CC BY
54
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДЕТЕКЦИЯ НАНО-КОМЛЕКСОВ АКТИНОМИЦИНОВ СО ШПИЛЕЧНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ И ДНК
Н.Л. Векшин
Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, Московская область, 142290
nvekshin@rambler.ru
Разработан высокочувствительный флуориметрический метод детекции связывания актиномициновых антибиотиков со шпилечными олигонуклеотидами и их доставки в таком виде к ДНК. Найдены характерные времена образования таких нано-комплексов. Полученные результаты дают основание рассматривать олигонуклеотидные шпильки как хорошие переносчики актиномицинов к ДНК опухолевых клеток.
Противоопухолевый антибиотик актиномицин D (АМД) состоит из феноксазонового хромофора и двух пептидо-лактонных колец. Биологическая активность этого антибиотика обусловлена его встраиванием в ДНК, ведущим к ингибированию РНК-полимеразной реакции и клеточного деления. Поскольку АМД плохо проникает в клетки сквозь цитоплазматическую мембрану, сильно налипая на поверхность, то возникает проблема его доставки к клеточной ДНК.
АМД и его флуоресцирующий аналог 7-амино-актиномицин D (7ААМД) могут с высоким сродством (>106 М-1) связываться со шпилечными олигонуклеотидами, например, со шпилькой НР1
d(5'AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3') [1]. В случае 7ААМД это приводит к резкому усилению флуоресценции [2].
Время формирования нано-комплекса между 7ААМД и НР1 составляет всего 0,3 сек (Табл. 1). Причем, АМД и 7ААМД конкурируют за место связывания внутри шпильки: последующее добавление АМД приводит к мгновенному падению флуоресценции 7ААМД, т.е. 7ААМД способен за 0,3 сек замениться в шпильке на АМД [2].
Таблица 1. Быстрая и медленная компоненты связывания 7ААМД и АМД со шпилькой НР1 и с ДНК из фага X.
Раствор: 11 (с) 12 (с) а2/а 1
7ААМД + НР1 0,29 - -
7ААМД/НР1 + АМД 0,31 - -
7ААМД + ДНК 4,6 40 0,3
7ААМД/НР1 + ДНК 4,5 101 1,7
7ААМД/НР1 + №С1 + ДНК 4,9 147 3,5
7ААМД - 1 цМ, НР1 - 2,4 цМ, ДНК - 0,014 мг/мл в 20 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ №С1 (рН 7,5). Хех = 570 нм, Хет = 610 нм. В опытах stopped-flow 7ААМД - 2 цМ, НР1 - 10 цМ, АМД - 10 цМ; Хех = 550 нм, Хет > 570 нм.
Сходная (но гораздо менее выраженная) конкуренция между 7ААМД и АМД наблюдается при их связывании с ДНК (Табл. 2). В отличие от НР1, где есть лишь одно место связывания, в ДНК их много. 7ААМД и АМД находятся внутри ДНК или НР1 в гидрофобном окружении, сходном по физико-химическим свойствам с окружением 7ААМД в пиридине [3]. Встраивание актиномицинов происходит не на поверхности, а в динамической "полости" между двумя цепочками нуклеотидов, но без стэкинга с ними [4-6]. Поэтому актиномицины не являются канцерогенами (в отличие, например, от этидиум бромида).
Таблица 2. Интенсивность флуоресценции 7ААМД в НР1 и разных типах ДНК.
В растворе: F (отн.ед)
НР1 + 7ААМД 2610
НР1 + 7ААМД + 10 цМ АМД 160
Лососевая ДНК + 7ААМД 740
Тимусная ДНК + 7ААМД 560
^ДНК + 7ААМД 505
^ДНК + 7ААМД + 80 цМ АМД 205
Буфер + 7ААМД 130
7ААМД - 1 цМ. ДНК и НР1 - 0,014 мг/мл в 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5). ^ех = 570 нм, ^ет = 610 нм.
Кинетика встраивания 7ААМД или АМД в ДНК имеет бифазный характер [2], наблюдаются быстрая и медленная компоненты: 4,6 и 40 сек (Табл.1). Быстрая имеет в три раза большую амплитуду, чем медленная (а2/а1 = 0,3). Быстрая соответствует связыванию 7ААМД внутри расплетенных мест или петель, а медленная - трудному встраиванию 7ААМД в двойную спираль и в медленно возникающие динамические одноцепочечные участки, которые появляются в ДНК благодаря конформационным флуктуациям. Длительность быстрой компоненты в случае ДНК во много раз больше, чем в случае НР1 (Табл.1). Петли и расплетенные участки ДНК имеют компактную и относительно жесткую структуру, а шпилька НР1 - гибкая, "рыхлая", со свободными концами.
Флуоресценция 7ААМД возрастает при связывании с НР1 гораздо сильнее, чем при связывании с разными видами нативной ДНК (Табл. 2). Тушение нуклеотидами флуоресценции 7ААМD в ДНК происходит намного эффективнее, чем в НР1. Это позволяет наблюдать процесс перераспределения 7ААМД из комплекса с НР1 на ДНК после добавления избытка ДНК к комплексу 7ААМД/НР1 [2]. Медленное "переползание" 7ААМД с НР1 на ДНК наблюдалось после смешивания раствора комплекса 7ААМД/НР1 с избытком ДНК. Процесс "переползания" состоит из быстрой фазы - 4,5 с (она детектировалась на stopped-flow флуориметре) и медленной фазы - 101 сек; соотношение амплитуд а2/а1 = 1,7 (Табл. 1). Две компоненты соответствуют двум типам участков ДНК. Первый тип -это петли и подрасплетенные участки, а второй - нативная двойная спираль и медленно возникающие динамические расплетения. Увеличение ионной силы (50 мМ №С1) приводит к 1,8-кратному уменьшению амплитуды быстрой компоненты.
С помощью флуоресцентной микроскопии исследованы места локализации антибиотика в клеточных структурах после инкубации клеток асцитной карциномы Эрлиха в течение суток со свободным 7ААМД или с комплексом 7ААМД/НР1. Было обнаружено, что в случае свободно добавленного антибиотика он аккумулируется в плазматической мембране клеток. В случае же применения комплекса наблюдается интенсивное тотальное прокрашивание антибиотиком ядерных структур клеток.
Количество погибших клеток (%).
80
60 -
40 -
20 -
0
0 1 2 3 4 5 6
Варианты эксперимента
Рис. 1. Цитотоксическое действие актино-мициновых комплексов на клетки асцитной карциномы Эрлиха. Даны средние значения; разброс <3 %.
Цитотоксическое воздействие актиномициновых комплексов изучалось на клетках карциномы Эрлиха. Добавка АМД в питательную среду вызывала лишь небольшое увеличение гибели клеток по сравнению с контролем (без АМД). Это связано с тем, что АМД плохо проникает внутрь клеток. При инкубации в присутствии комплекса АМД/HPl гибель клеток существенно возрастала (рис.1). При этом цитотоксичность самого HP1 в отношении карциномы была сравнима с цитотоксичностью свободного АМД и не превышала 6% (за вычетом спонтанной гибели клеток в контроле). Итак, HP1 существенно потенцирует действие АМД. Это можно объяснить не только способностью HP1 переносить актиномицины к ДНК, но также высокой плотностью упаковки олигонуклеотида в комплексе с антибиотиком, что создает условия для эффективного переноса через мембраны клетки. Устойчивость комплекса способна обеспечить его прохождение как через плазматическую, так и ядерную мембрану.
Противоположный результат был получен на клетках карциномы для комплекса антибиотика с добавленной ДНК: никакого усиления действия не наблюдалось, напротив, гибель клеток даже несколько уменьшалась (рис. 1). В этих экспериментах использовались комплексы АМД или 7ААМД с тимусной ДНК; концентрация антибиотика составляла 10 мкМ, а концентрация нуклеотидов ДНК -200 мкМ.
1. Векшин Н.Л. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино, Фотон-век, 2006.
2. Vekshin N., Kovalev A. Prompt non-stacking binding of actinomycin D to hairpin oligonucleotide HP1 and slow redistribution from HP1 to DNA. // J. Biochem., 2006, V.140, 185-191.
3. Vekshin N., Savintsev I., Kovalev A., Yelemessov R., Wadkins R. Solvatochromism of the excitation and emission spectra of 7-aminoactinomycin D: implications for drug recognition of DNA secondary structures.// J. Phys. Chem.:B, 2001, v.105, p.8461-8467.
4. Савинцев И. В., Векшин Н. Л. Нестэкинговое связывание 7-амино-актиномицина D и актиномицина D с ДНК и модельными нуклеотидными системами в растворах. // Мол.биол., 2002, т.36, № 4, с.725-730.
5. Савинцев И.В., Векшин Н.Л. Формирование комплексов актиномицинов с ДНК в растворах и пленках // Прикл. биохимия и микробиол., 2004, т.40, N 4, с.421-428.
6. Ковалев А.Э., Яковенко А.А., Векшин Н.Л. Исследование 7-аминоактиномицина и ДНК методом флуоресцентной корреляционной микроскопии. // Биофизика, 2004, т.49, № 6, с.1030-1037.
FLUORESCENCE DETECTION OF NANO-COMPLEXES OF ACTINOMYCINS WITH HAIRPIN OLIGONUCLEOTIDES AND DNA
N.L. Vekshin
Institute of Cell Biophysics, Pushchino, Moscow region, 142290, Russia
High-sensitive fluorimetric method for detection of binding of actinomycin antibiotics with hairpin oligonucleotides and their transport in such view is developed. The formation times for nano-complex are described. The obtained results give basis to consider the oligonucleotide hairpins as good carriers of actinomycins to DNA of cancer cells.
