CC BY
77
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И IN VIVO ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
Русаков ИГ1 , Соколов ВВ°, Булгакова НН2) , Ульянов Р.В. Теплов А.А. Чиссов В.И. 0 ^Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена; 2)Институт общей физики им. А.М.Прохорова РАН ([email protected])
В данной работе для повышения специфичности флуоресцентной цистоскопии при диагностике поверхностного рака мочевого пузыря с препаратом Аласенс был применен метод локальной флуоресцентной спектроскопии. Показано, что проведение in vivo локальной флуоресцентной спектроскопии объективизирует данные флуоресцентной визуализации уротелия, минимизирует количество ложно-положительной флуоресценции, повышает эффективность флуоресцентного диагностического исследования и позволяет уменьшить количество необходимых биопсий.
Введение. Рак мочевого пузыря (РМП) составляет 70% от всех опухолей мочевого тракта [1]. Более чем у 70-85% больных выявляется поверхностный РМП [2]. Основным методом лечения поверхностного РМП остается трансуретральная резекция (ТУР) с частотой рецидивирования 87-95% (в среднем 91 %) [3]. Рецидивирование заболевания после ТУР обусловлено мультицентричностью поражения слизистой мочевого пузыря, наличием не выявленных до операции скрытых очагов cr in situ и возможностью имплантации опухолевых клеток во время ТУР. В этой связи крайне актуальной проблемой является развитие методов диагностики поверхностного РМП. Значительный прогресс в диагностике поверхностного РМП был достигнут благодаря применению 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) [4]. 5-АЛК является эндогенным соединением, одним из промежуточных продуктов синтеза гема. Ее избыточное введение в организм (или в ткани отдельных органов) приводит к ингибированию последнего этапа синтеза гема и накоплению его предшественника - эндогенного протопорфирина IX (1111IX), преимущественно в опухолевых и воспалительных тканях. Поскольку ПП1Х интенсивно флуоресцирует в красной области спектра с максимумами на 635 нм и 705 нм, результатом его накопления является возможность выявления опухолей по характерной флуоресценции 5-АЛК индуцированного ПП1Х. Данный феномен составляет основу метода 5-АЛК индуцированной фотодинамической диагностики (ФДД) РМП. Как показали клинические исследования, чувствительность метода ФДД достигает более 90% , что намного превышает максимальную чувствительность рутинной цистоскопии (до 50%) [5]. Однако, высокая чувствительность метода сопровождается существенно более низкой специфичностью (50-65%), что снижает его диагностическую точность. Для повышения диагностической точности и специфичности ФДД РМП в данной работе было использовано сочетание флуоресцентной визуализации с локальной флуоресцентной спектроскопией (ЛФС) in vivo. ЛФС проводили в широком спектральном диапазоне при возбуждении в синей и зеленой областях спектра, что позволило регистрировать не только специфическую флуоресценцию 5-АЛК индуцированного ПП1Х, но и аутофлуоресценцию (АФ) нормального и неоплазированного уротелия в широком спектральном диапазоне [6]. Пациенты. Флуоресцентное исследование проводили через 2-3 часа после инстилляции препарата Аласенс, разработанного на основе 5-АЛК в ГНЦ РФ «НИОПИК». В группу входили 44 пациента со злокачественными поражениями МП (тяжелая дисплазия, CIS, первичный и рецидивирующий переходно-клеточный РМП).
Аппаратура для_проведения флуоресцентных исследований Для
флуоресцентной цистоскопии была использована аппаратура производства «Карл Шторц GmbH» (Tuttingem, Germany). Источником возбуждения является ксеноновая лампа, оснащенная фильтрами с характеристиками пропускания (380-
460 нм) соответствующими максимуму возбуждения флюоресценции 1111IX в синей области спектра. Для проведения ЛФС применялась компьютеризованная спектрально-флуоресцентная диагностическая установка «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер»). Для доставки возбуждающего лазерного излучения к поверхности уротелия и регистрируемого излучения флуоресценции - к фотоприемнику использовали совместимый со стандартными эндоскопами Y-образный кольцевой волоконно-оптический катетер. Для возбуждения флуоресценции были использованы две длины лазерного излучения: 442 нм (He-Cd лазер) и 532 нм (твердотельный DPPS лазер). Выходная мощность лазерного излучения с торца волоконного катетера была строго стабилизирована и составляла 5 мВт. Анализ данных ЛФС При указанных выше длинах волн возбуждения регистрируемый спектр флуоресценции ткани является суперпозицией вкладов АФ и 5-АЛК индуцированной флуоресценции 1111IX. Для получения наиболее полной диагностической информации в качестве количественного параметра, характеризующего флуоресценцию уротелия, мы использовали относительный спектрально-флуоресцентный параметр Df, который определяли следующим образом. При Xex=442 нм величину Df рассчитывали как отношение интегральной интенсивности спектра в максимуме флуоресценции индуцированного 1111IX в области 620^650 нм к интегральной интенсивности спектра в области максимума АФ на 480^520 нм. 1ри Xex=532 нм величину Df определяли как отношение интегральной интенсивности в области 620^650 нм к интегральной интенсивности АФ в области 555^585 нм. Отношение величин диагностических параметров, характеризующих различные типы ткани, например, Dj(рак )/ОКнорма), оценивали как флуоресцентный контраст (Кф) очагов рака на фоне нормального уротелия. Методика проведения комбинированного флуоресцентного исследования Методика проведения флуоресцентного исследования состояла в следующем. На первом этапе проводили рутинное цистоскопическое исследование в белом свете. Оценивали состояние уротелия, выявляли наличие патологических участков и подозрительных на рак очагов. На втором этапе источник освещения переключали на синий свет и проводили флуоресцентную визуализацию уротелия, ведя поиск очагов красной флуоресценции 5-АЛК-индуцированного 1111IX. На третьем этапе исследования в очагах красной флуоресценции, выявленных при панорамном обследовании, проводили измерения спектров при контакте торца диагностического катетера и поверхности МЛ. Спектры измеряли в центре флуоресцирующих участков, по их периферии, на расстоянии 1 см от видимой границы зоны красной флуоресценции, а также в участках визуально неизмененного уротелия. В зависимости от размеров флуоресцирующих зон и их количества при каждом обследовании записывалось в среднем 25-30 спектров. Биопсия проводилась из всех очагов красной флуоресценции. ЛФС при Xex=408 нм проведена у 19 пациентов, при Xex=532 нм - у 25.
Результаты 1ри флуоресцентной визуализация поверхности мочевого пузыря через 2-3 часа после инстилляции Аласенса на фоне зеленой АФ нормального уротелия в участках неоплазии, дисплазии, воспаления наблюдается очаговая красная флуоресценция различной степени интенсивности. Количественные измерения методом ЛФС показывают, что при обеих длинах волн возбуждения в спектрах нормального уротелия доминирует АФ, пики флуоресценции 5-АЛК-индуцированного Ш111IX практически отсутствует (рис.1). Напротив, в очагах неоплазии интенсивность АФ низка, но присутствуют интенсивные полосы флуоресценции 1111IX с максимумами на 635 и 705 нм. Необходимо отметить, что особенности АФ нормального и неоплазированного уротелия, а также возможности аутофлуоресцентной диагностики РМ1 подробно исследованы в работе [6], где показано, что при данных длинах волн возбуждения в очагах неоплазии in vivo
регистрируется резкое падение интенсивности АФ. 5-АЛК индуцированный флуоресцентный контраст Кф очагов неоплазии относительно нормального уротелия максимален при Xex=408 нм, его величина варьирует от 10 до 35 (в среднем около 15). При Xex=532 нм флуоресцентный контраст колеблется от 2 до 20
ex: 442 нм
PPIX (635 нм)
Рис.1. In vivo спектры флуоресценции нормального уротелия и CIS МП. В спектре нормального уротелия доминирует АФ (Хмах=510 нм), Df (норма)=0 4. В спектре, измеренном в очаге неоплазии, доминирует флуоресценция I II IIX (Хмах=635 нм,
705 нм), D
f (рак )'
=15.6.
длина волны,нм
0
(в среднем около 6). Проведение ЛФС в очагах неспецифической визуальной флуоресценции (воспаление, умеренная дисплазия, переходно-клеточные папилломы) показывает значительно меньший флуоресцентный контраст Кф этих очагов относительно нормального уротелия (Кф<4 при Xex=408 нм и Кф<2.5 при Xex=532 нм). Для повышения специфичности и минимизации количества ложно-положительной флуоресценции, нами были определены пороговые значения параметра Df, характеризующие следующие три категории: (1) норма, (2) воспаление, включая умеренную дисплазию и (3) неоплазия, включая тяжелую дисплазию, CIS и ПКР. На рис.2 представлены результаты сопоставления величины параметра Df (при Xex=532 нм) с данными морфологического анализа. Исходя из полученных результатов, для каждой длины волны возбуждения были определены максимальные пороговые значения параметра Df, характерные для нормы и воспаления и минимальные пороговые значения, характерные для очагов неоплазии.
24 22 20
■ нормальный уротелий
• папиллома
▲ ПКР
▼ ПКР (2-я опухоль)
♦ Тяжелая дисплазия
воспаление
* Ï
Рис. 2. Распределение величины спектрально-флуоресцентного диагностического параметра Df в соответствии с данными морфологического анализа при Хех=532 нм.
порядковый номер пациента
m in Df г 4
max
D. S 2,5
0
4
s
С учетом выявленных пороговых значений были проведены оценки специфичности и чувствительности комбинированного диагностического исследования, а также оценена общая точность метода. Слученные результаты показали, что применение in vivo ЛФС в ходе флуоресцентной цистоскопии повышает положительную прогностическую величину с 0,67 до 0.94, специфичность возрастает с 70 до 85 %, общая точность метода возрастает с 80 до 86%.
Заключение Доведенные исследования показали, что количественная оценка флуоресценции уротелия по разработанному алгоритму с учетом АФ повышает
специфичность и положительную прогностическую величину ФДД РМП с препаратом Аласенс. Мониторинг диагностического параметра Df в очагах визуальной флуоресценции объективизирует данные флуоресцентной цистоскопии, минимизирует количество ложно-положительной флуоресценции, повышает эффективность флуоресцентного диагностического исследования и позволяет уменьшить количество необходимых биопсий. Полученные результаты позволяют разработать следующие показания для проведения комбинированной флуоресцентной цистоскопии и in vivo ЛФС: дифференциальная диагностики доброкачественных и злокачественных образований уротелия, диагностика первично множественного ПКР МП и раннего рецидива ПКР МП.
1. Злокачественные новообразования в России в 2002 году (заболеваемость и смертность) // Под. ред.Чиссова В.И., Старинского В.В. М., 2004а.
2. Матвеев Б.П., Фигурин К.М., Карякин О.Б. / Рак мочевого пузыря, М., 2001.
3. Русаков И.Г., Быстров А.А. Хирургическое лечение, химио- и иммунотерапия больных поверхностным раком мочевого пузыря: Практическая онкология Т4№-2003г. С.214-224.
4. Русаков И.Г., Соколов В.В., Булгакова Н.Н., Ульянов Р.В., Теплов А.А. Флуоресцентные методы диагностики и поверхностный рак мочевого пузыря: современное состояние проблемы. Урология, 2008, № 3, стр. 67-71.
5. Zaak D, Kriegmair M, Stepp H, Stepp H, Baumgartner R, Oberneder R, et al. Endoscopic detection of transitional cell carcinoma with 5-aminolevulinic acid: results of 1012 fluorescence endoscopies. Urology 2001;57:690-4.
6. Чиссов В.И., Соколов ВВ, Булгакова НН, Ульянов Р.В., Теплов А.А., Русаков И.Г. Исследование лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормального и неоплазированногго уротелия in vivo. Российский онкологический журнал, 2007, №6, стр. 18-24.
