проведённые нами исследования по изучению реализации адаптивного поведения среди представителей разных видов растений в условиях избытка цинка выявили определенные закономерности в изменении морфофизиологических и биохимических параметров, которые позволяют оценивать физиологическое состояние растений и прогнозировать их устойчивость к данному виду стресса.
Было выяснено, что для объективной характеристики устойчивости растений в условиях стресса (избытка Zn) может быть использован комплекс морфофизиологических и биохимических параметров (табл.), которые можно разделить на более консервативные, не зависящие от вида растений, типа стресса и изменяющиеся в строго определённом диапазоне, и варьирующие параметры, поливариантность которых предоставляет растительному организму дополнительные возможности при формировании адаптации к стрессовым условиям. К первым относятся RGR, SR/Pg, Ra, ко вторым задействование альтернативных путей в суммарном темновом дыхании и биохимические показатели на уровне ответа антиоксидантной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rout G. R., Das P. // Agronomie. 2003. 23. Р. 3-11.
2. Singh R. P., Bharti N., Kumar G. // Phytochemistry, 1994. V. 35. P. 1153-1156.
3. Hewitt E. J., in: Metal and micronutrients: uptake and utilization by plants., in: Robb D. A., Pierpoint W. S. (Eds.). Academic Press. London. 1983. P. 277-300.
4. Shier W. T. // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1994. 13. Р. 205-216.
5. Ramesh S. A., Shin R., Eine D. J., Schachman D. P. // Plant Physiol. 2003. 133. P. 126-134.
6. Van Assche F., Clijsters H. // in: Sybesta C. (Ed.). Advances in Photosynthesis Research. Part IV. Nijhoff/Junk Publisher. The Hague. 1984. Р. 431-434.
7. Барсукова В. С. // Аналит. обзор (Сер. “Экология”. Вып. 47). СО РАН. ГПНТБ. Ин-т почвоведения и агрохимии. Новосибирск. 1997. -63 с.
8. Grime J. P., Hodsgon J. G., Hunt R. Comparative plant ecology: a functional approach to communities of British sp. L. Unwin Hyman publ. 1988. -892 p.
9. Миркин Б. М., Усманов И. Ю., Наумова Л. Г. // Журн. Общей биологии. 1999. №. 6. С. 67-80.
10. Рахманкулова З. Ф., Рамазанова Г. А., Мустафина А. Р., Усманов. И. Ю. // Физиология растений. 2001. Т. 48. № 5. С. 753-759.
11. Жученко А. А. Адаптивный потенциал культурных растений. Кишинев: Штиинца, 1988. -767 с.
12. Семихатова О. А. // Фотосинтез и продукционный процесс. М., 1988. С. 98-109.
13. Шугаев А. Г. // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 307-320.
14. Рахманкулова З. Ф., Федяев В. В., Подашевка О. А., Усманов. И. Ю. // Физиология растений. 2003. Т. 50. №. 2. С. 231-237.
15. Schuetzenduebel A., Polle A. // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 1351-1365.
16. Erdei S., Hegedus A., Hauptmann G., Szalai J., Horvath G. // Acta Biologica Szegediensis, 2002. V. 46. № 3-4. P. 89-90.
17. Wang H, Shan X-q, Wen B, Zhang S, Wang Z-j. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2004. V. 47. P. 185-192.
18. Maxwell, D. P., Wang, Y., McIntosh, L. // Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A. 1999. V. 96. P. 8271-8276.
19. «Предельно допустимые концентрации (ПДК) и ориентировочно допустимые количества (ОДК) химических веществ в почве». Постановление Госкомсанэпиднадзора РФ от 27.12.94 № 13. ГН 2.1.7.020-94.
20. Семихатова О. А., Чулановская М. В. Манометрические методы изучения дыхания и фотосинтеза растений. М.-Л.: Наука, 1965. -168 c.
21. Бидл К. Л. Анализ роста растений. // Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения / Под. ред. А. Т. Мокроносова, А. Г. Ковалева. М.: Агропромиздат. 1989. С. 54-56.
22. Amthor J. S. // Annals of Botany, 2000. V. 86. P. 1-20.
23. Ермаков А. И., Арасимович В. В., Ярош Н. П., Перуанский Ю. В., Луковникова Г. А., Иконникова М. И. Методы биохимического исследования растений. Под ред. Ермакова А. И. 3-е изд. перераб. и доп. Л.: Агропромиздат. Ленинградское отделение. 1987. С. 430.
24. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. // Лабораторное дело. 1988. №1. С. 16-19.
25. Малый практикум по физиологии растений / Под редакцией академика Мокроносова А. Т. Москва. Из-во МГУ. 1990. С. 184.
26. Усманов И. Ю., Мартынова А. В. // Доклады АН СССР. 1987. Т.297. № 3. С. 754-757.
27. Семихатова О. А. Дыхание поддержания и адаптация растений // Физиология растений. 1995. Т.42. N 2. С. 312-319.
28. Yoshida K., Terashima I., Noguchi K. // Plant Cell Physiol. 2005.
29. Бессонова В. П., Козюкина Ж. Т., Лыженко И. И. // Физиология и биохимия культурных растений, 1990. Т. 22. № 3. C. 220-225.
30. Weckx J. E. J., Clijsters H. M. M. // Physiol. Plant. 1996. V. 96. P. 506-512.
31. Frey B., Keller C., Zierold K., Schulin R. // Plant Cell Environ. 2000. 23. Р. 675-687.
32. Chardonnens A. N., Koevoets P. L. M., van Zanten A., Schat H., Verkleij J. A. C. // Plant Physiol. 1999. 21. Р. 779-785.
Поступила в редакцию 25.02.2008 г.
