CC BY
227
0 it & I U в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 10 (126)
УДК 579.24
А.В. Васильева, Н.С. Марквичёв Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. Москва, Россия
ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ГРИБА METARHIZIUM ANISOPLIAE (METSCH.) SOROKIN ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА СРЕДЕ ЧАПЕКА-ДОКСА
Growth dynamics and development physiology of Metarhizium anisopliae (Metsch.) So-rokin on Chapek-Doks solid medium is studied. Two growth phases are allocated. It is found At time of transition from the moment of the beginning of growth of the fungi in a new physiological condition. The given property of culture proves transition to two-level cultivation. At first submerged with the distributed microbiological condition of the microorganism. Further solid state cultivation where the fungi will in regular intervals pass in a new physiological condition in time Ax.
Изучена физиология роста гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin на среде Чапека - Докса. Выделены две фазы роста. Найдена Ат время перехода от момента начала роста гриба из поверхностного мицелия в новое физиологическое состояние - воздушный мицелий. Данное свойство культуры обосновывает переход к двухступенчатому культивированию. Сначала глубинное культивирование с распределенным микробиологическим состоянием микроорганизма. Далее поверхностное культивирование, в котором гриб перейдет в новое физиологическое состояние, споры, за время Ат.
Поверхностное культивирование микроорганизмов имеет большое практическое и научное значение, так как с физиологической точки зрения развития микроорганизмов он наиболее близок к развитию микроорганизмов, находящихся в природных условиях. [1]. В литературе имеется большое количество публикаций, посвященных изучению роста колоний микроорганизмов на агаризованых средах [2, 3, 4, 5]. Одним из общепринятых методов изучения роста колоний является исследование изменения радиуса колоний микроорганизмов во времени [5]. Анаморфный гриб Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin может являться потенциальным продуцентом биопрепаратов для контролирования численности вредных видов беспозвоночных жуков, саранчовых, тлей, термитов, тараканов, личинок комаров, клещей и нематод. [6]
Данная работа посвящена изучению динамики роста и физиологии развития грибаМ anisopliae на агаризованной среде Чапека - Докса.
В опытах использовали штамм энтомопатогенных грибов Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin BKM F-3873 [7]. Штамм обладает энтомопато-генной активностью в отношении личинок саранчи.
Инокулят гриба получали при глубинном культивировании микроорганизма. Культивирование проводили в колбе Эрлейнмейера объемом 0,25 л, содержащей 0,1 л жидкой питательной среды Чапека. Состав стандартной среды Чапека-Докса (в г/л) [8]: глюкоза - 30, KNO3 - 2 , КН2РО4 - 1, MgS04'7H20 - 0,5, NaCI - 0,5, рН - 5-5,2. Режим стерилизации сред составлял 30 минут при давлении 0,5 ати. Засев глубинной культуры проводили со
X U в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. N>10(126)
скошенного агара путем переноса кусочка агара 0,5 X 0,5 см содержащего мицелиальноспоровую массу гриба М. anisopliae выращенного на среде аналогичного состава в колбу со стерильной питательной средой. Колбы помещали на ротационной качалку при скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 34°С в течении бти суток.
Поверхностное культивирование М. anisopliae проводились на чашках Петри на твердой среде Чапека-Докса (описано выше) с добавлением агар-агар в концентрации 17 г/л. Раствор глюкозы 300 г/л готовили и стерилизовали отдельно от минеральных солей среды. Режим стерилизации составляющих среды составлял 30 минут при давлении 0,5 ати. Все компоненты, в необходимых количествах, соединяли непосредственно перед заливом чашек Петри. Концентрация глюкозы задавалась 7г/л. Культивирование проводили при температуре 34°С.
Засев проводили путем укола микробиологической иглой с инокуля-том (инокулят культуральпная жидкость.) в центр чашки Петри. Далее чашки термостатировали при температуре 34 °С
В ходе эксперимента анализировали радиальный рост колонии. Радиус колонии определяли следующим образом - каждые 24 часа измеряли диаметр колонии гриба в двух направлениях под углом 90°, пересечение этих прямых находилось в точке посева. По этим данным рассчитывали радиус. Края колонии на поверхности агара просматривали, непосредственно на чашке Петри в отраженном свете под бинокулярной лупой. Для определения морфо-физиологических характеристик гиф мицелия, конидиеносцев и ко-нидиоспор гриба проводили микроскопирование препарата гриба взятого из чашки Петри методом «раздавленная капля» при увеличении 10X40.
При поверхностном культивировании гриба М. anisopliae сначала от точки роста радиально развивается субстратный мицелий. Он белого цвета дернистый, ветвящийся и в начальном периоде роста на поверхности среды не поднимается. Характер ветвления четко различим под микроскопом, гифы умеренно ветвящиеся, тонкостенные, гладкие. На третьи сутки от центра на поверхность среды поднимается уплотненный, клочковато-ватистый мицелий в массе белого цвета. Данный мицелий отличается от поверхностного мицелия строением, он более разветвленн и не прикреплен к субстрату.
Две зоны роста: первая - тонкий субстратный мицелий слабо разветвленный не плотный, вторая - белый уплотненный клочковато-ватистый мицелий, эти зоны развиваются симбатно, радиально. (развитие этих зон во времени показаны на рисунке 1.)Реверс чашки становится окрашенным в светло оранжевый цвет, колония на обратной стороне обладает радиальной складчивостью, край колонии ровный. К концу четвертых суток во второй зоне роста образуются конидиеносцы гриба, в массе желтого цвета. Кониди-еносцы расположены на мицелии небольшими пучками тесно скученные. На концах образуются фиалиды, расположенные группами. На 5-6 сутки культивирования на фиалидах, образуются конидии одноклеточные цилиндрические прямые или слегка изогнутые с закругленными концами. Далее наблюдается развитие гриба от точки засева по краю первая зона роста субстратный мицелий, в середине вторая зона роста уплотненный мицелий. На вто-
9
О Л 0 X и в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. N010 (126)
рой зоне кольцами образуются конидиеносцы и конидии.
Рис. 1. График зависимости радиуса колонии гриба М. атиорИа от времени для концентрации.
0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
0 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576
время, час
Рис. 2. График изменения скорости роста колонии гриба М. атворИа от времени для концентрации глюкозы 7г/л.
Радиальная скорость роста гриба расчитывалась как тангенс угла наклона кривой роста в разные моменты времени. Построен график зависи-
X Ü в химии и химической технологии. Том XXV. 2011. № 10(126)
мости радиальной скорости роста гриба от времени ( Рис. 2.)
На рисунке 2 видно, что до 4 суток культивирования скорость роста возрастает, что может быть связано с физиологическими особенностями развития гриба. Данный этап аналогичен по своей физиологии развития лаг-фазе глубинного периодического культивирования. На 4-5 сутки скорость роста достигала максимума, далее наблюдался небольшой спад скорости. От 7 до 14 суток гриб рос с постоянной скоростью, этот участок аналогичен экспоненциальной фазе развития при глубинном периодическом культивировании. После 14 суток скорость роста снижается, что может быть вызвано механическими ограничениями роста или изменением состава питательной среды.
Важной характеристикой является показатель Дт от момента начала роста гриба до перехода в новое физиологическое состояние споры. Время перехода по всей колонии составляет от 30 до 50 часов. Данное свойство культуры обосновывает переход к двухступенчатому культивированию. Глубинное культивирование с распределенным микробиологическим состоянием микроорганизма. Далее культуральная жидкость наносится на твердую фазу и через определенное время Дт весь гриб равномерно переходит в новое физиологическое состояние.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации ГК№ 16.М04.11.0016
Библиографический список
1. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 2005. 445 с.
2. A.P.J. Trinci Growth of Wild Type and Spreading Colonial Mutants of Neu-rospora crassa in Batch Culture and on Agar Medium // Arch. Mikrobiol, 1973. 91. P. 113-126.
3. Anthony P.J. Trinci. Kinetics of the Growth of Mycelial Pellets of Aspergillus nidulans.// Arch. Mikrobiol., 1970. 73. P. 353-367.
4. Ir. J. Tramper. Fungal Mats in Solid-State Fermentation. Printed by Ponsen & Looijen BV, Wageningen, The Netherlands, 2005.
5. Перт С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Перт. М.: Мир, 1978. 331 с.
6. Глупов В.В. Патогенны насекомых: структурные и функциональные аспекты / М.: Изд-во Круглый год, 2001. 736 с.
7. Изучение физиологии и морфологии энтомопатогенного гриба Metarhi-zium anisopliae (Metsch.) Sorokin при глубинном культивировании. / A.B. Васильева, Ю.С. Зюзкевич, М.С. Стрельникова, Б.А. Борисов, Н.С. Маркви-чёв.// Биотехнология: Состояние и перспективы развития: Тез. IV Московск. Межд. Конгр. М., 2007.
8. Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений. \ А.Н. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук [и др.]; М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.
