CC BY
44
Известия Тульского государственного университета
Естественные науки 2008. Выпуск 2. С. 216-225
ХИМИЯ -----
УДК 581.13; 581.167
Е.Н. Музафаров. Д. Эдвардс, М. А. Чепурнова
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино , Вашингтонский университет, Пуллман, Вашингтон, США,
Тульский государственный университет
СОСТОЯНИЕ ФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА В РАСТЕНИЯХ АРАБИДОПСИСА ПРИ ДЕЙСТВИИ
УФ-РАДИАЦИИ
Аннотация. Исследовали действие различных доз УФ-В радиации на количественный и качественный состав фенольного комплекса в растениях ара-бидопсиса Arabidopsis thaliana L. дикого типа и мутантов tt4 и tt5, дефицитных по ферментам халкон-синтаза и халкон-изомераза соответственно. Показано, что при облучении дозой УФ-В иррадиации до 2,11 кДж/м2 день в растениях Арабидопсиса дикого типа уменьшается соотношение между окси-коричными кислотами и флавоноидами, в растениях мутанта 11 1 обнаружено четыре основных производных синаповой кислоты, в растениях мутанта tt5 появляется большая группа минорных соединений, отличающихся структурой от оксикоричных кислот.
Важность исследований по действию ультрафиолетового света на растения, особенно сельскохозяйственные, не имеющих механизмов адаптации к УФ, связана с приспособлением новых сортов и видов к коротковолновому диапазону естественного освещения[1]. Адаптация к УФ-составляющей солнечного спектра, выработанная в процессе эволюции, зависит от состава пигментов, ряда вторичных метаболитов и эффективности системы фоторепарации, и может быть использована при сравнительно низких дозах облучения даже для стимуляции потенциала растения. Одним из наиболее общих ответов растительных проростков к УФ-свету является транскрипционная активация генов биосинтеза флавоноидов[2]. Флавоноиды обладают свойством поглощать УФ и накапливаться в основном после УФ-индукции в эпидермальных клетках, указывая тем самым, что они функционируют как защитный экран [3]. Хорошей моделью для изучения ответа растения
на коротковолновую радиацию могут служить мутантные формы араби-допсиса. Интересны два последовательных мутанта - tt 1 - мутант по гену халкон-спнтазы и tt5 - мутант по гену халкон-изомеразы, - в этих моделях отсутствует или значительно заторможен синтез флавоноидных структур
[4].
В настоящей работе исследовали действие двух доз ультрафиолета В на состояние фенольного комплекса в растениях арабидопсиса (Lansberg erecta) дикого типа и мутантов (transparent testa) tt 4 и tt5.
Растения выращивали в климатических камерах при температуре 2123 °С и влажности 60-70 % на 14-часовом фотопериоде в присутствии ультрафиолета В или без него. В первой камере ультрафиолет полностью отсекался фильтрами, во второй - доза УФ-Б составляла 1,37 кДж/м2д и в третьей - 2,11 кДж/м2д. В качестве фильтров в различных вариантах использовали полиэфирную (спектр пропускания от 350 нм) и целлюлозоацетатную (спектр пропускания от 300 нм) пленки или в отдельных случаях их сочетание. Целлюлозоацетатная пленка убирала малые количества УФ-C. генерируемые лампой FS40. Полиэфирная пленка защищала растения от УФ-В. Плотность фотосинтетического потока составляла 230 мкмоль фочопов ,м2с. При УФ-В обработке использовали флуоресцентные лампы Westinghouse FS40 (Candela Corp/Santa Ana, California, U.S.A.) и флуоресцентные лампы Agrolux. Освещенность белого света измеряли с помощью фотонного датчика Li-Cor LI-185, (Li-Cor Instr.Corp., Lincoln, Nebraska, U.S.A.), а ультрафиолетовую составляющую измеряли спектрорадиометром Optronics Model OL754 при пике поглощения 310 нм. В экспериментах использовали листья 30-дневных растений.
К свежесрезанным листьям, 0,5-1,0 г, добавляли 4 мл 70 % метанола плюс 5 % уксусной кислоты и измельчали в гомогенизаторе при 20000 об .мин в течение 40 с. Гомогенат экстрагировали 2 часа при комнатной температуре (22-24 °С) и далее центрифугировали при 14000 х g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переливали в контрольную пробирку и добавляли 1 мл хлороформа для удаления липидов и пигментов. После последующего удаления хлороформа и дополнительного центрифугирования (1 lOOOxg в течение 5 мин) отбирали 10 мкл пробы для внесения в инжектор HPLC-анализатора.
Хроматографию высокого давления (HPLC-анализ) проводили на анализаторе Shimadzu LC-4A, при комнатной температуре на обратимой колонке Econosil С18, 10 мкм, 250мм х 4,6 мм (Alltech). уравновешенной дистиллированной водой (pH 4,5). Для анализа вносили 10 мкл экстракта (А) или (Б). Пробы элюировались со скоростью 1,0 мл/мин. с увеличением концентрации смеси ацетонитрил-уксусная кислота (9,5:0,5) , pH 3,5. Применяли линейный градиент - 10 мин. от 0 % до 7 %, 30 мин. от 7 % до 20 %, 10 мин.
от 20 % до 25 %. Окончание анализа на 50-й минуте. Элюат контролировали при 280 нм. Спектры поглощения анализировали на спектрофотометре DW-2 UV/VIS с операционной системой OLIS Spectroscopy Operating system (Version 14.09). В качестве контрольных образцов использовали п-кумаровую, кофейную, феруловую, си па новую кислоты (Sigma), а также флаван, апигенин, физетин, морин, кемпферол, кверцетин (Sigma) и рутин (Serva).
Типичной характеристикой растений арабидопсиса является высокий уровень производных синаповой кислоты, который изменяется в зависимости от внешних условий. Уровень синапоил-производных тесно связан с биосинтезом веществ флавоноидной структуры. При усилении синтеза флавоноидов соотношение производных синаповой кислоты и флавоноидов уменьшается. В основном этот тезис относится к растениям дикого типа. Судя по литературным данным, [6,7], мутантные растения не должны содержать веществ с флавоноидной структурой. Однако, наши результаты показали, что, тем не менее, 5-7 % общего фенольного комплекса из листового экстракта tt 1 и tt5 мутантов арабидопсиса может быть представлено веществами флавоноидной структуры и соединениями близкими к ней. В метанольном экстракте свежесрезанных листьев растений арабидопсиса дикого типа в условиях отсутствия УФ-Б света содержание фенольных соединений было несколько ниже чем в мутантных растениях (рис. 1). Разница составляла от 8 % по сравнению с мутантом tt 5 до 33 % с мутантным растением tt 4. Первый уровень УФ-В радиации увеличивает биосинтез фенольных веществ примерно на 20-30 % для всех трех типов растений. Вторая доза ультрафиолета, 2,11 кДж/м2д, почти в полтора раза и более увеличивает содержание фенольного комплекса в листьях. Наиболее значительная разница проявляется в растениях мутанта tt 5 (до 178 %), хотя абсолютное количество фенольных веществ больше в мутанте tt 4.
Рис. 1. Содержание фенольного комплекса в листьях арабидоисиса трех типов в мкг/г сухого веса. Справа показаны дозы УФ-В света в кДж/м2д
Содержание флавоноидов и соединений, определяемых с помощью А1С1з [8], в растениях дикого типа значительно выше, чем в мутантных растениях и составляет в условиях отсутствия ультрафиолета 6,8 % от общего пула фенольных веществ, в то время как в мутантных растениях оно в пределах 3 %. При выращивании растений, облучаемых УФ-Б светом дозой 1,37 кДж/м2д, содержание флавоноидов повышается в два раза у растений дикого типа. Незначительно повышается уровень этих веществ и в мутантных растениях.
□ О
■1,
□ 2,
□ о
□ 1,37 ■ 2,11
Рис. 2. Содержание флавоноидов в листьях арабидопсиса трех типов в мкг/г сухого веса. Справа показаны дозы УФ-света в кДж/м2д
Другая доза облучения 2,11 кДж/м2д приводит к дальнейшему увеличению флавоноидных и близких к ним по структуре соединений. Для сравнения можно отметить, что, если в растениях дикого типа доля флавоноидов возрастает от 8 % без УФ-света до 19 % в условиях максимальной дозы облучения, то для мутантных растений 4 эта доля составила от 2 % до 4,5 %, а для и 5 от 3 % до 7 %. Мы проанализировали экстракты всех вариантов листьев растений на НРЬС-хроматографе с целью выяснения, какие компоненты фенольного комплекса наиболее активно синтезируются в условиях ультрафиолета.
На рис. 3 показаны НРIX1-профили экстракта из листьев растений ара-бидопсиса дикого типа и спектры поглощения некоторых индивидуальных веществ. В условиях отсутствия УФ-Б излучения основные вещества в суммарном экстракте представлены пиками 2 и 5, спектры поглощения которых расшифровываются как оксикоричной кислоты, а также пик 7, и относящийся к флавоноидам. По мере увеличения дозы ультрафиолета высота пиков 2 и 5 сохраняется, но и увеличивается содержание других веществ, выраженных пиками 3,4,6,7. Предварительная идентификация веществ, проведенная стандартными методами , показала, что вещества из пиков 3,4,6,7 относятся к группе флавоноидов [6]. Причем все четыре соединения имеют два максимума в спектре поглощения в области 260-270 нм (кольцо В) и 335-340 нм (кольцо А). Ранее сообщалось, что в листьях арабидопсиса методом флуоресценции обнаружены производные кверцетина [10]. В другой работе из экстракта листьев арабидопсиса был выделен рамнозид кемпфе-рола [11], и, наконец, также выделено соединение по своим характеристика аналогичное кемпферолу [7]. Как показал спектр поглощения веществ из пиков 2 и 5 они имеют максимум поглощения при 320 нм, что характеризует эти вещества как производные си па повой кислоты. В соответствии с работами /12,7/ можно предположить, что этими производными являются О-синапоил-Ь-малат и 1-0-синапоил-Ь-глюкоза. Пик 8, появляющийся на последней стадии элюции имеет максимумы 270, 315 и 528 нм, что характерно для антоцианов. Предварительный анализ этого вещества указывает на возможность синтеза гликозидированного производного пеларгонидина [13]. В листьях растений дикого типа увеличение дозы ультрафиолета приводит к изменению соотношения между оксикоричными кислотами и фла-воноидами. Особенно это заметно для пиков 5 и 7.
5 7
П? .100 375 450 525 600 0 6 1.2 ]3 2Л 30 36 42 4Я
НМ Бр=>.М; >ШК
Рис. 3. Спектры поглощения индивидуальных веществ (А) и НРЬС-профили метанольного экстракта (Б) из свежесрезанных листьев 30-дневных растений дикого типа арабидопсиса. Интенсивность света составляла 250 мкмоль е/м2с. Отмеченные справа НРЬС-профили показывают количество фенольного вещества эквивалентное 25 мкг синаповой кислоты на грамм сухого веса листовой ткани (указана масштабная линейка). В левой части рисунка представлены спектры поглощения индивидуальных веществ. В углу правой части рисунка
показана доза ультрафиолета-Б
На рис. 4 приведены НРЬС-профили метанольного экстракта из листьев растений мутанта 114 и спектры поглощения некоторых индивидуальных веществ. Четыре пика 2,3,4, и 5 идентифицированы как производные синаповой кислоты, имеющие в своем спектре поглощения основной максимум при 320 нм. Следует отметить, что феруловая кислота имеет такой же спектр поглощения, как и синаповая, поэтому не следует отвергать возможность появления эфиров феруловой кислоты в экстракте листьев мутанта И 4. При увеличении дозы УФ-Б иррадиации содержание производных синаповой кислоты возрастает и вместе с тем увеличивается доля других фенольных веществ, возможно, флавоноидной структуры, например, пики 6 и 7 , структура которых в данном варианте не идентифицирована.
Рис. 4. Спектры поглощения индивидуальных веществ (А) и НРЬС-профили метанольного экстракта (Б) из свежесрезанных листьев 30-дневных мутантных (114) растений арабидопсиса. Остальные показатели такие же, как на рис. 3
НРЬС-профили метанольного экстракта из листьев растений Арабидопсиса мутанта И5 несколько напоминают профили экстракта И4 (рис.4). Также в условиях отсутствия ультрафиолета наиболее выражены пики 3 и 5 с максимумами в спектре поглощения 320 нм.. При максимальной дозе УФ-Б появляется ряд минорных соединений, структура которых отличается от оксикоричных кислот. Из них пики 4,6 и 7 имеют по два максимума в спектре поглощения и предполагают наличие в их структуре двух бензольных колец. Тем более, что в данном мутанте открыт путь для синтеза халконов. Следует отметить, что минорные соединения в экстракте листьев мутанта И 4 и мутанта И 5 отличаются по спектрам поглощения.
Рис. 5. Спектры поглощения индивидуальных веществ (А) и НРЬС-профили метанольного экстракта (Б) из свежесрезанных листьев 30-дневных мутантных (115) растений арабидопсиса. Остальные показатели такие же, как на рис. 4
Как уже отмечалось, основным метаболическим признаком растений арабидопсиса является значительное содержание эфиров синаповой кислоты. По нашим расчетам в растениях дикого типа, выросших при повышенной дозе ультрафиолета-В, доля флавоноидов возрастает до 30 % от общего содержания фенольных веществ в метанольном экстракте листьев. Тем не менее, масштабная линейка на рисунках показывает, что количество производных синаповой кислоты также возрастает при действии УФ-Б радиации и они составляют основу фенольного комплекса в мутантах арабидопсиса (рис. 1). По другим данным показано, что в растениях мутанта И 4 уровень синапоил-эфиров на 30-60Е% выше, чем в растениях дикого типа [10]. Несомненно, что два эфира синаповой кислоты являются общими в биосинтезе фенилпропаноидов как для растений дикого типа, так и для мутантных растений. Особенно это заметно в вариантах без ультрафиолета. Литературные
данные показывают, что основными компонентами голубой флуоресценции метанольного экстракта листьев и проростков тканей арабидопсиса являются эфиры си па повой кислоты: 2-О-синапоил-малат, 1-0-синапоил-глюкоза и синапоил-холин [12].
Рассматривая каждый тип растений арабидопсиса в отдельности, следует отметить, что в диком типе представлен полный фенольный комплекс, который включает в себя эфиры синаповой кислоты, флавоноиды и минорные фенольные соединения. В состав флавоноидов входят гликозидирован-ные производные кемпферола и кверцетина, а также антоцианы. Идентифицировано одно из соединений флавоноидного ряда как кемпферол-3,7-ди-рамнозид [8]. Оранжевая флуоресценция обнаруженная в проростках дикого типа предполагала наличие высоких концентраций производных кверцетина [9]. Следует ожидать, что в число антоцианов входят гликозидирован-ные производные пеларгонидина и цианидина [10].
Фенольный комплекс мутанта 114 в основном представлен эфирами синаповой кислоты. Поскольку спектр поглощения ферул о вой кислоты аналогичен спектру синаповой кислоты, то возможно присутствие в экстракте листьев и эфиров феруловой кислоты. Определенную долю вносят также минорные соединения, структура которых в данной работе не идентифицировалась.
Наконец, метанольный экстракт листьев мутанта 115 также содержит два основных эфира синаповой кислоты и группу минорных веществ, среди которых появляются представители группы хал конов и дигидрохал конов.
В соответствии с нашими расчетами на белом свету в отсутствие УФ количество веществ флавоноидной структуры составляет 7-8 % от общего содержания фенолов у растений всех трех типов. Дикий тип растений облученных дозой 2,11 кДж/м2д увеличивает уровень флавоноидов до 15-20 %, что, тем не менее, не может быть определяющим фактором ни при подавлении ростовых процессов, ни при защите от УФ-радиации. В данном случае флавоноиды выступают как компонент общего фенольного комплекса, где основные функции несут эфиры синаповой кислоты и ряд минорных соединений. В процессе биосинтеза халкона с участием хал ко11-си 1 пазы к числу минорных веществ можно отнести соединения, имеющие в своей структуре два фенольных кольца, типа дигидропиропа или стирилпирона [11]. Было обнаружено, что проростки арабидопсиса содержат катехоловые структуры, которые теоретически являются более эффективными антиоксидантами и весьма редки в растительном сообществе [12].
Таким образом, действие слабого, но постоянно действующего ультрафиолета вызывает повышенный синтез флавоноидов и оксикоричных кислот, а также ряд других веществ, которые участвуют в структурообразовании
клеточных мембран и одновременно выполняют функции защитного экрана от УФ-радиации.
Библиографический список
1. Caldwell М.М. Effects of increased solar ultraviolet radiation on terrestrial plants/ M.M. Caldwell, A.H. Teramura, M. Tevini, J.F.Bornman, , L.O. Bjornand, G. Kulandaivelu // Am-bio. -1995. -V 24. -№ 3. -P.166-173.
2. Murphy T.M. Membranes as targets of ultraviolet radiation/ T.M. Murphy // Physiol., Plant arum. -1983. -V. 58. -P. 381-388.
3. Tevini M. The protective functions of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation/ M.Tevini, J. Braun, G. Fiesser // Photochem. Photobiol. -1991. -V. 53. -P. 329-333.
4. Landry L.G. Arabidopsis Mutant Lacking Phenolic Sunscreens Exhibit Enhanced Ultraviolet-B Injury and Oxidative Damage/ L.G.Landry, C.C.S.Chappie, R.L.Last // Plant Physiol. -1995. -V. 109. -P. 1159-1166.
5. Li et al. Arabidopsis Flavonoid Mutants are Hypersensitive to UV-B Irradiation / Li J., T-M. Ou-Lee, R.Raba, R. Amundson, R.L. Last // The Plant Cell. -1993. -V. 5. -P. 71-179.
6. Markham K.R. Techniques of Flavonoid Identification / K.R. Markham. -London: Academic Press, 1982. -P.15-51.
7. Sheahan J.J. Flavonoid-Specific Staining of Arabidopsis thaliana/ J.J. Sheahan, G.A. Rechnits, J.J. Sheahan, G.A. Rechnits // BioTechniques. -1992. -V. 13. -P. 880-883.
8. Lois R. Severe sensitivity to ultraviolet radiation in an Arabidopsis mutant deficient in flavonoid accumulation. II. Mechanisms of UV-Resistance in Arabidopsis / R. Lois, B.B. Buchanan // Planta. -1994. -V. 194. -P. 504-509.
9. Chappie C.C.S. An Arabidopsis Mutant in the General Phenolpropanoid Pathway/ C.C.S. Chappie, T. Vogt, D.E. Ellis, C.R. Somerville // The Plant Cell. -1992. -V. 4. -P. 1413-1424.
10. Abrahams S. Identification and Biochemical Characterization of Mutants in the Proan-thocyanidin Pathway in Arabidopsis/ S.Abrahams, G.J.Tanner, P.J.Larkin, A.R.Ashton // Plant Physiology. -2002. -V. 130. -P. 561-576.
11. Eber J. Biosynthesis / J. Eber, K. Halbrook // The Flavonoids: Advances in Research Eds. Harborn J.B., a. Mabry T.J. -1982. -P. 641-680.
12. Sheahan J.J. Sinapate Esters Provide Greater UV-B Attenuation Than Flavonoids in Arabidopsis thaliana (Brassicaceae)/ J.J Sheahan, J.J. Sheahan // American Journal of Botany. -1996. -V. 83. -P. 679-686.
Поступило 20.07.2008
