CC BY
221
УДК 577.127:547.973
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ПЛАСТИЧНОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ НА ЮЖНОМ УРАЛЕ
© А. В. Щербаков1*, М. В. Чистякова1, З. Ф. Рахманкулова1, И. Ю. Усманов2
1Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 229 96 14.
E-mail: [email protected] 2Уфимская государственная академия экономики и сервиса Россия, Республика Башкортостан, 450078 г.Уфа, Чернышевского, 145.
Тел.: +7 (347) 252 77 05.
E-mail: [email protected]
В обзоре обобщены современные представления о физиологических механизмах регуляции растениями качественного и количественного состава накапливаемых флавоноидов. Высказывается предположение, что растения Южного Урала, в силу большого разнообразия природных условий этого региона, могут отличаться высоким разнообразием накапливаемых флавоноидов.
Ключевые слова: флавоноиды, биосинтез, механизмы регуляции, пластичность.
Одним из активно изучаемых классов защитных веществ растений являются фенольные соединения. Кроме того, что многие из этих веществ имеют чисто практическое значение, изучение динамики содержания этих веществ вызывает и большой теоретический интерес [1-4]. Однако данные метаболиты имеют очень сложную и малопредсказуемую динамику накопления [5, 6].
Научные исследования по повышению общего содержания фенольных метаболитов и предсказуемости накопления их растениями ведутся по следующим направлениям:
1) изучение эколого-физиологических механизмов регуляции накопления растениями фенольных соединений [7-9].
2) изучение регуляции экспрессии генов соответствующих ферментов [10-13].
3) внедрение в геном чудеродных для данного вида генов, с целью получения трансгенных растений - источников биологически активных соединений, в частности - флавоноидов [13];
4) отработка методик повышения содержания фенольных соединений на каллусных тканях [15, 16].
5) Разработка методов получения трансгенных микроорганизмов- источников флавоноидов, например - Escherichia coli [14, 17].
Значение флавоноидов в жизни растений активно изучается. Обсуждается их участие в защите растений от различного рода стрессов биогенной и абиогенной природы [3, 5-7, 14, 18], участие в ал-лелопатических отношениях [19]. Кроме того, хорошо известно многоплановое участие флавонои-дов в формировании генеративных органов и в процессе опыления растений [20].
Среди компонентов вторичного метаболизма растений флавоноиды являются одними из наиболее многочисленных соединений. В этом они похожи на терпеноиды, хотя распространенность разных классов неодинакова. Однако, в отличие от
терпеноидов, общая схема метаболизма флавоноидов, по мнению некоторых авторов, напоминает скорее сложную метаболическую сеть, нежели некое единое древо [21, 22]. В результате метаболизм флавоноидов и их итоговое распределение по органам растений отличаются чрезвычайной пластичностью, и накопление отдельных метаболитов может иметь независимый характер, на который не влияет, например, количество органов, участвующих в накоплении веществ [23]. Однако при этом устойчиво сохраняются различия в химическом составе между представителями популяций с различными условиями обитания [23, 24]. Среди фла-воноидов можно выделить как редкие соединения, так и вещества, встречающиеся чуть ли не повсеместно. Примером широко распространенной группы веществ являются флавонолы группы квер-цетина. Повсеместное распространение их удобным объектом для изучения пластичности метаболизма флавоноидов у различных растений и влияния на него различных факторов [18, 25].
Пластичность метаболизма флавоноидов может реализовываться у растений через изменение как количественного, так и качественного состава накапливаемых соединений. Возможные механизмы регуляции растениями качественного и количественного состава флавоноидов представлены на табл. 1.
Регуляция растениями количественного состава флавоноидов.
Данный термин подразумевает изменение содержания веществ из некоторого достаточного обширного, но конечного списка. Для флаваноидов этот список охватывает несколько десятков тысяч соединений, среди которых встречаются как повсеместно распространенные, так и видоспецифичные вещества [5]. Известные механизмы, с помощью которых растения могут регулировать количественный состав накапливаемых флавоноидов таковы:
Таблица 1
Возможные механизмы регуляции растениями накопления флавоноидов
Регуляция количественного состава | Регуляция качественного состава
Регуляция экспрессии генома Регуляция экспрессии генома
_ . Активация или ингибирование отдельных ферментных
Регуляция активности ферментных систем
систем
Постсинтетическая регуляция Появление новых генов ?
Постсинтетическая регуляция Регуляция через общие метаболиты Регуляция через низкомлекулярные ресурсы (вода, уклекислота,
ЭМП).
1. Регуляция экспрессии генома. Часть генома растений, ответственная за синтез фенольных соединений, изучена к настоящему времени достаточно подробно [14]. Более того, в литературе уже давно обсуждаются возможные пути эволюции генов соответствующих ферментов у различных таксонов растений в связи с их выходом на сушу и дальнейшим расселением [21, 26]. Изучению возможности регуляции метаболизма флавоноидов через изменение экспрессии генов соответствующих ферментов посвящено в настоящее время подавляющее число научных работ, и только в незначительном количестве публикаций обсуждаются пострансляционные механизмы регуляции [21].
Активно изучается регуляция работы факторов экспрессии генома у плодовых культур, например у винограда (Vitus Vinifera, L). У этой культуры, в частности выявлены генетические механизмы регуляции биосинтеза отдельных групп флавонои-дов - антоцианов и проантоцианидинов [27]. Показано, что через изменение экспрессии генома у винограда регулируется активность 3 важных веществ - ферментов F3'H и F3'5'H (флавонон-3'-гидроксилазы и флавонон и 3'5' гидроксилазы) и цитохрома Ь5 [22]. В частности установлено, что ген, кодирующий F3'H, начинает экспрессироваться еще до цветения, а после цветения работают уже все три гена. Последнее обстоятельство как раз и необходимо для синтеза всего списка проантоцианидинов и далее антоцианов в плодах [22].
На других видах показано, что одним из основных генетических механизмов обеспечения пластичности синтеза является дупликация соответствующих генов, в частности кодирующих такой важный для биосинтеза флавоноидов фермент, как халконсинтазу (наригненин-халкон-синтазу,
CHS). Установлено, что у многих видов (в частности у фасоли и петунии) имеется 8 и более генов, кодирующих халкон-синтазу ( ^-генов), а у риса их количество достигает 20. Это обстоятельство позволило разбить chs-гены на отдельные функционально различающиеся ветви (семейства) и даже провести на них филогенетические исследования [28].
Имеются данные о том, что на экспрессию генов ключевых ферментов влияют как сами фенольные метаболиты, так и другие внешние и внутренние факторы. В целом считается, что активность
генов, кодирующих ферменты метаболизма флаво-ноидов, определяется освещением [4], но на отдельных культурах выявлено участие в регуляции экспресии этих генов и других факторов. В частности, на растениях чая (Camellia sinensis (L.) в работах Singh [29] было показано, что на активность гена флаванон-3'-гидроксилазы (ключевого фермента, превращающего нарингенин в дигидро-кемпферол) отрицательно влияют следующие факторы:
1) уменьшение доступной влаги. Данные сведения в некоторой степени перекликаются с результатами других авторов [18, 30], в работах которых для некоторых видов бобовых была показана зависимость содержания флавоноидов от соответствия режима влажности предковой экологии вида.
2) обработка абсцизовой кислотой и гибберел-линами. В работах других авторов также можно встретить данные о сложном взаимном влиянии фитогормонов и флавоноидов, в силу того, что последние тоже могут обладать рострегулирующей активностью. Результаты такого взаимодействия могут быть различны: аддитивный эффект, синергизм или взаимное ингибирование [31].
3) возрастание концентрации экзогенных ка-техинов. Катехины синезируются путем поэтапно -го восстановления дигидрофлавонолов. В силу высокой физиологической активности этих соединений, изучение их метаболизма и взаимосвязи его с другими классами флавоноидов представляет большой научый интерес [б].
Положительно же на активность флаванон-3'-гидроксилазы влияют механические повреждения [29].
2. Регуляция активности ферментных систем. Ферменты, осуществляющие биосинтез фла-воноидов и предшествующих им фенольных соединений, в-целом, установлены, и регуляция их активности различными факторами активно изучается (табл. 2). Более того, определены перспективные виды растений и их органы, на которых удобнее всего изучать тот, или иной фермент [3]. Активно изучаются и механизмы регуляции активности ферментов.
В частности, выявлена важная регуляторная роль в биосинтезе флавоноидов некоторых аминокислот. Например, установлено что фермент ароге-нат-дегидратаза, превращающий L- арогеновую
кислоту в Ь-фенилаланин, активируется Ь-тирозином и ингибируется Ь-фенилаланином. Также установлено, что Ь-тирозин, Ь-фенилаланин и Ь-триптофан могут стимулировать или подавлять активность и других ферментов шикиматного пути [10]. Также показана значимость для метаболизма флавоноидов ферментов, относящихся к цитохро-мам Р450 [14]. При этом установлено, что важнейшие ключевые ферменты (в частности - халкон-синтаза, халкон-изомераза и дигидрофлаванол-4-редуктаза) функционируют и регулируются не по отдельности, а в виде ассоциированного с эндо-плазматическим ретикулумом макромолекулярного комплекса [11, 32].
Также активно изучается и транспорт флаво-ноидов, в частности - транспортные белки [33].
3. Постсинтетическая модификация. В эту группу входят механизмы как не связанные с изменением химической структуры уже готового соединения, так и связанные. К последним следует отнести: гликозилирование - дегликозилирование, ацилирование,, метилирование, полимеризация, образование коньюгатов с другими специализированными метаболитами и образование галогениро-ванных форм.
К модификации свойств молекул флавонои-дов, непосредственно не связанной с изменением химической структуры, можно отнести регулирование растениями цвета антоцианов в лепестках цветков через рН вакуолярного сока. Это явление описано у некоторых цветковых растений, например, петунии и заключается в том, что вакуолярный сок клеток лепестков растением принудительно при помощи протонных насосов тонопласта поддерживается в более закисленном состоянии, чем цитоплазма, что в результате и приводит к красной окраске антоцианов. Нарушение же этого баланса приводит к появлению синей составляющей в цвете [21, 34].
Гликозилирование и декликозилирование. Считается, что большое разнообразие флавоноидов обусловлено способностью их молекул образовывать многочисленные, сравнительно легко расщепляемые гликозиды. По своей природе это чаще всего О-гликозилированные производные, которых, для такого широко распространенного флавонола, как кверцетин, известно уже около 200 соединений, а для других флавоноидов - и более этого количества [6]. В то же время установлено, что процесс гликозилирования может пойти и в обратную сторону, например, в том случае, если входящие в состав гликозидов углеводы будут востребованы для других целей, например, как субстраты дыхания, осмотики, или криопротекторы, что было показано,
например, на рододендроне [35]. В целом считается, что вариабельность состава гликозидных соединений гораздо выше, чем состава агликонов и находится в зависимости от объема вида, его ареала, внутривидового полиморфизма. Установлено, что вариабельность отдельных классов гликозидов не одинакова - С-гликозилфлаваноиды обнаруживают большую пластичность, чем 3-О-гликозиды. При этом межвидовое варьирование состава гликозидов флавоноидов превосходит их внутривидовую вариабельность [36].
Ацилирование. В качестве радикалов, ацили-рующих базовые структуры молекул флавоноидов чаще всего встречаются остатки оксикоричных и оксибензойных кислот, уксусной,малоновой, янтарной, галловой. Установлено, что ацилирование молекул флавоноидов галловой кислотой и образование моно- и дигаллатов значительно повышает антиоксидантные свойства молекул [6]. Кроме того, известны примеры ацилирования молекул фла-воноидов серной кислотой, в результате чего синтезируются их многочисленные сульфопроизвод-ные [37].
Полимеризация. В растениях известно большое количество димерных форм флавоноидов, имеющих С-С и С-О-С связи между мономерными фрагментами.
Более полимеризованные формы флавонои-дов, называемые флаволанами или конденсированными дубильными веществами, представлены, главным образом, олиго- и полимерами катехино-вой и флаван-3-4 диоловой природы, хотя известны и олигомерные формы антоцианов (аллунопразин).
Образование коньюгатов с другими специализированными метаболитами.
Известны флавоноидные алкалоиды, типа фи-цина и терпеноидные флавоноиды например- фис-тигматины [37]. Сами фенольные соединения тоже часто могут образовывать коньюгаты друг с другом. Например в состав флаван-3-олов черного чая (теафлавинов) входят моно - и диэфиры галловой кислоты, имеющие, как было сказано ранее, гораздо более высокую антирадикальную активнось, чем флавоноиды [6].
Образование галогенированных форм. Данный механизм модификации базовой структуры для высших растений, очевидно, не характерен. Однако известно, что из некоторых видов лишайников, грибов и микроорганизмов выделены хлорзаме-щенные производные флавоноидов [37]
Общая схема участия наиболее важных ферментов и метаболитов в биосинтезе основных классов флавоноидов представлена на рис. 1 (цитируется по 8сЫДеп [20], с дополнениями).
Рис. 1 Ключевые метаболиты и ферменты биосинтеза флавоноидов.
Условные обозначения: Ферменты: 1 - ФАЛ
(фенилаланин-аммоний-лиаза, 4.3.1.24), 2 -
циннамат-4-гидроксилаза (1.14.13.11); 3- 4-
кумарат- коэнзим-А-лигаза (6.2.1.12); 4- STS, стильбен-синтаза (2.3.1.146); 5 - CHS, нарингенин-халкон-синтаза (2.3.1.74); 6- халкон-3-гидроксилаза (1.14.13.-); 7 -халкон- изомеразы I, II и III (5.5.1.6); 8 - IFS, изофлавон-синтазы - две альтернативные гипотетических группы ферментов, второй путь метаболизма; 9 - FNS (I и II), флавон-синтаза, на-рингенин^АБКкислородная оксидоредуктаза (1.14.11.22); 10 - F3H, флаванон-3-Р-гидроксилаза, нарингенин-2-оксиглутарат: кислородная оксидо-редуктаза (1.14.11.9); 11 - дигидрокверцетин-диоксигеназа (1.14.11.23); 12 - F3'H, флавонон-3'-гидроксилаза (1.14.13.21); 13 - дигидрокемпферол-диоксигеназа (1.14.11.23); 14 - флавонон-3'-5' гид-роксилаза, дигидрокемпферол, NADH:кислородная оксидоредуктаза (1.14.13.88); 15 - дигидромирице-тин-диоксигеназа (1.14.11.23). Метаболиты: 1) L-фенилаланин; 2) транс-коричная к-та; 3) 4-
кумаровая к-та 4) P-кумароил-коэнзим-А; 5) дигидрокемпферол; 6) дигидрокверцетин; 7) кверцетин; 8) кемпфелол; 9) дигидромирицетин; 10) мирице-тин и его производные; 11) цианидин; 12) пеллар-гонидин; 13) дельфинидин
4. Регуляция через общие метаболиты. Установлено, что пути метаболизма флавоноидов на всем своем протяжении очень тесно связаны с основным метаболизмом через вещества, характерные и для основного метаболизма. Так, известно, что подавляющее большинство фенольных соединений образуется из эритрозо-4-фосфата, являющегося промежуточным продуктом пентозофосфатно-го пути по метаболическому пути, называемому шикиматным. Этот путь объединяет в себе не только образование фенольных соединений, но и синтез ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана [38, 39]. Этот процесс катализируется ключевым ферментом вторичного метаболизма - фенилаланин-аммоний-лиазой (ФАЛ). Именно ФАЛ является своеобразной «развилкой» между первичным и вторичным метаболизмами.
Кроме того известно, что биосинтез флавонои-дов невозможен без использования веществ-макроэргов - АТФ и NADPH [2, 6, 37, 39]. Важнейшую роль в метаболизме флавонидов играет Ацетил СоА и его производные, выступая в качестве строительного материала при биосинтезе у флавоноидов кольца В. Также установлено, что на последних стадиях биосинтеза некоторых флавонолов, например кверцетина, в качестве вспомогательного метаболита используется а-кето-глутаровая кислота [40]. И наконец, связь между основным метаболизмом и метаболизмом флавоноидов становится наиболее тесной на последних этапах их биосинтеза- этапах образования соответствующих гликозидов, которые составляют подавляющее большинство от перечня этих соединений [6].
Регуляция растениями качественного состава флавоноидов.
Под изменениями в качественном составе подразумевается появление или исчезновение отдельных соединений или целых классов веществ. Применительно к способности растений регулировать качественный состав накапливаемых соединений выявлены следующие особенности:
1) Теоретических ограничений у списка синтезируемых растениями метаболитов очень немного. Но для большинства классов метаболитов справедливо правило - теоретически возможное количество различных вариантов их молекул на много порядков превышает реально выявленное [6].
2) Все вышесказанное справедливо, применительно и к специализированным метаболитам. Самыми пластичными классами, очевидно, следует считать терпеноиды, фенольные соединения и гли-козиды - обширные классы веществ, насчитывающие по несколько десятков тысяч соединений, среди которых выявлены и уникальные и повсеместно встречающиеся. Например, известное к настоящему времени число одних только флавоноидных соединений не поддается точной оценке, но составляет несколько десятков тысяч соединений. В то же время подсчитано, что теоретически возможное количество этих соединений исчисляется миллионами [6], и существуют многочисленные примеры, когда у отдельных видов растений биосинтез фенольных соединений кардинально меняется. Причиной изменения состава накапливаемых соединений и одним из эффективных механизмов влияния на эти изменения может быть серьезное вмешательство в экспрессию растительного генома.
3) Показано, что внутри каждого вида растений различия химического состава могут быть значительными, являясь следствием как индивидуальных различий, так и различий в экологических условиях. Это может привести к образованию «химических таксонов и рас», которые будут различаться между собой по химическому составу, но такая химическая дифференциация не будет коррелировать с дифференциацией по морфологическим признакам [36].
Таким образом, регуляция растениями в естественных условиях обитания качественного состава флавоноидов в принципе возможна. Растения при этом могут задействовать следующие основные регуляторные механизмы: 1. модификацию экс-
прессии генома, 2. кардинальную перестройку работы ферментных систем.
Модификация экспрессии генома. В некоторых работах было показано, что когда у трансгенных растений арабидопсиса (АтаЫйор818 1ЪаИапа, Ь.), был заблокирован ген фермента НСТ (шики-мат-О-гидроксициннамоил-трансферазы, 2.3.1.133), являющегося ключевым в биосинтезе лигнина, это привело к перераспределению метаболических потоков в сторону синтеза флавоноидов через усиление активности альтернативного фермента - хал-
кон-синтазы (CHS, 2.3.1.74). В результате в растениях значительно возросло содержание некоторых флавонолов, антоцианов и их производных [41]. Другими исследователями при работе с мутантными формами арабидопсиса было показано показано регулирующее действие на гены халконсинтазы и других ферментов следующих факторов: цитоки-нинов, криптохрома-1, фитохрома-А, низких температур, причем в работе высказано предположение, что регуляция осуществляется через некий общий для этих ферментов механизм [42].
Аналогичным образом показана возможность регулирования биосинтеза антоцианов в созревающих плодах клубники [13]. Другие исследователи [43] изучили возможность управления фенольным метаболизмом густоцветной сосны (Pinus densiflora, Liou.) путем регулирования экспрессии генов, кодирующих стиль-бен-синтазу (STS) и халкон-синтазу (CHS), рис. 2:
Таким образом, установлено, что биосинтез основных классов флавоноидов проходит через стадию образования молекулы P-кумароила-коэнзима А. Воздействие на эту молекулу различных ферментов инициирует в дальнейшем биосинтез различных классов фенольных соединений (рис. 1, 2):
1) Стильбен-синтазы (STS) - биосинтез рез-вератрола и далее -стильбенов;
2) Шикимат-О-гидроксициннамоил-
трансферазы (HCT) - биосинтез Р-кумарил-
шикимата и далее- лигнина;
3) Халкон-синтазы (CHS) - биосинтез нариг-ненин-халкона и далее- флавоноидов;
4) Халкон-редуктазы (CHR1) - образование изолитиквиритигенина - непосредственного предшественника биосинтеза изофлавоноидов по первому пути (второй путь проходит через стадии образования нарингенин-халкона и нарингенина).
PAL C4H
Фенилаланин Коричная
-►кислота
Р-кумаровая кисло та
I
Основной
ф енилпропаноидный путь
R= H - циннамоил С оА R= OH - р-кумароил СоА
STS 3 Х CHS
малонил СоА
4 СоА SH +4 CO2
4 СоА SH +3 CO2
R= H -пиносильвин R= OH - резвератр ол
Стильбеноиды
R= H -пиноцембрин халкон R= OH - нарингенин халкон
Флавоноиды
R
OH O
Рис. 2. Участие в метаболизме фенольных соединений стильбен- и халкон-синтаз (по Kodan. et.al., 2002). Обозначения ферментов: PAL - фенилаланин-аммоний-лиаза; C4H - циннамат-4-гидроксилаза; STS -стильбен-синтаза; CHS-халкон-синтаза.
Интересными перспективным и, возможно, ключевым для модификации метаболизма фенольных соединений ферментом является также цинна-моил-СоА-редуктаза (cinnamoyl-CoA reductase (CCR). Этот фермент участвует в начальных стадиях формирования мономеров лигнина. Показано, что блокирование экспрессии соответствующих этому ферменту генов у мутантных форм томатов (Solanum lycopersicum, Rick.) привело к значительному возрастанию в листьях и стеблях растворимых форм фенольных соединений, что положительно сказалось на антиоксидантных свойствах
экстрактов плодов. При этом значительно возросло содержание хлорогеновой кислоты и рутина. Кроме того, были идентифицированы новые, не характерные для исходных форм соединения, в частности кемпферол-рутинозид [44].
Работа ферментных систем и возможности ее перестройки Важнейшими ферментами, определяющими направление биосинтеза на образование либо фла-воноидов, либо изофлавоноидов, являются халкон-изомеразы. В настоящий момент известно 3 типа этих ферментов. Считается, что первый тип (халкон-
изомераза I) распространен в растениях повсеместно, а второй (халкон-изомераза II) вероятно, характерен только для бобовых растений [45]. Выявлено, что специфические особенности действия этого дополнительного фермента позволяют ему превращать изоликвиритигенин в ликвиритигенин. В результате этого у бобовых растений появляется дополнительный вариант модификации базовой структуры молекул флавоноидов - ликвиритигенин, который, является предсшественником большого количества фла-воноидных соединений - изофлавоноидов. Третий тип халкон-изомеразы был выделен также из бобового растения- солодки щетинистой (Glycyrrhiza echinata, L.) [46]. Про этот тип ферментов известно, что они могут воздействовать на оба типа субстрата (нарингенин-халкон и изоликвиритигенин), обладая при этом наименьшей активностью среди всех трех известных типов этих ферментов [46].
Участие халкон-изомераз и других ферментов в биосинтезе отдельных классов флавоноидов представлено на рис. 3 (цитируется по Ralston, [45]).
Таким образом, у большинства растений после образования единого предшественника - наринге-нин-халкона, на последующих этапах биосинтез флавоноидов и родственных им соединений в целом можно представить в виде некой метаболической сети, представленной на рис. 4 (цитируется по Bogs, [22], с дополнениями). Установлено, что одни и те же ферменты способны функционировать с различными веществами, катализируя в целом некий стандартный набор биохимических реакций:
1) Флавон-синтазы (FNS) может использовать в качестве субстратов различные типы флаванонов
- пентагидроксифлаванон, нарингенин и эриодик-тиол, превращая их в соответствующие флавоны.
2) Флаванон 3'- и флаванон 3'-5' гидроксилазы и F3'5'H соответственно) способны присоединять гидроксильные остатки к кольцу В у молекул флаванонов и дигидрофлаванолов.
3) Флавонон-3-Р гидроксилаза ^3Щ способна функционировать с несколькими типами флавоно-нов, гидроксилируя их в положении 3 и превращая в дигидрофлавонолы.
4) Флавонол-синтаза (FLS) осуществляет биосинтез различных флавонолов из дигидрофлавоно-лов, образуя двойную связь между атомами углерода, находящимися в положении 2 и 3 и т.д.
Таким образом, биосинтез одного и того же фла-воноида в растениях может осуществляться несколькими альтернативными путями, что, очевидно и является основой высокой пластичности их состава.
Как следует из представленных данных, кроме халкон-изомераз, изоэнзимы нескольких типов известны и у флавон-синтаз. Фермент первого типа выделен пока только некоторых представителей семейства сельдерейных (Аріасеае), второй же считается распространенным почти повсеместно [47] Кроме того, установлено, что изоэнзимы характерны и для ферментов, функционирующих на начальных этапах биосинтеза фенольных соединений, например-хоризмат-мутаз [10].
Современные представления о ферментах, осуществляющих биосинтез флавоноидов, и с помощью которых растение может регулировать их качественный состав, приведены в табл. 2.
Рис. 3. Роль ферментов в образовании базовых молекул флавоноидов.
Рис. 4. Роль ферментов в образовании основных классов флавоноидов. Примечание: CHI - халкон-изомеразы I, II и III; FNS - флавон-синтазы I и II, F3'5'H - флавонон-3'-5' гидроксилаза; F3'H- флаванон-3'-гидроксилаза; F3H - флавонон-3-p гидро-ксилаза; FLS- флавонол-синтаза (дигидрофлавонол-диоксигеназа); DFR - дигидрофлавонол-4-редуктаза; LDOX - лейкоан-тоцианидин-синтаза; LAR - лейкоантоцианидин-редуктаза; ANR- антоцианидин-редуктаза; UFGT - UDP-флавонол-3-О-глюкозил-трансфераза (антоцианидин-3-О-глюкозил-трансферазы).
Таблица 2
Ферменты путей метаболизма основных классов флавоноидов
№ Название фермента, синонимы Шифр Осуществляемые реакции Особенности реакции, регуляция
1 2 3 4 5
1 CHS, нарингенин-халкон-синтаза, 2 формы 2.3.1.74 Р-кумарил-СоА нарингенин-халкон: ХХ^с°А - о он о Для реакции необходимы 3 Н+, выделяется 3 молекулы СО2 Сродство к различным типам субстра-тов зависит от рН
2 CHI, халкон-изоме-разы I, II и III. II и III характерны только для бобовых 5.5.1.б Халкон-измераза I: нарингенин-халкон нарингенин: "Ж^^он - он о он о Халкон-измераза II: изоликви-ритигенин ликвиритигенин но^ .он на ^о. //'“\\ ^бТ °н - ^)Г 'тО_ он о о Оптимальными для реакции являются значения рН 8-8,5. Реакция ингибируется многими флавоноидами
3 F3'5'H- флавонон-3'-5' гидроксилаза 1.14.13.88 Добавление 2 гидроксильных групп к В-кольцу. Результат: превращение нарингенина в пентагидроксифла-вон, а дигидрокепмферола в дигидромирицетин: он лзт -А: Необходимы КЛЭРЫ и кислород
4 F3'H- флаванон-3'-гидроксилаза 1.14.13.21 Добавление 1 гидроксильной группы к В-кольцу. Результат: превращение нарингенина в эриодиктиол, дигццрокепмферола в дигидро-кверцетин.: он Необходимы КЛЭРЫ, кисло-род и Н+
5 F3H, флаванон-3-p- гидроксилаза, нарингенин-2- оксиглутарат: кислородная оксидоредуктаза 1.14.11.9 Превращение флаванонов во флаванонолы (дигидрофлавонолы): нарингенина в дигидрокемпферол, эриодиктиола в дигидрокверцетин и т.д.: но^ ^ ,о_ А”\\ н^ он он он о он о он Необходимы кислород и а-кетоглутаровая кислота
б IFS, изофлавон-синтазы, 2 альтернативных пути, не все ферменты выявлены Превращение нарингенина в изофлавоноиды но^ ^,о. /АчХ w;r^°н - тфр-о-о» он о он о
7 РКБ, флавон-синта-зы I и II, наринге-нин, КЛЭИ: кисло-родные оксидоре -дуктазы 1.14.11.22 Превращение флаванонов во флаво-ны: эриодиктиола в лютеолин, нарингенина- в апигенин и т.д.: УУ)_"О_0Ы - ^лГ ОЫ ОЫ О ОЫ О Необходимы кислород и а-кетоглутаровая кислота
8 РЬБ- флавонол-синтазы, дигидрофлавонол -диоксигеназы 1.14.11.23 Превращение дигидрофлавонолов во флавонолы: ХОТ - У\Э/ОЫ ОЫ О ОЫ О ОЫ Необходимы кислород и а-кетоглутаровая кислота
9 ЭР* - дигидрофла-вонол-4-редуктазы, транс-дигидрофла-вонол-редуктазы 1.1.1.219 Превращение дигидрофлавонолов во флаван 3-4 диолы: "^^Ьоы - ЫО^У^ОЫ 1 ^ ОЫ ОЫ 1тт оы о ОЫ Необходим КЛЭРЫ
10 ЬЭОХ-антоциа-нидин- синтазы, лейкопеларгонидин- диоксигеназы 1.14.11.- Превращение флаван 3-4 диолов в антоцианидины: я Л^ОН я Н0^/\/0^^1Д^ ^0Ы ТОГ' - ОЫ ОЫ Оы Необходимы кислород, Н+ и а-кето-глутаровая кислота
11 ЬЛЯ- лейкоанто-цианидин-редуктазы, флаван 3,4 диол-редктаза 1.3.1.77 Восстановление лейкоантоциани-динов до катехинов: я * .X ОЫ X. .оы их\ [Т)Х +3но о ЧЙОГ^' - XXI ОЫ ОЫ Необходим КЛЭРЫ
12 ЛК*-антоцианидин- редуктазы Превращение антоцианидинов в катехины ^ОИ ^Х0Н на а XX Х^* - ххх * ^^-^он он он ОН Г ипотетические ферменты
13 БРОТ - БЭР-флавонол- 3-О-глюкозил- трансферазы 2.4.1.115 Превращение антоцианидинов в антоцианы, гликозилирование. * * 1он 1^0Н на ^ ,а на о ДСЗТ ХХХ^*- ххх^* ОН ООЬс ОН ОН Источником глюкозы служит уридилдифосфат
14 Флавонол-3-О глюкозил-Ь- трансферазы 2.4.1.91 Перенос глюкозы с уридилдифосфата на агликоны флавонолов. Механизм действия аналогичен БРОТ Источником глюкозы служит уридилдифосфат
15 Флавонол-3-О глюкозил-Ь-р амнозил-трансферазы 2.4.1.159 Перенос рамнозы с уридилдифосфата на глюкозиды флавонолов. Механизм действия аналогичен БРОТ Источником рамнозы служит уридилдифосфат
Таким образом, высокое разнообразие синтезируемых агликонов флавоноидов является результатом действия на начальных этапах сравнительно небольшого списка ферментов, осуществляющих некие стандартные операции с похожими субстратами. В дальнейшем список возможных соединений расширяется в ходе дальнейшей модификации этих соединений: гликозилирования, образование эфиров (например, галлатов), димеризации, присоединения гетероатомов и т.д.
Растительный организм отличается поливариантностью действий при решении адаптационных задач [б, 48]. Поэтому следует ожидать, что в регионах с высокой мозаичностью условий растения будут накапливать большое разнообразие флаво-ноидов и родственных им соединений. Перспективными с этой точки зрения являются горные районы Южного Урала и Башкирское Зауралье, где на сравнительно небольшой территории условия жизни растений могут различаться кардинально [48, 49]. Поскольку считается, что максимальное содержание лекарственных соединений должно наблюдаться в тех почвенно-климатических условиях, к которым растения приспосабливались в течение многих сотен и тысяч поколений, есть основания полагать, что растения именно Южного Урала и Башкирского Зауралья могут служить источниками большого разнообразия ценных флавоноидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nijveldt R. J., et.al. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Am J Clin Nutr 2001; 74: pp.418-425.
2. Winkel-Shirley B. Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology Plant Physiology. June 2001, Vol. 12б, pp. 485-493.
3. Winkel-Shirley B. It Takes a Garden. How Work on Diverse Plant Species Has Contributed to an Understanding of Flavon-oid Metabolism. Plant Physiology, December 2001, Vol. 127, pp. 1399-1404.
4. Buer C.S. et.al. Flavonoids are differentially taken up and transported long distances in Arabidopsis. Plant Physiology, October 2007, Vol. 145, pp. 478-490.
5. Высочина Г.И. Фенольные соединения в систематика и филогении семейства гречишных. - Новосибирск: Наука, 2004. - 240 с.
6. Тюкавкина Н.А. и др. Органическая химия. Спец курс в 2 кн. Кн.2. М.: Дрофа, 2008.-592 с.: илл.
7. Носов А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений.-1994.- Т.41, №б.- С.873-878.
8. Lavola A., Accumulation of flavonoids and related compounds in birch induced by UV-B irradiance.- Tree Physiol-ogy.1998. 18, pp.53-58.
9. Рудиковская Е.Г. и др. Динамика накопления фенольных соединений в корнях гороха при взаимодействии с симбиотическими бактериями Rhizobium leguminosarum.// Физиология растений.-2010.- Т.57, №2.- С.2бб-272.
10. Eberhard J,et al. Cytosolic and plastidic chorismate mutase isozymes from Arabidopsis thaliana: molecular characterization and enzymatic properties. Plant J. 199б Nov;10(5): pp.815-821.
11. Burbulis I.E., Winkel-Shirley B. Interactions among enzymes of the Arabidopsis.-PNAS, October 2б, 1999, vol. 9б № 22, рр. 12929-12934.
12. Adams, R. P., Ram N. Pandey, Jerry W. Leverenz, Norman Dignard, Kenneth Hoegh and Thor Thorfinnsson. 2003. Pan-
Arctic variation in Juniperus communis: Historical Biogeography based on DNA fingerprinting. BSE 31: pp.181-192.
13. Griesser M., et.al. Redirection of Flavonoid Biosynthesis through the down regulation of an antocyanidin Glucosyltrans-ferase in Ripening Strawberry Fruit. Plant Physiology, April 2008, Vol. 146, pp. 1528-1539.
14. Dixon R.A., Pasinetti G.M. Flavonoids and Isoflavonoids: From Plant Biology to Agriculture and Neuroscience.- Plant Physiology, October 2010, Vol. 154, pp. 453-457.
15. Загоскина Н.В. И др. Образование фенольных соединений и фотосинтетический электронный транспорт в каллусных культурах чайного растения, подвергнутых действию УФ-В радиации. / Материалы VI Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», 13-17 июня 2005. Москва - Пущино, т. 3. С. 293-297.
16. Николаева Т.Н., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения под действием 2,4-Д и НУК.// Физиология растений,Т.56, № 1, 2009.- С.53-58.
17. Effendi L.,et al. Engineering Central Metabolic Pathways for High-Level Flavonoid Production in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, June 2007, Vol. 73, No. 12. pp. 3877-3886.
18. Полякова Л.В., Ершова Э.А. Изменчивость фенольных соединений у некоторых травянистых и древесных растений от межпопуляционного до внутрииндивидуального (эндогенного) уровня.// Химия растительного сырья. 2000. №1. С. 121-129.
19. Будкевич Т.А. и др. Фенольный статус и аллелопатиче-ская активность почвы в ризосфере агроценозов многолетних трав различного видового состава и режима использования. / Материалы YII международного симпозиума по фенольным соединениям, Москва, 19-23 октября 2009 г., М.- Изд-во Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, 2009. С. 38-39.
20. Schijlen GW.M.,et.al. RNA Interference Silencing of Chal-cone Synthase, the First Step in the Flavonoid Biosynthesis Pathway, Leads to Parthenocarpic Tomato Fruits.- Plant Physiology, July 2007, Vol. 144, pp. 1520-1530.
21. Grotewold E. The science of flavonoids. USA, Springer Sci-ence+Business Media, 2006.-274 р.
22. Bogs J.,et.al. Identification of the Flavonoid Hydroxylases from Grapevine and Their Regulation during Fruit Development. -Plant Physiology, January 2006, Vol. 140, pp. 279-291
23. Щербаков А.В. и др. Вариабельность содержания вторичных метаболитов у Juniperus sabina L. в условиях Южного Урала.// Уфа, Башкирский химический журнал, 2009.Том 16 №2., С. 132-138.
24. Щербаков А. В., Бускунова Г.Г., Аминева А. А., Иванов С. П, Усманов И.Ю Вариабельность содержания вторичных метаболитов у Achillea nobilis L. в условиях Южного Урала.// Известия Самарского научного центра РАН, 2009 Т
11, № 1 С. 198-204.
25. Щербаков А.В. и др. Влияние меди на накопление флаво-нолов группы кверцетина растениями можжевельника казацкого в условиях Башкирского Зауралья. / Материалы YII международного симпозиума по фенольным соединениям, Москва, 19-23 октября 2009 г., М.- Изд-во Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, 2009 С.288-289.
26. Stafford H.A., Flavonoid evolution: an enzymic approach.-Plant Physiol. (1991) 96, pp.680-685.
27. Hichri I, et al. The Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor MYC1 Is Involved in the Regulation of the Flavonoid Biosynthesis Pathway in Grapevine. J. Mol Plant, May 2010; v 3: pp.509 - 523.
28. Хан И.И. и др. Дупликация и дивергенция генов халкон-синтазы риса.// Физиология растений.- 2009.- Т.56, № 3, С. 460-465.
29. Singh K., et. al. An early gene of the flavonoid pathway, fla-vanone 3-hydroxylase, exhibits a positive relationship with the concentration of catechins in tea (Camellia sinensis).- Tree Physiology, 2008 V. 28, pp. 1349-1356.
30. Gouyon P.H.,Vernet Ph., Guillerm J.L., Valdeyron G. Polymorphisms and environment: the adaptive value of the oil polymorphisms in Thymus vulgaris L. // Heredity. 1986. Vol. 57. Part 1. pp. 59-66.
31. Волынец А.П. Росторегулирующая активность фенольных коньюгатов./ Материалы YII международного симпозиума по фенольным соединениям, Москва, 19-23 октября 2009 г., М.- Изд-во Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, 2009. С.61-62.
32. Wagner G.J., Hrazdina G. Endoplasmic reticulum as site of phenylpropanoid and Flavonoid metabolism in Hippeastrum.-Plant.physiol.,1984,v.74, pp.901-906.
33. Thompson,et.al., An Arabidopsis flavonoid transporter is required for anther dehiscence and pollen development. Journal of Experimental Botany, 2010,Vol. 61, No. 2, pp. 439-451.
34. Maeshima, M. Tonoplast transporters: organization and function, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,2001, V. 52: 469-497.
35. Антонюк Т.М. и др. Флавоноиды, как биомаркеры абиотического стресса на примере представителей рода Rhododendron L. / Материалы YII международного симпозиума по фенольным соединениям, Москва, 19-23 октября 2009 г., М.- Изд-во Института физиологии растений им К. А. Тимирязева РАН, 2009. С. -20-21.
36. Высочина Г.И. Проблемы изменчивости в хемотаксоно-
мических исследованиях растений.// Сибирский
ботанический вестник, 2007, Т. 2, Вып.1, С 101-110.
37. Корулькин Д.Ю. Природные флавоноиды.- Новосибирск:
Академическое изд-во «Гео», 2007.- 232 с.
38. Lister CA., Lancaster J.A. Phenylalanine Ammonia-lyase (PAL) Activity and its Relationship to Anthocyanin and Fla-vonoid Levels in New Zealand-grown Apple Cultivars. -J. Amer. Soc. Hort. Sci.,1996,v 121: pp. 281-285.
39. Медведев С.С. Физиология растений. Изд-во СПбГУ. СПб. 2004. 335 c.
40. Lukacin R, еt.al. Flavonol synthase from Citrus unshiu is a bifunctional dioxygenase.- Phytochemistry. 2003 Feb;62(3): pp.287-92.
41. Besseau S. et al, Flavonoid Accumulation in Arabidopsis Repressed in Lignin Synthesis Affects Auxin Transport and Plant Growth. The Plant Cell, January 2007.,Vol. 19: pp.148-162.
42. Wade H.K., et al. Arabidopsis ICX1 Is a Negative Regulator of Several Pathways Regulating Flavonoid Biosynthesis Genes. Plant Physiology, February 2003, Vol. 131, pp. 707715.
43. Kodan A, Hiroyuki K., Fikumi S. A stilbene synthase from Japanese red pine (Pinus densiflora): Implications for phytoalexin accumulation and down-regulation of flavonoid biosynthesis. PNAS publishers, March, 2002 vol. 99, № 5, pp. 3335-3339.
44. Van der Rest B., et. al., Down-regulation of cinnamoyl-CoA reductase in tomato (Solanum lycopersicum L.) induces dramatic changes in soluble phenolic pools.- J. of Experimental Botany, 2006. Vol. 57, No. 6, pp. 1399-1411.
45. Ralston L, et.al., Partial reconstruction of flavanoid and isof-lavanoid biosynthesis in yeast using soybean type I and type II chalcone isomerases.-Plant physiology, 2005,vol. 137, pp.1375-1388.
46. Kimura Y, Aoki T, Ayabe S. Chalcone isomerase isozymes with different substrate specificities towards 6'-hydroxy- and 6'-deoxychalcones in cultured cells of Glycyrrhiza echinata, a leguminous plant producing 5-deoxyflavonoids.- Plant Cell Physiol. 2001 0ct;42(10): pp.-1169-1173.
47. Gerbhardt Y.H., Witte S., Steuber H., Matern U., Martens S. Evolution of Flavone Synthase I from Parsley Flavanone 3b-Hydroxylase by Site-Directed Mutagenesis.// Plant Physiology, July 2007, Vol. 144, pp. 1442-1454.
48. Усманов И. Ю., Баширова Р.М., Янтурин С.И. Новые лекарственные вещества растительного происхождения: биология и перспектива поиска на Южном Урале.// Вестник АН РБ 2000. Т 5 № 4, С. 33-39.
49. Усманов И, Нафиков А., Прочухан Ю., Лекарственные
растения: перспективы создания импортзамещающих
произдводств./Экономика и управление, Уфа, изд-во БАГСУ. 2000.- С 55-59.
Поступила в редакцию 14.10.2011 г. После доработки - 13.12.2011 г.
