CC BY
65УДК 541(49+64):532.73
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ РАСТВОРИМЫХ ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ (обзор)
©1994 г. В. А. Кабанов
Московский государственный университет им. М.В Ломоносова 119899 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 05.10.93 г.
Интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) образуются в результате кооперативных реакций соединения противоположно заряженных полиинов. Растворимые нестехнометрические ИПЭК, образованные полиионами, различающимися степенью полимеризации (контурной длиной), в разбавленных растворах могут рассматриваться как своеобразные амфифильные блок-сополимеры. В обзоре рассмотрены важнейшие свойства растворимых ИПЭК, в частности их способность участвовать в реакциях полиионного обмена и замещения, влияние концентрации и природы низкомолекулярных противоионов, а также степени полимеризации взаимодействующих полиинов на кинетику этих интерполиэлектролитных реакций и положение равновесия. Описанные свойства и явления диспропорционирования, происходящие при изменении рН и ионной силы, могут быть использованы для конструирования систем фермент/ИПЭК, каталитическая активность которых регулируется с помощью интерполиэлектролитных реакций, для создания высокоэффективных псевдогомогенных иммунодиагносгических систем, "мягких" антагонистов гепарина и других перспективных биомедицинских применений.
Интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) составляют особый класс полимерных веществ [1 - 4], образующихся в результате соединения противоположно заряженных полиэлектролитов или матричной полимеризации ионизирующихся мономеров на противоположно заряженных по-лиионах. Простейший способ получения ИПЭК -смешение водных растворов, один из которых содержит полианионный, а другой - поликатион-ный компонент
(>А-Ь+)„ +(>-В+а")и (I)
[(Н-+В<), (>А- Ь+)„ -х '()-В+а")т _+ хаГ +дЬ+.
Степень превращения 0, т.е. степень завершенности реакции (I), определяется как отношение текущего или равновесного числа солевых связей между полиионами к их максимально возможному расчетному числу (0 = х/т, когда п>т, и 0 = х/п, когда и < т). Если один из взаимодействующих полиэлектролитов - слабая поликислота или слабое полиоснование, то 0 можно легко контролировать путем изменения рН
(УСООН)я + (>ЫН+а")т [(>СОСГ+НН<)л (^СООН^.^ЧУЫН^ _х] +
+ + хЬ+ (>"СОО"Ь+)я + (>Ы)т. (П)
Н* '
Поэтому в таких случаях ИПЭК могут быть получены в равновесных условиях путем постепенного подкисления (подщепачтааюиО реакционной системы, а текущее значение 0 с хорошим
приближением вычисляется из данных потенцио-метрического титрования по уравнениям [2]
0=(ть/У+[Н+]-Д^Ао) (1)
(случай слабой поликислоты),
0 = (та/У+ [ОН"] - Т^Ао) (2)
(случай слабого полиоснования), где та или ть - количество молей добавленной кислоты или основания, V- текущий объем реакционной смеси, Ка и ^-характеристические константы диссоциации поликислоты или полиоснования, с0 - концентрация одного из полиэлектролитов.
На рис. 1 сплошными линиями показаны типичные зависимости 0 от рН, которые рассчитывают из экспериментальных кривых титрования слабого полиэлектролита в присутствии противоположно заряженного полииона; рН - зависимости степени ионизации а тех же индивидуальных полиэлектролитов представлены штриховыми линиями. Величина ДрН(0, а) служит мерой свободной энергии стабилизации ИПЭК ДС?„, обусловленной кооперативным взаимодействием тех противоположно заряженных групп, которые образуют межцепные солевые связи в ИПЭК при данном значении 0:
ДрН(0, а) = [Д(/«х) - АСтП.ЗКТ = Авс, /ЯТ. (3)
Здесь ДС(а) и ДС(0) - свободные энергии ионизации слабого полиэлектролита в отсутствие и в присутствии противоположно заряженного полииона при данном значении а или 0 соответственно (а=В).
8, а
. --_I_ъ_
3 7 рН
Рис. 1. Типичные зависимости степени превращения 6 в реакции соединения полиионов от рН (1,2) и а от рН (Г, 2'). I - полиакриловая кислота/гидрохлорид полидиметиламиноэтилмета-крилата; 2 - полидиметиламиноэтилметакри-лат/полиакрилат натрия. /' и 2' - кривые потен-циометрического титрования полиакриловой кислоты и полидиметиламиноэтилметакрилата; Т = 20°С.
Уравнение (3) записано в предположении, что каждая ионогенная группа титруемого полиэлектролитного компонента ИПЭК, заряжаясь, образует солевую связь с противоположно заряженным полиионом. Такая ситуация близка к реальной, если отношение ионогенных групп исходных компонентов X = т/и = 1, или при Хф 1, если общее число ионогенных групп титруемого слабого полиэлектролита меньше, чем общее число звеньев присутствующего в системе противоположно заряженного и полностью ионизованного по-лииона.
Если ИПЭК образуется путем полимеризации заряженного мономера на противоположно заряженном полиионе, который в таком случае выполняет функцию матрицы [5], то общее изменение свободной энергии ЬО,р можно разбить на две составляющие
где АСр - свободная энергия полимеризации в отсутствие матрицы. ДС„ служит термодинамическим фактором, способствующим превращению мономера в полимер. Этот фактор может иметь решающее значение в условиях, при которых полимеризация свободного мономера термодинамически запрещена, т.е. если ДСр > 0, но ДС„ < О и |ДС„| > |ДСр|, а следовательно АС1р < 0. Иными словами, полиион как один из потенциальных компонентов ИПЭК способен сдвинуть полиме-ризационно-деполимеризационное равновесие в сторону сборки другого противоположно заряженного полииона - второго потенциального компонента ИПЭК. В принципе тот же фактор (т.е. АСС1) ответствен за кластеризацию белковых глобул противоположно заряженными полиио-нами с образованием полиэлектролит-белковых комплексов [6-8]. Он же обусловливает "прину-
дительное" мицелообразование в растворах полиэлектролитов и в полиэлектролитных гелях при добавлении в систему противоположно заряженных ионов ПАВ. В результате образуются полимер-коллоидные комплексы при концентрациях ПАВ, значительно меньших их характеристических ККМ [9 -15]. Фактически эти процессы можно рассматривать как "полимеризацию" белковых глобул или ионов ПАВ на полимерных матрицах.
Способность ИПЭК растворяться либо ограниченно набухать в воде определяется соотношением ионогенных групп X и относительной длиной противоположно заряженных полиионов, а также составом водной фазы (природой и концентрацией простых солей, величиной рН, присутствием и концентрацией органических добавок и т.п.).
Если 2 = 1, то при доведении 0 до значения, близкого к единице, в системе образуются стехи-ометричные ИПЭК, продукты завершенной ин-терполиэлектролитной реакции. Такие ИПЭК всегда нерастворимы, но ограниченно набухают в воде. Нерастворимые ИПЭК известны уже многие годы, и поиски путей их практического применения ведутся по крайней мере с начала 60-х гг. В этой области достигнуты определенные успехи. Оказалось, например, что нерастворимые ИПЭК могут служить в качестве уникальных по эффективности связующих для почв и грунтов с целью предотвращения их ветровой и водной эрозии . Благодаря этому нерастворимые ИПЭК нашли масштабные практические применения, в частности при ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. В промышленном масштабе показана значительно более высокая по сравнению с индивидуальными полиэлектролитами эффективность нерастворимых ИПЭК как коагулянтов коллоидных дисперсий, в частности шлаковых отходов металлургических производств1. Нерастворимые ИПЭК перспективны в качестве биосовместимых покрытий для гемо-сорбентов и других изделий медицинского назначения, использующихся в контакте с кровью и биологическими жидкостями . Просматривается и ряд других многообещающих перспектив.
Водорастворимые ИПЭК могут быть получены из большинства пар противоположно заряженных полиэлектролитов, но при соблюдении определенных условий [2,4,16-18]. Например, если X = 1, то растворимость может быть достигнута лишь при 6 < 1, т.е. для продуктов незавершенной реакции (I) [16]. При этом свободные звенья исходных полиэлектролитов, не вступившие в межцепные солевые связи, выполняют функцию
1 См., например: Кабанов В.А. и др. // Успехи химии. 1991.
Т. 160. № 3. С. 595.
2 См., например: Зезин А.Б. и др. // Хим.-фармацевт. журн.
1987. № 7. С. 788. т г ч зу
лиофилизирующих (гидрофильных) фрагментов, способствуя удержанию частиц ИПЭК в растворе. При в « 1 ИПЭК растворимы в воде, если молярное отношение звеньев блокирующего полиэлектролита (БПЭ) и лиофилизирующего полиэлектролита (ЛПЭ), ф = [БПЭ]/[ЛПЭ] < фс < 1 (при равномерном распределении цепей БПЭ между цепями ЛПЭ ф = 2). Частицы таких нестехиометричных ИПЭК можно рассматривать как своеобразные блок-сополимеры, содержащие гидрофильные одноцепные сегменты ЛПЭ и относительно гидрофобные двухцепные БПЭ/ЛПЭ-домены [2, 4]. Критическое значение фс определяет предельную степень заселенности ЛПЭ цепями БПЭ, выше которой гидрофиль-ность избыточных однотяжных сегментов уже недостаточна для удержания частицы ИПЭК в растворе. Для большинства исследованных систем значения фс лежат в интервале 0.5 - 0.2 и в основном зависят от химического строения полиэлектролитных компонентов. Установление факта существования растворимых ИПЭК [17] и условий их образования, справедливых для широкого круга пар противоположно заряженных полиэлектролитов [2,4, 16, 18], означало серьезный прорыв в этой области. Оно позволило вывести исследования на качественно новый уровень благодаря открывшейся возможности привлечь арсенал современных методов изучения свойств, характеристик и поведения макромолекул в растворах. Фундаментальная информация, полученная этими методами, способствовала более глубокому пониманию структурной организации и особенностей поведения ИПЭК не только в растворе, но и в концентрированной фазе. Вместе с тем перед исследователями открылся совершенно новый спектр перспективных применений, специфичных именно для семейства растворимых ИПЭК и касающихся в первую очередь биомиметики, биотехнологии и медицины. Некоторые из них будут рассмотрены в этом аналитическом обзоре.
Кооперативный характер многоточечных связей между полиионами придает ИПЭК очень высокую стабильность по отношению к диссоциации на исходные полиэлектролитные компоненты в интервале рН, ограниченном потенциомет-рическими кривыми / и 2 (рис. 1). Эффективная константа диссоциации при 6, близком к единице, резко уменьшается с ростом длины БПЭ и уже для относительно коротких олигомеров практически обращается в нуль. Так, в случае кватерни-зованных олигоэтилениминов
Я
I
Н(СН2-СН2-Ы+-)„Н
СН3
(Я = -СН3 или -СН2-С6Н5),
взаимодействующих с полиметакрилатанионами (ПМА), степень диссоциации ИПЭК становится
пренебрежимо малой, начиная примерно с окта-мера и выше [3, 19]. Аналогичные результаты были получены для ряда олигофосфатов, взаимодействующих с полидиметиламиноэтилметакри-латом [20] и олиго-2.5-ионенов, взаимодействующих с полиакрилатанионами [21]. Поэтому можно считать, что после достижения некоторой "критической" длины полиионов образованные ими ИПЭК практически не диссоциируют на исходные полиионные компоненты.
Одним из наиболее информативных методов изучения процессов образования и превращений растворимых ИПЭК оказался метод тушения люминесценции. Большинство измерений [22 - 29] проведены с использованием люминесцентно-ме-ченных полиметакрилатанионов (ПМА*) [30], содержащих одну антриальную или пиренильную метку на 350 -1500 мономерных звеньев
СН3
[>сн
СОО" Ме+
где п = 350 - 1500, и поликатионов сополимера 1-этил-4-винилпиридиния (ЭВП) с винилпириди-ном (ПВПК)
-fCH2-CH-)m-(-CH,-CH-)*.
6 г 6
N X" N
N С2Н5
Звенья ЭВП, как известно, тушат флуоресценцию антрильных и пиренильных групп. ПВПК получали путем кватернизации фракций поли-4-винилпиридина (ПВП) этилбромидом [31]. Содержание ЭВП-звеньев задавали степенью кватернизации, р (%) = [т/(т + л)] 100.
Процессы образования ИПЭК, описываемые схемами I и II, в терминах традиционной классификации представляют собой соответственно ионные реакции обмена и нейтрализации. Однако при рассмотрении с позиций взаимодействия между полимерными цепями их можно определить как реакции соединения полиионов.
Одно из важнейших свойств ИПЭК заключается в их способности участвовать в реакциях переноса полиионов [22 - 25]
ИПЭК(ЛПЭ, /л БПЭ) + ЛПЭ2 ^ ИПЭК(ЛПЭ,/(л-х) БПЭ) +
+ ИПЭК(ЛПЭ2/*БПЭ), (III)
где п или х - число цепей БПЭ в частице ИПЭК. Если ЛПЭ, и ЛПЭ2 представляют собой идентичные полиионы, то процесс III в плане взаимоотношений ИПЭК-полиион можно определить как
///о
- 1
Г
___2 2'
Время, мин
Рис. 2. Типичные кинетические кривые реакций полиионного соединения и обмена. 1 - nMA*Na
(Pw = 4.4 х 103, 1 метка на 600 звеньев) + ПВПК (Pw = 2.0 х 102, ß = 95%) в отсутствие низкомолекулярной соли; [ПМА*Ыа] = 8.6 х 10"8 моль/л (в расчете на полинон), Z= [ПВПК]/[ПМА*Ыа] = = 0.2; 2 - та же реакция, но в присутствии [NaCl] = 0.03 моль/л; 3 - ИПЭК (ПМА/ПВПК) + + IlMA*Na, [riMA*Na] = [ИПЭК] = 8.6 х х Ю-8 моль/л, Pw (ПМА) = 4.4 х 103, <р = 0.2, Т = 20°С, pH 10, 0 —> 1. /' - равновесный предел для кривой 1, а 2' - для кривой 2.
реакцию полиионного обмена. Если ЛПЭ, и ЛПЭ2 различаются по химическому строению или составу, то процесс III можно определить как реакцию полиионного замещения. Процесс переноса цепей БПЭ может происходить и внутри отдельных частиц ИПЭК с вовлечением в него различных сегментов ЛПЭ, что фактически эквивалентно миграции БПЭ в клубке ЛПЭ. Возможность такой миграции придает частицам ИПЭК дополнительный уникальный ресурс для внутренних перестроек и адаптации в поисках термодинамического оптимума взаимодействия с окружающей средой. Реакции переноса полиионов в системах ИПЭК служат основой уже осуществленных и многих перспективных практических применений ИПЭК.
В качестве типичного примера была изучена реакция соединения полианионов ПМА*№, меченных пиренильными группами, и поликатионов фракции ПВПК [26,28]. Образование ИПЭК (ПМА*/ПВПК) приводит к уменьшению относительной интенсивности флуоресценции 1/10 пире-нильных меток в цепях ПМА*, которую тушат связывающиеся с ними звенья ПВПК (/0 - интенсивность флуоресценции раствора исходного ПМА* при заданной ионной силе). Реакционную смесь готовили путем быстрого введения 0.02 мл водного раствора ПВПК в ячейку, содержащую 1.5 мл nMA*Na при непрерывном перемешивании так, что время гомогенизации не превышало 2 - 4 с. ///0 измеряли с помощью спектрофлуори-
метра при Ха = 342 нм, = 395 нм. Из данных, приведенных на рис. 2, видно, что смешение растворов реагентов в присутствии низкомолекулярной соли сопровождается скачкообразным падением 1/10 до постоянного значения, соответствующего некоторому количеству быстро образовавшихся контактов между ПМА* и ПВПК (прямая 1). Однако наблюдаемое падение гораздо меньше, чем следует ожидать в случае образования равновесной системы, содержащей ИПЭК (ПМА*/ПВПК) соответствующего состава <р = 0.2 (прямая Г). Смешение растворов тех же реагентов в 0.03 М растворе ЫаС1 приводит к гораздо большему падению величины ///0, которое затем сопровождается ее постепенным понижением и приближением к равновесному уровню (ср. кривую 2 и прямую 2').
Измерения, проведенные методом остановленной струи ("81оррес1-Ао\у"), показали, что быстрая стадия реакции соединения полиионов, соответствующая скачкообразному падению ///0, на самом деле заканчивается за время, меньшее 5 мс (постоянная времени прибора), т.е. нижний предел константы скорости бимолекулярной реакции между полиионами к0 составляют величину порядка 109л/(моль с), т.е. близок к оценочной величине константы скорости диффузионных столкновений макромолекулярных клубков [26,28]. В результате таких столкновений между противоположно заряженными полиионами возникают случайные ионные связи. При этом образуются полианион/поликатионные ассоциаты, которые при ионных силах, близких к нулю, остаются "замороженными" в неравновесном состоянии (рис. 2, прямая 1). Однако в присутствии низкомолекулярной соли "замораживание" не происходит: внутримолекулярные и межмолекулярные перегруппировки взаимодействующих полиионов оказываются разрешены. В результате этих перегруппировок чис/ю солевых связей между полиионами возрастает, и первичные ассоциаты постепенно превращаются в равновесные частицы ИПЭК (ПМА*/ПВПК) (рис. 2, кривая 2). По всей вероятности, указанные перегруппировки происходят путем реакции полиионного обмена с участием сегментов противоположно заряженных цепей. "Чистый" случай такого обмена представлен на рис. 2 кинетической кривой 3. Пиренильные метки в цепях ПМА* дополнительно стабилизируют ИПЭК (ПМА*/ПВПК) по сравнению с ИПЭК (ПМА/ПВПК). Поэтому полиионы ПМА* полностью замещают полиионы ПМА в ИПЭК (ПМА/ПВПК). Таким образом, качественно кинетическую кривую 2 можно рассматривать как наложение кинетических кривых 1 и 3. Иными словами, присутствие в цепи ПМА* одной пиренильной метки на несколько сотен звеньев оказывается достаточным для того, чтобы цепь ПВПК ее "узнала" и предпочла немеченой цепи ПМА.
Для растворимых ИПЭК показано [27,28], что если процесс полиионного обмена состоит в переносе одной цепи БПЭ (ПВПК) с цепи ЛПЭ, (ПМА) на цепь ЛПЭ2 (ПМА*)
ИПЭК (ПМА/ПВПК) + ПМА* ИПЭК
(ПМА*/ПВПК) + ПМА (ИГ)
(схема III при п = 1), то реакция имеет второй кинетический порядок по концентрациям макромо-лекулярных реагентов (ИПЭК и ПМА*). Соответственно экспериментальные кинетические кривые спрямляются в координатах уравнения
<7/(1-<7) = /:2[ПМА*]0Г, (4)
где q - степень превращения, [ПМА]0 = [ПМА]0 = = [НПЭК]0 - начальная концентрация реагирующих частиц в растворе. Это дает возможность количественно определять абсолютную константу скорости к2 переноса БПЭ с одной цепи ЛПЭ на другую. Соответствующие экспериментальные данные приведены в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что в соответствии с уравнением (4) величина к2 на самом деле не зависит от концентрации реагирующих макромолекул (опыты 1-3,6). Существенно также, что к2 не зависит от длины ЛПЭ (ПМА) (опыты 8, 9) и резко уменьшается с ростом длины БПЭ (ПВПК) (опыты 10 - 13). В условиях эксперимента значение к2 оказываются порядка 104 - 106 л/(моль с), что на 3 - 5 порядков ниже, чем оцененные значения константы скорости диффузионных столкновений реагирующих макромолекулярных частиц. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что процесс протекает через образование короткоживущего промежуточного продукта -тройного комплекса (ПМА...ПВПК...ПМА*), возникающего в результате взаимопроникновения клубков ИПЭК (ПМА/ПВПК) и ПМА*Ыа при их случайных столкновениях в растворе. Этот комплекс играет роль своеобразного "переходного состояния" в бимакромолекулярной реакции полиионного обмена, как показано ниже
ПВПК
ПВПК (IV)
-я/
ПМА
ПМА*
В условиях упомянутых выше экспериментов далеко не каждое столкновение оказывается про-
Таблица 1. Константы скорости реакции полиионного обмена между различными ИПЭК (ПМА/ПВПК) и ПМА*Иа (рН 10, 9 — 1, Т = 20°С)
Ъ 1—< PwxlÖ~3
Опыт, № [ПМА*] х моль/л ПВПК ПМА ß.% [NaCl], моль/л /—V О ъй — о х s л ч/
1 3 0.6 3.9 95 0.08 5.1
2 7 0.6 3.9 95 0.08 5.0
3 15 0.6 3.9 95 0.08 4.7
4 40 0.6 3.9 95 0.06 1.2
5 40 0.6 3.9 95 0.07 2.6
6 40 0.6 3.9 95 0.08 5.1
7 40 0.6 3.9 95 0.09 8.7
8 33 0.1 4.4 95 0.04 2.0
9 33 0.1 1.0 95 0.04 2.0
10 28 0.6 4.4 95 0.07 1.5
И 28 0.32 4.4 95 0.07 6.0
12 28 0.2 4.4 95 0.07 11.0
13 28 0.1 4.4 95 0.07 23.0
14 23 0.2 2.8 89 0.035 0.2
15 23 0.2 2.8 80 0.035 0.7
16 23 0.2 2.8 69 0.035 2.6
17 23 0.2 2.8 62 0.035 16.2
18 23 0.2 2.8 55 0.035 36.1
Примечание. Значения [ПМА*]0 = [ПМА]0 приведены в
расчете на полиион; /"„(ПМА) = Pw(nMA*>, ПМА* содержит 1 пиренильную метку на 350 звеньев.
дуктивным. На один акт переноса ПВПК с ПМА на ПМА* требуется в среднем порядка 103 - 105 столкновений. Сильная зависимость к2 от ионной силы (опыты 4 - 7) и линейной плотности заряда на цепях ПВПК (опыты 14 - 18) согласуется с предложенным механизмом реакции.
Реакции полиионного обмена, в которых участвуют частицы ИПЭК, несущие более одной цепи БПЭ, описываются более сложной полихрон-ной кинетикой. Однако они характеризуются качественно сходными закономерностями [24]. Так, например, их скорость существенно зависит от концентрации низкомолекулярных солей в реакционном растворе, что можно проиллюстрировать следующими данными:
[КаС1] х 103, моль/л 0 35 70 100
Время полупревра- Реакция не идет 240 6 <1.5 щения, с
(/>и,(ПМА*Ка) = /»„(ПМА-Ыа) = з х 103, />„. (ПВПК) = 2 х 102; [ПМА*№] = [ПМА-№] = = [ИПЭК] =4х10-3 осново-моль, <р = 0.33; рН 10, Т = 20°С).
[№С1], моль/л [МЮ!], моль/л
Рис. 3. Зависимость равновесной степени превращения в реакции полиионного замещения между ИПЭК (ПМА*/ПВПК) и ПФ от концентрации ЫаС1 (а) и других хлоридов (б). [ПМА*] = [ПФ] = 1.5 х 10~3 моль/л (в расчете на звено полииона), <р = [ПВПК]/[ПМА*] = 0.33, рН 10, Т=25°С. а: Р (ПФ) = 230 (1), 70 (2), 50 (3), 20 (4); б: Р (ПФ) = 10; 1 - иС1,2 - ИаС!, 3 - КС1.
Наряду с этим следует отметить,что реакции обмена и замещения полиионов в ИПЭК могут быть полностью заторможены даже в присутствии низкомолекулярных солей, если электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными макромолекулами существенно модулировано взаимодействием иного рода, например гидрофобным. Ярким примером служат результаты сравнения поведения двух ИПЭК -одного, образованного полиакрилатанионом (или ПМА) и линейным полиэтиленимином (ПЭИ), другого - полиакрилатанионом (или ПМА) и поли-трет-бутилазиридином (ПТБА) в водных растворах [32]. Оба поликатионных компонента
(-ын2-сн2-сн2-)я (—ш-сн2— СН2—).
СН3-С-СН3 СН3
характеризуются одинаковой линейной плотностью заряда. Однако в отличие от цепей ПЭИ, которые охотно участвуют в реакциях переноса, цепи ПТБА при повышенных температурах (40 - 60°С) оказываются фиксированы в исходных частицах ИПЭК даже при относительно высокой ионной силе, вероятно, благодаря внут-
рикомплексному взаимодействию объемных гидрофобных групп.
Показано также, что в случае реакций полиионного замещения не только кинетика, но и положение равновесия существенно зависит от строения и длины участвующих в образовании ИПЭК полиионных партнеров, а также от природы и концентрации присутствующих в системе низкомолекулярных противоионов [20, 21, 25, 29, 33, 34]. В частности, поликатионы, содержащие сульфо-натные или сульфатные группы (такие, как поли-этиленсульфат, полиэтиленсульфонат, полисти-росульфонат, гепарин), обычно замещают карбоксил атные полианионы, вытесняя их из их ИПЭК с различными поликатионами [21]. Скорость реакции полиионного замещения между ИПЭК (ПМА*/ПВПК) и поливинил сульфатом калия (ПВСК) сильнейшим образом зависит от концентрации низкомолекулярных солей в реакционном растворе:
[ЫаС1] х 103, моль/л 0 2 4 6 8 10
Время полупревра- Реакция 600 60 13 5 <1.5 щения, с не идет
(Р„,(ПМА*Ма) = 3 х 103; /»„(ПВСК) = 1.3 х 103; /\.(ПВПК) = 2 х 102; [(ИПЭК(ПМА*/ПВПК)] = = 4 х 10"3 осново-моль; (р = 0.2; [ПВСК] = [ПВПК]; рН 10; Г = 20°С) '
^/^шах 1.0
0.2 0.3 0.4
[NaCl], моль/л
Рис. 4. Зависимость относительной мутности раствора ИПЭК (ПМА/ПВПК) от рН (а) и от концентрации ЫаС1 (б). Р№(ПМА) = 4100, ^(ПВПК) = 200, [ПВПК] = 2 х 1(Г3 моль/л (в расчете на звено полииона), <р = = [ПВПК]/[ПМА] = 0.33, Т = 20°С. (Просветление раствора при рН < 2.5 (а) и при [ИаС1] > 0.4 моль/л (б) вызвано диссоциацией ИПЭК на исходные полиэлектролитные компоненты), а - [ЫаС1] = 0.02 моль/л; б - рН 7.5.
Влияние длины цепи конкурирующих полиэлектролитов и природы низкомолекулярных противоионов на направление реакций полиионного замещения было обнаружено в работе [29]. На рис. 3 представлены зависимости равновесной степени превращения <7, в реакции
ИПЭК(ПМА*/лПВПК) + л:ПФ*=* (V)
ИПЭК (х ПФ/лПВПК) + ПМА*
от концентрации низкомолекулярных солей в растворе (ПФ,- полифосфаты различной степени полимеризации, ПМА* - полиметакрилат-анио-ны, меченные антрильными группами). Поскольку в исследованном интервале ионной силы оба ИПЭК, участвующие в реакции V, практически не диссоциируют на исходные компоненты, превращение, описываемое схемой V, не изменяет суммарного числа неблокированных заряженных групп на цепях полианионов, а следовательно, и концентрацию противоионов в системе. При движении в направлениях, указанных стрелками, меняется лишь соотношение между числом карбок-сйлатных и фосфатных групп, свободных от контакта с пиридиниевыми звеньями поликатиона. Поэтому сам факт чувствительности равновесия V к концентрации низкомолекулярной соли свидетельствует о неодинаковом влиянии концентрации низкомолекулярных катионов на кажущиеся константы их связывания с ПМА и ПФ.
Замечательно, однако, что ход кривых рис. 3 при прочих равных условиях различен в системах, отличающихся степенью полимеризации ПФ (рис. За) или природой низкомолекулярных катионов (рис. 36). Эти различия приводят к качественно значимым эффектам. Так, в 0.3 М водном растворе ЫаС1 равновесие V полностью сдвинуто вправо в случае самых длинных (230 звеньев) и влево - в случае самых коротких (20 звеньев) полифосфатных цепей (при фиксированной осно-во-мольной концентрации всех полимерных компонентов). Для полифосфатов промежуточных степеней полимеризации равновесная степень
превращения в реакции V имеет промежуточные значения. При фиксированной длине цепей ПФ (70 звеньев) равновесие в реакции V полностью сдвинуто вправо в 0.3 М растворе LiCl и полностью сдвинуто влево в 0.3 М растворе KCl. В 0.3 М растворе NaCl система характеризуется промежуточными значениями qe. Описанные явления не имеют аналогий в неполимерных системах и, вероятно, имеют сходство с важными регуляторны-ми процессами в клетках, происходящими с участием природных полиэлектролитов. Недавно автор и сотр. [33, 34] наблюдали аналогичные явления для ИПЭК, включающих в качестве полианионов цепи ДНК.
Термодинамическое объяснение этим на первый взгляд поразительным эффектам было дано в работе [29]. Существо его сводится к следующему. Представим общее изменение свободной энергии ДG, в реакции V в виде суммы двух слагаемых
AG, = AGP + AGci. (5)
Здесь член AGp относится к замене контактного взаимодействия между ПВПК и ПМА* на контактное взаимодействие между ПВПК и ПФ, а член AGci представляет собой разность свободных энергий взаимодействия низкомолекулярных противоионов с сегментами ПМА* и ПФ, участвующими в реакции замещения.
Рассмотрим вначале случай реакции V, когда длина обоих полианионов (4100 и 230 звеньев) больше, чем длина полика' иона ПВПК (170 звеньев), как показано на схеме
ПМА*
ПМА* -^ПФ
ПВПК
1ПВПК
Тогда общее число полимерных частиц в системе не зависит от положения равновесия и при движении в направлениях, указанных стрелками, остается
постоянным. Как следует из упомянутых выше экспериментальных данных, равновесие, показанное на схеме V', в растворе №С1 сдвинуто вправо. Это означает, что общее изменение свободной энергии АС, в варианте V' реакции V отрицательно (АО) = АСр + АСы < 0). Однако, как следует из тех же экспериментальных данных, уменьшение длины цепи ПФ приводит к сдвигу равновесия в противоположную сторону
\ J
ПВПК |
ПМА*
V ПФ
"^ПВПК
(V")
ПМА*
4 ПФ
Это означает, что член АС, меняет знак. Иными словами, общее изменение свободной энергии в варианте реакции V" становится положительным
(АС" = АС'р + ДС", > 0). Поскольку суммарное число электростатических контактов между противоположно заряженными полиэлектролитами остается неизменным (в условиях эксперимента величина 9 для обоих ИПЭК близка к единице), ДСс, не зависит от длины участвующих в реакции цепей, т.е. АСЫ = А С'ы. Следовательно, наблюдаемый эффект надо отнести за счет возрастания АОр, т.е. АСр > АСр. В самом деле, из качественных соображений ясно, что переход слева направо в случае V" энтропийно менее выгоден, чем в случае V', поскольку первый в отличие от последнего приводит к уменьшению числа полимерных частиц в системе.
Теперь рассмотрим случай, когда длина участвующих в реакции полиионов фиксирована, но варьируется природа противоионов щелочных металлов. Тогда член АСР остается постоянным, а изменение знака ДС, при замене 1л+ на К+ вызвано изменением ДСС), которое обусловлено различиями в величинах свободных энергий взаимодействия между полианионами и катионами ряда использованных хлоридов щелочных металлов. Понятно, что эти различия обусловлены вкладами специфических взаимодействий (донорно-ак-цепторного типа), которые накладываются на универсальное кулоновское притяжение противоположных зарядов. В самом деле, показано, что критическая концентрация солей, при которой ИПЭК (ПМА/ПВПК) диссоциирует на исходные полиэлектролитные компоненты, возрастает в ряду ЫС1 < №С1 < КС1, тогда как для ИПЭК (ПФ/ПВПК) этот ряд обращен [35].
Таким образом, равновесием в реакциях полиионного замещения типа V можно управлять путем замены одних низкомолекулярных противоионов на другие, а также путем изменения степени
полимеризации участвующих полиэлектролитных цепей.
Роль БПЭ в ИПЭК могут играть не только линейные полиэлектролиты, но и заряженные глобулярные частицы, например молекулы белков [б, 7]. Существенно отметить, что линейные поли-ионы, характеризующиеся относительно высокой плотностью зарядов, обычно замещают белковые БПЭ, вытесняя их из исходных ИПЭК [7, 36]
\ \ -¿Г (VI)
ЛПЭ БПЭ У
Если частицы растворимых ИПЭК образованы с участием ЛПЭ, представляющих собой слабую поликислоту или слабое полиоснование, то их компактизацию, агрегацию и осаждение можно вызвать, подавляя ионизацию однотяжных блоков путем изменения рН [2, 4, 35]. Например, ИПЭК, образованные ПМА-Иа (ЛПЭ) и ПВПК (БПЭ), растворимы при рН > 6, но резко сегрегируются при меньших значениях (рис. 4а). Фазовое разделение в системе ИПЭК (ПМА/ПВПК)-Н20 можно также вызвать путем добавления низкомолекулярной соли [2, 4, 37 - 39] (рис. 46). И в этом случае фазовое разделение наступает очень резко. Последнее явление, механизм которого был детально изучен, иллюстрирует следующая схема:
№С1
(VII)
ИПЭК (Ф= 1) в осадке
На первой стадии однотяжные блоки ЛПЭ "съеживаются" из-за экранирования их зарядов низкомолекулярными противоионами. На второй стадии при превышении определенного критического значения ионной силы 1С происходит диспро-порционирование, т.е. перераспределение цепей БПЭ. В результате образуются компактные нерастворимые частицы стехиометрического (ф = 1) комплекса, которые количественно выпадают
в осадок, а в растворе остаются практически свободные цепи ЛПЭ. Диспропорционирование осуществляется по описанному выше механизму полиионного обмена.
Критические значения рН (рНс, рис. 4а) и 1С (рис. 46) зависят от состава исходного растворимого ИПЭК: чем выше <р, тем ниже рНс (если ЛПЭ - поликарбоксилат) и /с. Однако зависимости, представленные на рис. 4, качественно сходны при всех ф < <рс. Существенно, что фазовое разделение, наблюдаемое при изменении рН и увеличении концентрации низкомолекулярной соли, полностью обратимо.
Описанные выше фундаментальные свойства ИПЭК могут быть использованы, например, для создания систем фермент/ИПЭК, каталитическая активность которых поддается регулированию с помощью описанных выше интерполиэлектро-литных реакций. Некоторые обнадеживающие результаты такого подхода недавно описаны в обзоре [40].
Предложенная стратегия состоит в присоединении молекулы фермента к цепочке БПЭ или ЛПЭ ковалентной связью и последующем включении полученного конъюгата в ИПЭК путем образования комплекса с подходящим ЛПЭ или БПЭ соответственно. Например, типичная процедура с использованием БПЭ на основе ПВП включает кватернизацию определенной доли звеньев ПВП 2-бромэтанолом, а оставшихся - этил-бромидом [41]. В результате получают сополимер (ПВПК') следующего строения:
СН2-СН-Ъг-(- СН2-СН-*г
[NaCl], моль/л
Bf N
I
СН2СН2ОН
ВГ
N
С2Н5
Затем фермент пришивают к гидроксильным группам сополимера, используя в качестве реагента симметричный трихлортриазин [41]. Другие приемы основаны на использовании карбок-силсодержащих полимеров или сополимеров, к которым ферменты пришивают с помощью водорастворимых карбодиимидов [42].
Упомянутые методы были применены для получения конъюгатов пенициллинамидазы (ПА'за), а-химотрипсина (ХТ), алкогольдегидро-геназы (АДГ'за) и уреазы с поликатионами на основе ПВП [42, 43], а также конъюгатов ПА'зы и ХТ с ПМА-Иа [43]. Затем путем образования комплексов этих конъюгатов с электростатически комплементарными партнерами был получен ряд ИПЭК, содержащих иммобилизованные ферменты. Среди них ИПЭК (ПМА/ПА'за-ПВПК) [44], ИПЭК (ПМА/АДГза-ПВПК') [41, 44] ИПЭК (ПМ А/уреаза-ПВ ПК') [43], ИПЭК (ПА'за-
Рис5. Диаграммы фазового разделения ф-рН и ф-[ЫаС1] систем ИПЭК (ПМА/ПВПК) и
(ПМА/фермент-ПВПК). Р„ (ПМА) = 4000, Р„ (ПВПК) = 200, [ПМА] = 0,01 моль/л (в расчете на звено полииона), Т = 25°С; а - [ЫаС1] = = 0.05 моль/л, б - рН 7.5. 1 - ИПЭК (ПМА/ПВПК'), 2- ИПЭК (ПМА/ПА'аза-ПВПК'), 3 - ИПЭК (ПМА/ХТ-ПВПК'), 4 -ИПЭК (ПМА/АДГаза-ПВПК'), 5 - ИПЭК (ПМА/уреаза-ПВПК'). (В среднем 1 молекула фермента на 3 полииона).
км х 106, моль/л
Ч 1
20
10
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 рН
Рис. б. Зависимость константы Михаэлиса от рН в реакции гидролиза бензилпенициллина нативной ПА'азой (/) и ИПЭК (ПМА/ПА'аза-ПВПК') (2); ф-[ПВПК]ДПМА*] = 0.33, Т=25°С.
ПМА/ПВПК') [42], ИПЭК (ХТ-ПМА/ПВПК') [45], ИПЭК (уреаза-ПМА/ПВПК') [43].
Некоторые характеристики ферментов, включенных в ИПЭК, в частности рН-профили каталитической активности, меняются по сравнению с таковыми для нативных ферментов главным образом из-за влияния заряженных однотяжных блоков ЛПЭ. Например, рН'-оптимумы ПА'зы, ХТ и АДГзы, конъюгированных с ПВПК' и связанных в комплекс с ПМА-Na, сдвигаются в щелочную область на 0.2 - 0.4 единиц рН. Сдвиг тем сильнее, чем меньше значение ф, т.е. чем ниже в ИПЭК доля звеньев ЛПЭ, блокированных звеньями БПЭ. В то же время характеристические константы ферментов, такие как каталитическая константа скорости первого порядка кса1 и константа
[АП] X 10б, моль/л
2 6 Время, ч
Рис. 7. Кинетические кривые гидролиза бензилпенициллина, катализируемого ИПЭК (ПМА/ПА'аза-ПВПК'); <р = [ПВПК]/[ПМА*] = = 0.33,0.1 М фосфатный буфер, рН 7.5, Т=25°С; /0 = 0.2 (1) и 0.25 моль/л (2).
6 рН
Рис. 8. Зависимость константы скорости первого порядка инактивации к,„ нативной ПА'азы (1) и ПА'азы, включенной в ИПЭК (ПМА/ПА'аза-ПВПК') (2), от рН; Т = 60°С. Штриховыми линиями обозначен интервал рН, в котором фермент, иммобилизованный в ИПЭК, находится в осадке.
Михаэлиса км, характеризующая способность фермента связывать субстрат (чем ниже величина км, тем сильнее связывание), существенно не меняются (табл. 2 [46]).
Скорость реакций, катализируемых ферментами, включенными в растворимые ИПЭК, как и в случае нативных ферментов в растворе, не контролируется скоростью диффузии низкомолекулярного субстрата к активному центру фермента [46].
Диаграммы фазового разделения ферментсо-держащих ИПЭК в большинстве изученных случаев практически совпадают с диаграммами соответствующих ИПЭК (рис. 5). Только в случае ИПЭК, несущих объемистые глобулы уреазы, составленные из нескольких белковых субъединиц, на диаграмме фазового разделения, построенной в координатах ф-рН, наблюдается сдвиг верхней ветви в кислую область на -0.5 единицы рН [43]. Из данных, приведенных на рис. 6, видно,
что экспериментальное значение ки ПА'зы в ИПЭК (ПМА/ПА'за-ПВПК') остается практически постоянным во всем интервале рН, в котором ИПЭК растворим, и лишь незначительно отличается от км нативной ПА'зы. Однако при переходе в область рН ниже 6, в которой частицы комплекса компактизируются, утрачивают растворимость и выпадают в осадок (ср. рис. 4а и 6), величина км резко возрастает. Соответственно столь же резко уменьшается и скорость ферментативной реакции. Увеличение км в данном случае, конечно, не означает, что фазовое разделение подавляет способность фермента связывать субстрат, а лишь отражает резкое уменьшение локальной концентрации субстрата в зоне активных центров.
Из приведенных данных следует, что ферменты, включенные в состав ИПЭК, могут быть легко выделены из реакционной смеси, т.е. отделены от продуктов реакции и непрореагировавших субстратов путем надлежащего изменения рН или ионной силы. Компактизация и переход частиц фермент/ИПЭК в нерастворимое состояние немедленно останавливают или резко затормаживают каталитическую реакцию. Схема VIII иллюстрирует молекулярный механизм таких переходов, которые полностью обратимы и могут быть многократно воспроизведены без разрушения или какого-либо повреждения фермента.
Повторное растворение ферментсодержащего ИПЭК каждый раз сопровождается количественным восстановлением каталитической активности фермента, что служит преимуществом по сравнению с другими обратимо растворяющимися системами иммобилизованных ферментов, ранее описанными в литературе [47 - 50].
ОН" Фермент-ИПЭК в осадке
(VIII)
Ыа+, С1"
ЛПЭ в растворе
ИПЭК, связанный с ферментом в растворе
Фермент-ИПЭК в осадке
Ферментативные реакции, в ходе которых происходит накопление растворимых ионных солей, т.е. увеличение ионной силы I (такие, например, как гидролиз сложных эфиров), могут протекать в режиме обратимого самоингибирования,
Фермент не стабилизирован
Р3^
Фермент стабилизирован^
Фермент не стабилизирован
2.9 5.8 рН
Рис. 9. Схематическое изображение конформационного перехода в системе ИПЭК (ЛПЭ/фермент-БПЭ).
если I достигает критического значения /с, достаточного для компактизации и осаждения частиц ИПЭК. Применительно к каждой данной системе справедливо соотношение
/с = /„ + Д/с = const, (6)
где /0 - ионная сила исходного реакционного раствора, Д¡с - приращение ионной силы за счет протекания ферментативной реакции, при котором наступает самоингибирование. Иными словами, желаемая степень превращения субстрата в продукты реакции может быть запрограммирована просто путем вариации /0 или других параметров (ф, рН), влияющих на величину 1С. Хорошим примером служит гидролиз натриевой соли бензил-пенициллина, катализируемый растворимым ИПЭК (ПМА/ПА'за-ПВПК') (рис. 7) [46]. В результате гидролиза образуются натриевая соль 6-аминопенициллинанта (АП) и фенилаце-тат натрия, т.е. на 1 моль расщепленного солью субстрата приходится 2 моля продуктов реакции. По достижении степени превращения, при которой I становится равной /с, ферментативная реакция прекращается. Однако она может быть возобновлена после полного или частичного удаления из системы солевых продуктов (например, путем диализа),когда ферментсодержащий ИПЭК вновь переходит в растворимое состояние, т.е. при / < /с. Описанное явление в известной мере моделирует обратные связи, в результате которых осуществляется саморегулирование ферментативных процессов в клетках.
Обратимый коллапс частиц фермент-ИПЭК может быть также использован для регулирова-
ния стабильности ферментов по отношению к процессам денатурации. Так, термическая стабильность ПА'зы в растворимом ИПЭК (ПМА/ПА'за-ПВПК') при рН > 6 практически не отличается от таковой для нативной ПА'зы. Однако компактизация частиц комплекса при рН < 6 (см. рис. 4а и 5а) приводит к более чем 10-кратному уменьшению константы скорости инактивации кы, т.е. к значительному повышению термостабильности фермента (рис. 8). При этом, однако, происходит и резкое падение кажущейся каталитической активности (V/км, где V - скорость реакции) (рис. 6, кривая 2). Стабилизация фермента, по всей вероятности, происходит благодаря цементации и экранированию белковых глобул в плотном ядре нерастворимого ИПЭК, которое сшито системой многочисленных водородных
Таблица 2. Кинетические параметры гидролиза бен-зилпеницилина различными препаратами пеницили-намидазы (рН 7.5, Г= 25°С)
Опыт, № Препарат ПА'азы к с-1 кмх 106, моль/л
1 Нативный фермент 50 9
2 ПА'аза-ПВПК' 33 9
3 ИПЭК (ПМА/ПА'аза-ПВПК') 20 8
4 ПА'аза, иммобилизованная в во- - 430
локнах триацетата целлюлозы
5 ПА'аза, иммобилизованная в по- - 530
лиакриламидном геле
Активность фермента, %
0.3
[ОПИТ] х 106, моль/л
Рис. 10. Зависимость остаточной активности различных препаратов а-химотрипсина от концентрации основного панкреатического ингибитора трипсина (ОПИТ), а - ИПЭК (ПМА/ХТ-ПВПК'): 1,2- в растворе при рН 7.5 (7) и 6.0 (2), 3 - в осадке при рН 5.7, 4 - нативный фермент при рН 6.0. б - ИПЭК (ХТ-ПМА/ПВПК'): 5 - в растворе при рН 6.0,6 - в осадке при рН 5.7, 7 -значения, полученные в присутствии добавленной соли Са+2.
и ионных связей. В образовании этих связей участвуют все полимерные компоненты комплекса. Растворение ферментсодержащего ИПЭК при рН < 2.9 сопровождается немедленным исчезновением эффекта дополнительной термостабилизации, и кы вновь принимает значение, характерное для нативного фермента [51] (рис. 8, ср. кривые 1 и 2). Конформационные превращения частиц фермент-ИПЭК, происходящие при изменении рН, схематически представлены на рис. 9. Обратимое повышение стабильности включенного в ИПЭК фермента против денатурации, сопряженное с обратимой потерей им каталитической активности, может служить моделью образования спор [52 - 54], предохраняющих некоторые живые клетки в случае неблагоприятного изменения условий в окружающей среде.
•Существенно подчеркнуть, что описанные выше явления типичны только для ИПЭК, в которых фермент ковалентно связан с цепями БПЭ. При использовании конъюгатов фермент-ЛПЭ частицы фермент-ИПЭК ведут себя несколько по-иному. Так для ИПЭК (ПА'за-ПМА/ПВПК*) наблюдали лишь двукратное понижение kin вместо 10-кратного для ИПЭК (ПМА/ПА'за-ПВПК'). Причина, обусловливающая это различие, вероятно, состоит в том, что при компактизации частиц ИПЭК (ПА'за-ПМА/ПВПК') молекула фермента локализуется не в ее плотном ядре, а в относительно рыхлой опушке, образованной избыточными по отношению к БПЭ участками ЛПЭ [43].
Включение ферментов в ИПЭК позволяет регулировать степень доступности их каталитических центров для молекул ингибиторов, в особенности высокомолекулярных. В последнем случае активные центры фермента могут быть защищены от ингибитора не только в осадке, но и в рас-
творе. Это иллюстрируют результаты, полученные при изучении взаимодействия ХТ, включенного в ИПЭК, с основным панкреатическим ингибитором трипсина (ОПИТ) (М = 6500) [55]. Из данных, приведенных на рис. 10а, видно, что ХТ, конъюгированный с БПЭ (ПВПК') и иммобилизованный в ИПЭК с ЛПЭ (ПМА-№), частично защищен от ингибирования ОПИТ уже при рН 7.5, т.е. еще достаточно далеко от величины рН (<6), соответствующей фазовому разделению (рис. 10а, кривая 1). При рН 6 ХТ, включенный в ИПЭК, все еще оставаясь в растворе, уже значительно защищен (рис. 10а, кривая 2). Он полностью защищен в осадке при рН 5.7 (рис. 10а, кривая 3). В случае ИПЭК, образованного конъюгатом ХТ-ПМА-Ыа (ЛПЭ) и ПВПК' (БПЭ), защита от высокомолекулярного ингибитора оказывается гораздо менее эффективной как в растворе, так и в осадке (рис. 106). По-видимому, последнее означает, что молекулы фермента, конъюгирован-ные с ЛПЭ, в среднем локализуются ближе к периферии частиц ИПЭК, нежели в случае, когда они конъюгированы с БПЭ.
Другой перспективный подход может состоять в использовании конъюгатов различных ферментов с полиионами для самосборки полиферментных систем на основе ИПЭК. Описан, по крайней мере, один пример [56] такой системы, содержащей урсазу и глютамат-дегидрогеназу (ГДГ'за). Уреаза и ГДГ'за были ковалентно присоединены соответственно к ПМА-На (ЛПЭ) и к ПВПК' (БПЭ). При смешении водных растворов указанных конъюгатов происходит электростатическое связывание противоположно заряженных полиионов. В результате образуется растворимый ИПЭК (уреаза-ПМА/ГДГза-ПВПК'), включающий оба фермента. Было показано, что индукционный период реакционного цикла превращения 2-оксиглутаровой кислоты в глутаминовую кислоту, катализируемый двухферментным ИПЭК, резко уменьшается по сравнению с наблюдаемым в растворе, который содержит те же количества свободных нативных ферментов. К сожалению, упомянутое исследование пока не получило дальнейшего продолжения и развития.
Отмеченная выше способность линейных полиионов количественно замещать молекулы белков в ИПЭК (ЛПЭ/белок) (схема (VI)) может быть использована для усовершенствования некоторых аналитических процедур, в частности для конструирования эффективных иммуно-хи-мических реагентов нового типа. Антитело, ковалентно присоединенное к линейному полииону (например, к полианиону), служит центром спеце-фического связывания соответствующего белкового антигена. Наряду с этим другие молекулы антигенов могут неспецифически связываться на свободных участках полииона. Однако при взаимодействии такого ассоциата с эквимоляр-ным количеством противоположно заряженного
линейного полииона (например, поликатиона) происходит вытеснение всех неспецифически сорбированных белков и образование нерастворимого ИПЭК который теперь содержит только антиген, удерживаемый комплементарным ему антителом
\ЧА
я
В осадке
о л
Ф
В растворе
(IX)
Этот принцип был использован для разработки высокоэффективных псевдогомогенных иммуно-диагностических систем [57 - 60].
Надо сказать, что синтез растворимых конъю-гатов линейных полиэлектролитов с белками, которые необходимы для получения растворимых ИПЭК, содержащих заданное число молекул белка, несмотря на кажущуюся простоту, на самом деле встречает определенные трудности. Конечно, не составляет труда в каждом случае подобрать для этой цели подходящий органический реагент из числа используемых при сшивании молекулярных фрагментов в белковом синтезе или при химической модификации белков. Проблема возникает из-за особенностей невалентного взаимодействия линейных полиионов с белками в водных растворах. Если в условиях проведения реакции заряд полииона и суммарный заряд белковой глобулы совпадают по знаку, то в разбавленных растворах сшиванию препятствует электростатическое отталкивание полимерных партнеров, а при их концентрировании вместо растворимого конъюгата часто образуется трехмерно сшитый нерастворимый продукт. Разноименно заряженные полиион и белок, наоборот, притягиваются друг к другу и, как отмечено выше, образуют ИПЭК, в котором белковые глобулы выполняют функцию БПЭ. Однако при этом заселение полиионов молекулами белка во многих случаях происходит неравномерно. Из-за
кооперативности взаимодействия белок сорбируется на полиионах ЛПЭ по принцип}' "все или ни-чено" [6], что делает невозможным получение конъюгатов заданного состава.
Недавно [61] предложен новый подход для контролируемого синтеза белковополиэлектро-литных конъюгатов, основанный на использовании обращенных мицелл в качестве микрореакторов. Размер мицеллярных микрореакторов можно регулировать так, чтобы каждый из них вместил лишь одну макромолекулу полиэлектролита и желаемое число глобул белка (например, одну или две). Тогда реакция сшивания проходит с очень высоким выходом целевого продукта. Этот подход может стимулировать дальнейшие усилия по изучению и разработке областей применения систем белок-ИПЭК.
Наконец, заслуживает упоминания выдвинутая некоторое время назад идея [62] использовать растворимые ИПЭК в качестве депо антигепариновых веществ. Антигепариновые препараты представляют собой растворимые катионные полиэлектролиты, образующие нерастворимые ИПЭК с полианионами гепарина (см. схему). Их вводят в организм внутривенно в тех случаях, когда необходимо связать присутствующий в крови избыток гепарина (например, после хирургической операции, которой предшествовала инъекция гепаринового раствора). Значительную опасность, однако, представляет передозировка антигепаринового препарата, поскольку сами по себе антигепариновые вещества вызывают острый токсический эффект. Их токсичность не проявляется на фоне гепарина именно благодаря образованию ИПЭК (гепарин/антигепариновый поликатион). Но после того, как содержащийся в крови гепарин "оттитрован" поликатионом, токсический эффект катастрофически возрастает. Иначе обстоит дело, если вместо раствора, содержащего свободные поликатионы - антагонисты гепарина, ввести их растворимый ИПЭК, образованный с участием относительно высокомолекулярных и малотоксичных карбоксилатных полианионов (ЛПЭ). Выше была отмечена способность сульфонатных полианионов (и, в частности, гепарина) необратимо замещать карбоксилатные. Поэтому результатом взаимодействия такого ИПЭК с гепарином станет образование нового нерастворимого ИПЭК(гепарин/антигепариновый
поликатион), т.е. требуемое связывание гепарина будет достигнуто
Гепарин
Гепарин
Поликатион (БПЭ)
Полианион (ЛПЭ)
Но теперь передозировка уже не страшна, так как если она и случится, то вместо свободного антагониста гепарина в крови появится лишь его менее токсичный ИПЭК.
В этой статье рассмотрены лишь несколько примеров, иллюстрирующих возможности использования фундаментальных свойств растворимых ИПЭК для воздействия на биологические макромолекулы и системы, а также для их моделирования. Сегодня мы, вероятно, находимся в начале пути, который представляется перспективным уже из общих соображений. В самом деле, ИПЭК, образованные с участием неприродных полиэлектролитов, по существу представляют собой высококооперативные супрамолекуляр-ные частицы. В этом смысле они подобны самособирающимся супрамолекулярным комплексам биополимеров. Взаимодействие и тех и других друг с другом в водных средах подчиняется тем же общим закономерностям и управляется принципиально сходными специфическими факторами. Поэтому существует объективная основа для гладкого перехода от биомиметики к реальным биофункциональным системам, действующим не только in vitro, но также in vivo. Особый интерес в этом смысле представляет перспектива применения растворимых ДНК-содержащихИПЭК для генетической трансформации клеток. Последняя проблема заслуживает специального обзора, публикуемого далее в этом же номере журнала [63].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kabanov VA. // Pure and Appl. Chem., Macromol. Chem. 1973. V. 8. P. 121.
2. Kabanov VA., Zezin A.B. // Soviet Sei. Rev., Sec. В., Chem. Rev. 1982. V. 4. P. 207.
3. Tsuchida E., Abe K. // Adv. Polym. Sei. 1982. V. 45. P. 1.
4. Kabanov VA., Zezin A.B. // Makromol. Chem., Suppl. 1984. V. 6. P. 259.
5. Kabanov VA. // Polymerization in Organized Media / Ed. by. Paleos C.M. Gordon and Breach Sei. Pab., 1992. P. 369.
6. Кабанов B.A., Евдаков В.П., Мустафаев М.И., Антипина АД. // Молек. биология. 1977. Т. 11. С. 582.
7. Kabanov VA., Zezin A.B., Mustafaev M.I., Kasaikin VA. // Polymerie Amines and Ammonium Salts / Ed by Goethals E.J. Oxford; New York: Pergamon Press, 1980. P. 173.
8. Зайцев B.C., Изумрудов В А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. II Докл. РАН. 1992. Т. 322. >6 2. С. 318.
9. Ибрагимова З.Х., Ивлева Е.М., Павлова Н.В., Бо-родулина ТА., Ефремов В А., Касаикин В А., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. А. 1992. Т. 34. № 9. С. 134.
10. Ибрагимова З.Х., Касаикин В А., Зезин А.Б., Кабанов В А. И Высокомолек. соед. А. 1986. Т. 28. № 8. С. 1640.
11. Лысенко Е.А., Бронич Т.К., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 218.
12. Коробко ТА., Изумрудов В А., Зезин А.Б., Кабанов В А. II Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 223.
13. Хандурина Ю.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В А. II Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. Ht 2. С. 229.
14. Хандурина Ю.В., Дембо А.Т., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 235.
15 Хандурина Ю.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В .A. // Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 241.
16. Кабанов В А., Зезин А.Б., Харенко A.B., Калюж-ная Р.И. // Докл. АН СССР. 1976. Т. 230. С. 139.
17. Tsuchida Е„ Osada Y., Sanada К. // J. Polym. Sei., Polym. Chem. Ed. 1972. V. 10. P. 3397.
18. Гуляева Ж.Г., Полетаева OA., Калачев A.A., Касаикин B.A., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1976. Т. 18. № 12. С. 2800.
19. Tsuchida Е., Osada Y. II Makromol. Chem. 1974. В. 175. S.603.
20. Харенко A.B., Старикова E.A., Луценко В.В., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. А. 1976. Т. 18. № 7. С. 1604.
21. Гуляева Ж.Г., Зансохова М.Ф., Разводовский Е.Ф., Ефимов B.C., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. А. 1983. Т. 25. № 6. С. 1238.
22. Izumrudov VA., Savitskii А.Р., Bakeev KM., Zezin A£„ Kabanov VA. // Makromol. Chem., Rapid Commun. 1984. V. 5. P. 709.
23. Izumrudov VA., Bronich Т.К., Zezin A£., Kabanov VA. II J. Polym. Sei., Polym. Lett. Ed., 1985. V. 23. P. 439.
24. Kabanov VA., Zezin Aß., Izumrudov VA., Bronich TK., Bakeev KM. // Makromol. Chem. Suppl. 1985. V. 13. P. 137.
25. Zezin A.B., Izumrudov VA., Kabanov VA. // Frontiers of Macromolecular Science, Blackwell Sei. Pub. 1989. P. 219.
26. Бакеев K.H., Изумрудов В А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. II Докл. АН СССР. 1988. Т. 229. С. 1405.
27. Бакеев К.Н., Изумрудов В.А., Кучанов С.И., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 300. С. 132.
28. Bakeev КН., Izumrudov VA., Kuchanov S.I., Zezin AB., Kabanov VA. // Macromolecules. 1992. V. 25. P. 4249.
29. Izumrudov VA., Bronich Т.К., Saburova OS., Zezin A.B., Kabanov VA. // Makromol. Chem., Rapid Commun. 1988. V. 9. P. 7.
30. Краковяк М.Г., Ануфриева E.B., Скеооходов C.C. II Высокомолек. соед. А. 1972. Т. 14. № 5. С. 1127.
31. Павлова Н.Р., Кирш Ю.Э., Кабанов В А. // Высоко-молек. соед. А. 1979. Т. 21. № 9. С. 2062.
32. Kabanov VA., Zezin AB., Rogacheva V£„ Grishina N.V., Goethals EJ., Van de Velde M. // Makromol. Chem. 1986. V. 187. P. 1151.
33. Кабанов В А., Жирякова М.В., Каргов С.И., Зе-зинА.Б., Изумрудов В А. // Докл. РАН. 1993. Т. 329. № 1. С. 66.
34 Кабанов ВА., Жирякова М.В., Каргов С.И., Зе-зинА.Б., Изумрудов В А. // Докл. РАН. 1993. Т. 332. № 6. С. 50.
35 Изумрудов В А., Касаикин В А., Ермакова Л.Н., Зезин A.B. И Высокомолек. соед. А. 1978. Т. 20. № 2. С. 400.
36. Мустафаев М.И., Кабанов В.А. // Фармакология и токсикология. 1980. Т. 43. С. 395.
37. Kabanov VA., Zezin A.B. // Pure and Appl. Chem. 1984. V. 56. ifc 3. P. 343.
38. Изумрудов В А., Харенко O.A., Харенко A.B., Гуляева Ж.Г., Касаикин В А., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. >6 3. С. 692.
39. Кабанов В.А., Зезин A.B., Рогачева В.Б., Изумрудов В.А., Рыжков С.В. И Докл. АН СССР. 1982. Т. 268. С. 1419.
40. Zezin A.B., Izumrudov VA., Kabanov VA. // Makromol. Chem., Macromol. Symp. 1989. V. 26. P. 249.
41. Margolin AL., Izumrudov VA., Shviadas V.K., Zezin A.B., Kabanov VA., Berezin I.V. // Biochem. Biophys. Acta. 1981. V. 660. P. 359.
42. Марголин АЛ., Изумрудов B.A., Шерстюк С.Ф., Зезин А.Б., Швядас B.K. // Молек. биология. 1983. Т. 17. С. 1001.
43. Margolin AL., Sherstiuk ST., Izumrudov VA., Zezin A.B., Kabanov VA. // Eur. J. Biochem. 1985. V. 146. P. 625.
44. Margolin A.L., Izumrudov VA., Shviadas V.K., Zezin A.B. // Biotechn. Bioeng. 1982. V. 24. P. 237.
45. Марголин AJI., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В A., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов В А. //Докл. АН СССР. 1985. Т. 284. С. 997.
46. Марголин АЛ., Шерстюк С.Ф., Изумрудов В А., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов ВА., Бере-зин И.В. // Докл. АН СССР. 1980. Т. 253. С. 1508.
47. Charles М., Roughlin R.W., Hasselberg F.Y. // Biotechn. Bioeng. 1974. V. 16. Р. 1530.
48. Roughlin R.W., Aizawa M., Charles M. // Biotechn. Bioeng. 1976. V. 18. P. 199.
49. Leemputten E.V., Hornberger M. // Biotechn. Bioeng. 1976. V. 18. P. 587.
50. Pat 4088538. USA. 1978.
51. Марголин АЛ., Шерстюк С.Ф., Изумрудов ВА., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов В А. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 272. С. 230.
52. Swerdlow В.М., Setlow В., Setlow Р. // J. Bacteriol. 1981. V. 148. Р. 20.
53. Warth АЛ. //J. Bacteriol. 1980. V. 143. Р. 27.
54. BradburyJ.H., Fester 1Я., Hammer L. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 660. P. 678.
55. Изумрудов ВА., Марголин АЛ., Шерстюк С.Ф., Швядас В.К., Зезин А.Б., Кабанов ВА. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 269. С. 631.
56. Изумрудов В.А., Марголин АЛ., Швядас В.К., Зезин А.Б. // Тез. V Всесоюз. симпоз. по ферментной инженерии, Кабулетти. 1985. Т. 1. С. 13.
57. A.c. 1200681 СССР. 1985.
58. A.c. 1894708 СССР. 1988.
59. Дзантиев Б.Б., Блинцов А.Н., ЦивилеваЛ.С., Бере-зин И.В., Егоров А.М., Изумрудов В А., Зезин А.Б., Кабанов ВА. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 302. С. 222.
60. Дзантиев Б.Б., Блинцов А.Н., Бобкова А.Ф., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А., Атабе-ков И.Г. II Докл. АН СССР. 1990. Т. 311. С. 1482.
61. Kabanov A.V., Levashov A.V., Khrutskaya ММ., Kabanov VA. H Makromol. Chem. 1990. V. 191. P. 2801.
62. Скородинская A.M., Кеменова В А., Чернова О.В., Ефимов В.С.,Лакин K.M., Зезин А.Б., Кабанов В А. И Хим.-фармацевт. жури. 1983. № 12. С. 1463.
63. Кабанов A.B., Кабанов В А. // Высокомолек. соед. А. 1994. Т. 36. № 2. С. 198.
Physicochemical Basis and the Prospects of Using Soluble Interpolyelectrolyte Complexes
V. A. Kabanov
Moscow State University Moscow, 119899 Russia
Abstract - Interpolyelectrolyte complexes (IPECs) are formed in cooperative reactions involving oppositely charged polyions. Soluble nonstoichiometric IPECs, which are formed in dilute solutions by polyions of different degrees of polymerization (i.e., contour length), may be considered as specific amphophilic block copolymers. We discuss the most important properties of soluble IPECs, particularly, their participation in reactions of polyion exchange and substitution. The kinetics of these interpolyelectrolyte reactions and their equilibrium are also considered as controlled by the concentration and nature of low-molecular-mass counterions and the degree of polymerization of the interacting polyions. The disproportionation occurring in IPECs, when pH or ionic strength is varied, may be used to engineer the enzyme-IPEC systems in which the catalytic activity is mediated by interpolyelectrolyte reactions. The other uses may be the high-efficiency pseudohomogeneous im-munodiagnostics, "mild" heparin antagonists, and other promising biomedical applications.
