CC BY
20ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ
МЕДИЦИНЕ
ФИТОПРЕПАРАТЫ МЕТОСЕПТ, ВИТАНОРМ, МАКСИФАМ И БАКТРУМ В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА ЦИТОКИНОВ ВОСПАЛЕНИЯ
УДК 615.03
1Аксенова В.И.: директор;
2Шарипова М.М.: ассистент кафедры рефлекторной и мануальной терапии, к.м.н.; 3Мельникова В.И.: старший научный сотрудник, к.б.н.; 3Воронова С.Н.: научный сотрудник, к.б.н.;
4Василенко A.M.: главный научный сотрудник, д.м.н., профессор. 1 Научно-производственная компания ООО «ОПТИСАЛТ»
2ГОУ ВПО Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет, г. Москва, Россия
3ФБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г.Москва, Россия
4ФГБУ «Российский научный центр медицинской реабилитации и курортологии», г. Москва, Россия
Введение
Как было нами показано, комплексное применение растительных препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум вызывает подавление гуморального иммунитета, в частности, антителообразования не только в высоких, но и в низких дозах. Известно, что между гуморальным и клеточным иммунитетом существуют конкурентные взаимоотношения, которые сопровождаются изменением соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов, продуцирующих соответствующие цитокины [1]. В результате активации цитокиновой сети развивается цепь событий, вовлекающих в процесс и другие клетки иммунной системы. Для активации иммунной системы в лабораторных исследованиях часто применяют бактериальные эндотоксины, липополисахариды (ЛПС), являющиеся основными компонентами наружной мембраны гра-мотрицательных бактерий. ЛПС использовали еще в 50-х годах прошлого века для имитации всех стадий воспалительного процесса без заражения организма потенциально опасными бактериальными инфекциями. Под действием ЛПС клетки иммунной системы способны синтезировать цитокины воспаления, такие как интерлейкин (ИЛ)-1, ИЛ-6, ИЛ-12, фактор некроза опухоли (ФНОа), белок хемотаксиса моноцитов (МСР-1), интерферон (ИНФу), а также противовоспалительный цитокин ИЛ-10 [2, 3].
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния комплексного применения препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум на синтез про- и противовоспалительных цитокинов в норме и при воспалении, индуцированном ЛПС.
Материалы и методы
Животные. Исследования выполнены на самцах мышей линии СВА массой 18-20 г. Мышей содержали в стандартных условиях с контролируемыми режима-
ми температуры (24 °С) и освещения (в течение 12 ч), со свободным доступом к воде и пище.
Препараты. В исследованиях использовали смесь препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум, состав которых был описан ранее [4,5].
Схема эксперимента. Суточную дозу препаратов (по 1-ой капсуле или таблетке каждого) смешивали и рассчитывали терапевтическую дозу на 1 кг веса, которая у мышей составляла 0,7 мг/мышь. Терапевтическую и десятикратно увеличенную (7мг/мышь) дозы разводили в 0,1 мл дистиллированной воды и ежедневно вводили мышам пипеткой перорально в течение 14 суток. Животные контрольных групп препараты не получали. Животные подопытных групп получали смесь препаратов в дозе 0,7 мг/мышь или в дозе 7 мг/мышь. Через 14 дней после приема препаратов одной из контрольных и подопытных групп животных внутрибрю-шинно (в/б) вводили ЛПС Е.соП (45 мкг/кг веса в 0.5 мл 0.9%-ного ЫаС1, рН 7.2). Доза ЛПС была выбрана нами как минимальная толерантная доза, вызывающая повышение температуры тела [6]. Уровень цитокинов: ИЛ-12, ИНФу, ИЛ-10, ФНОа, ИЛ-6 и МСР-1, оценивали в сыворотке крови неинфицированных и инфицированных ЛПС мышей при помощи проточной цитометрии через 1.5 и 3 часа после в/б введения ЛПС с использованием специфических антител к этим цитокинам. Каждая группа была представлена 8 животными. Статистическую обработку проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде среднего + стандартная ошибка.
Результаты и их обсуждение.
Одним из ключевых цитокинов, ответственных за реализацию Т- клеточного механизма защиты против бактериальной или паразитической инфекции, является провоспалительный цитокин ИЛ-12 [7]. Комплексное применение препаратов метосепт, витанорм, макси-
5 2500
1000
пш н
Контроль (без препарата)
0,7 7$
Смесь препаратов (яг/мышь)
8 I 5
=г г о ье
б
Контроль (и<г) препарата)
0.7
Смесь препаратов
□ незаряженные Щ ЛЛС.1.5 часа В ЛПС, 3 часа
0,7 7,0
Контроль
(йез препарата) Смесь препаратов (мт/мышь)
Рис. 1. Эффект комплексного применения фитопрепаратов на синтез цитокинов ИЛ-12 (а), ИНф (б) и ИЛ-10 (в).
Примечание: смесь препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум в дозах. 0,7 и 7,0 мг/мышь; * р <0.05 по сравнению с контрольной группой животных, не инфицированных бактериальным эндотоксином; ** р <0.05 по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили ЛПС. ***р <0.05 по сравнению с животными, не инфицированными бактериальным эндотоксином; оценку уровня цитокинов проводили через 1,5 часа после введения ЛПС (заштрихованные столбики) и через 3 часа после введения ЛПС (черные столбики).
фам и бактрум в дозе 0,7 мг/мышь не влияло на продукцию ИЛ-12. Его уровень соответствовал уровню ИЛ-12 контрольной группы животных, не принимавших препараты (рис. 1а).
В то же время десятикратно увеличенная доза (7мг/мышь) стимулировала продукцию этого цитоки-на в 12 раз у не инфицированных бактериальным эндотоксином животных и в 10 раз у животных, которым вводили ЛПС.
ИЛ-12, в свою очередь, индуцирует синтез ИНФу, обладающего противовирусным, противопарази-тарным и противоопухолевым действием [8]. ИНФу повышает активность другого важного звена иммунной системы - естественных клеток-киллеров - основных участников врожденного иммунитета. Через 1,5-3,0 часа после введения ЛПС уровень ИНФу увеличивался в 2-3 раза по сравнению с контрольными неинфицированными животными. Смесь препаратов в дозе 0, 7 мг мышь практически не изменяла его уровень по сравнению с контролем (рис. 1б). Препараты в дозе 7 мг/мышь стимулировали продукцию ИНФу почти 5 раз у неинфицированных животных и в 4 раза после заражения ЛПС по сравнению с мышами, не принимавшими препараты.
Физиологическим ингибитором синтеза цитоки-нов клеточного иммунитета является ИЛ-10. Способность ИЛ-10 подавлять синтез таких цитокинов, как ИНФу, ИЛ-6, ФНОа связана с его способностью подавлять синтез ИЛ-12. Как правило, клетки иммунной системы продуцируют и секретируют сначала провос-палительные цитокины, в том числе ИЛ-12, а затем ИЛ-10, но с преобладанием ИЛ-12. Согласно нашим данным, при бактериальном инфицировании ЛПС уровень ИЛ-10 увеличивался в 7 раз через 1,5 часа после заражения, а смесь препаратов в дозе 0,7 мг/мышь снижала повышенный уровень этого цитокина почти в 3 раза (рис.1в). Через 3 часа после бактериального заражения его уровень в крови падал до контрольного уровня. Десятикратно увеличенная доза препаратов (7 мг/мышь) усиливала продукцию ИЛ-10 в 3,5 раза у неинфицированных животных и в 1,5 раза после введения ЛПС по сравнению с контрольными животными, не получавшими препараты. Таким образом, синтез ИЛ-12 преобладает (увеличивается в 10-12 раз) над синтезом ИЛ-10 (увеличивается в 1,5-3,5 раза) после приема препаратов в высокой дозе. Известно, что длительное повышение уровня ИЛ-10 является плохим прогностическим признаком и вызывает снижение противоинфекционной защиты и развитие хронических инфекций [9]. Согласно нашим данным, уровень ИЛ-10 в периферической крови снижается до нормы уже через 3 часа после введения ЛПС.
ЛПС и ИНФу являются основными индукторами синтеза еще одного цитокина ФНОа, выполняющего регуляторные и эффекторные функции в иммунном ответе и в период запуска воспаления [2, 10]. Аналогично с другими провоспалительными цитокина-ми, низкая доза смеси препаратов (0,7 мг/мышь) не влияла на синтез ФНОа ни в нормальных условиях, ни после активации иммунной системы ЛПС (рис. 2а). Его уровень не превышал уровня цитокина контрольных животных, не получавших препараты. Через 3 часа после введения ЛПС концентрация ФНОа в крови резко падала. Доза 7 мг/мышь стимулировала синтез ФНОа в 5 раз у неинфицированных животных и в 3 раза после индукции воспаления ЛПС, по
а
в
б
1 - ИНТЭКТНЫ?
2 - препараты 3- ППС, 1.5 часа
4 - ППС * препараты,
1,5 часа
5 - ППС, 3 часа
6 - ППС * препараты,
3 часа
Рис. 2. Эффект комплексного применения фитопрепаратов на синтез провоспалительного цитокина ФНОа.
Примечание: смесь препаратов метосепт, витанорм, максифам и бак-трум в дозе 0,7 мг/мышь (а) и 7,0 мг/мышь (б); * р<0.05 по сравнению с предыдущим столбиком; ** р<0.05 между указанными столбиками. ЛПС, 1,5 часа или 3 часа - оценка уровня ФНОа через 1,5 или 3 часа после введения ЛПС.
I
П..
25000 20000 15000 10000 5000
О-£
I
5
3 15 6
1 - ннтакгиые
2 - препараты
3 - ЛПС, 1,5 часа
4 - ЛПС * препараты, 1,5 часа
5 - ЛПС, 3 часа
6 - ЛПС + препараты, 3 часа
б
£ <100
цр ООО
с; 700
« 600
^ 500
™ «0
Ё зоо
V
3 200
| 100 о
£П_
12000
10000
4000
а.
и Ж
ге
а
!е
V
и т
£
1 - интактные
2 - препараты 3-ЛПС, 1,5 часа
4 - ЛПС ♦ препараты, 1.5 часа
5 - ЛПС, 3 часа
6 - ЛПС + препараты. 3 часа
с
2
1= 700
п 600
о
ь МО
I -г 400
(5 п .1(10
£
л /1111
X о 100
V
и
с:
5
25000
20000 о
15000
10000
5000
б
Рис. 3. Эффект комплексного применения фитопрепаратов на синтез провоспалительного цитокина ИЛ-6.
Примечание: смесь препаратов метосепт, витанорм, максифам и бак-трум в дозе 0,7 мг/мышь (а) и 7,0 мг/мышь (б); * р<0.05 по сравнению с предыдущим столбиком; ** р<0.05 между указанными столбиками; оценка уровня ФНОа через 1,5 или 3 часа после введения ЛПС.
Рис. 4. Эффект комплексного применения фитопрепаратов на синтез провоспалительного цитокина МСР-1.
Примечание: смесь препаратов метосепт, витанорм, максифам и бак-трум в дозе 0,7 мг/мышь (а) и 7,0 мг/мышь (б); * р<0.05 по сравнению с предыдущим столбиком; ** р<0.05 между указанными столбиками; оценка уровня МСР-1 через 1,5 или 3 часа после введения ЛПС.
сравнению с животными, не получавшими препараты (рис. 2б). Следует отметить, что ФНОа. потенцирует, в свою очередь, синтез ИНФу, ИЛ-10 и провоспалительного цитокина ИЛ-6 [11].
ИЛ-6 - является фактором дифференцировки В-лимфоцитов, способствуя их созреванию в антитело-продуцирующие клетки. Кроме того, ИЛ-6 индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем также может быть отнесен к цитокинам воспаления [2].
Согласно нашим данным, исходный уровень ИЛ-6 был незначительным и не менялся под действием смеси препаратов в дозе 0,7 мг/мышь (рис. 3а). Его уровень увеличивался в 230 раз через 1,5 часа после введения ЛПС, а смесь препаратов в низкой дозе достоверно снижала это увеличение на 15%. Через 3 часа после введения ЛПС уровень ИЛ-6 значительно падал (в 3,5 раза) по сравнению уровнем, выявляемым через 1,5 часа. Синтез ИЛ-6 увеличивался в 10 раз после приема препаратов в дозе 7 мг/мышь (рис. 3б). После активации ЛПС под действием смеси препаратов его уровень увеличивался на 20% по сравнению с контрольной группой животных, получавших только ЛПС.
ИЛ-6, а также ФНОа, ИНФу и ЛПС являются индукторами синтеза хемокина МСР-1, который необходим для активации нейтрофилов, моноцитов/макрофагов и привлечения этих клеток в очаг воспаления [12]. Подобно ИЛ-6, исходный уровень МСР-1 был низким. После бактериального инфицирования мышей его
а
уровень увеличивался в 70 раз через 1,5 часа и в 100 раз через 3 часа после заражения ЛПС (рис.4а). Уровень МСР-1 незначительно снижался под действием смеси препаратов в дозе 0,7 мг/мышь. После приема препаратов в дозе 7 мг/мышь уровень МСР-1 увеличивался в крови в 3,5 раза у не инфицированных ЛПС животных и в 1,4 раза после введения ЛПС по сравнению с контрольными группами животных, не получавшими препараты.
Заключение
Таким образом, комплексное применение препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум оказыва-
ет дозо-зависимый модулирующий эффект на синтез и секрецию цитокинов воспаления противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в норме и после индукции воспаления бактериальным эндотоксином ЛПС. Под действием низкой дозы препаратов (0,7 мг/мышь) уровень цитокинов либо не изменяется, либо снижается, тогда как высокие дозы препаратов (7мг/мышь) стимулируют их синтез и секрецию в кровь как у неинфицированных мышей, так и после введения ЛПС. Иммунотропная активность фитопрепаратов усиливает сопротивляемость организма к бактериальной инфекции.
Контакты:
Василенко Алексей Михайлович. E-mail:vasilenko-a-m@mail.ru
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Ярилин А.А. Иммунология: учебник. ГЭОТАР-Медиа. - М., 210. - 752с.
2. Turnbull A.V., Rivier C.L. Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by cytokines: Actions and mechanisms of action // Physiol. Rev. - 1999. -Vol. 79. - P. 1-71.
3. Liverman C.S., Kaftan H.A., Cui L. et al. Altered expression of pro-inflammatory and developmental genes in the fetal brain in a mouse model of maternal infection // Neurosci. Lett. - 2006. - Vol. 399. - P. 220-225.
4. Аксенова В.И., Шарипова М.М., Извольская М.С. и др. Репаративная регенирация тканей кожи крыс под действием растительных препаратов метосепт и витанорм // Вестник восстановительной медицины. - 2011. - № 3. - С. 21-24.
5. Паразиты - против человека. Кто победит? ООО «Графикон». - М., 210. -200с.
6. Miller A.J., Luheshi G.N., Rothwell N.J. et al. Local cytokine induction by LPS in the rat air pouch and its relationship to the febrile response // Am. J. Physiol. - 1997. - Vol. 272. - P. 857-861.
7. Trinchieri G. Immunobiology of interleukin-12 // Immunol. Res. - 1998. - Vol. 17. - P. 269-278.
8. Gattoni A., Parlato A., Vangieri B. et al. Interferon-gamma: biologic functions and HCV therapy (type I/II) (1 of 2 parts) // Clin. Ter. - 2006. - Vol. 157 -P. 377-386.
9. Brod S.A., Nelson L.D., Khan M. et al. Increased in vitro induced CD4+ and CD8+ T cell IFN-gamma and CD4+ T cell IL-10 production in stable relapsing multiple sclerosis // Int. J. Neurosci. - 1997. - Vol. 90. - P. 187-202.
10. Lima M.C., Pereira G.M., Rumjanek F.D. et al. Immunological cytokine correlates of protective immunity and pathogenesis in leprosy // Scand. J. Immunol. - 2000 - Vol. 51. - P. 419-428.
11. Sanceau J., Wijdenes J., Revel M., Wietzerbin J. IL-6 and IL-6 receptor modulation by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in human monocytic cell line (THP-1). Priming effect of IFN-gamma // J. Immunol. - 1991. - Vol. 147. P. 2630-2637.
12. Daly C., Rollins B.J. Monocyte chemoattractant protein-1 (CCL2) in inflammatory disease and adaptive immunity: therapeutic opportunities and controversies // Microcirculation. - 2003. - Vol. 10. - P. 247 - 257.
РЕЗЮМЕ
Исследовали влияние растительных препаратов метосепт, витанорм, максифам и бактрум на синтез про-и противовоспалительных цитокинов у мышей. Смесь препаратов вводили перорально в дозах 0,7 и 7,0 мг/ мышь в течение 2-х недель. Уровень цитокинов: ИЛ-12, ИНФу, ИЛ-10, ФНОа, ИЛ-6 и МСР-1 оценивали при помощи проточной цитометрии в сыворотке крови неинфицированных мышей или через 1.5 и 3 часа после вну-трибрюшинного введения бактериального эндотоксина ЛПС (45 ig/кг). Анализ полученных данных показал, что комплексное применение препаратов оказывает дозо-зависимый модулирующий эффект на синтез и секрецию цитокинов. Под действием препаратов в дозе 0,7 мг/мышь уровень цитокинов не изменялся или незначительно снижался как у неинфицированных мышей, так и после введения ЛПС. После приема препаратов в дозе 7 мг/мышь уровень цитокинов в сыворотке крови достоверно увеличивался во всех исследованных группах мышей. Заключается, что фитопрепараты при их комплексном применении включаются в регуляцию синтеза про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивая устойчивость организма к бактериальной инфекции.
Ключевые слова: метосепт, витанорм, максифам, бактрум, регуляция, цитокины воспаления, мыши
ABSTRACT
The influence of plant preparations metosept, vitanorm, maxifam and baktrum on the pro- and antiinflammatory cytokine synthesis in mice has been investigated. Mice received a mix of preparations (0.7 and 7.0 mg/mouse) per os within two weeks. Cytokine levels: interleukin (IL) 12, interferon (INF) y, IL-10, tumor necrosis factor (TNF) a, IL-6 and monocyte chemotactic protein (MCP-1) were measured by flow cytometry in blood serum of uninfected mice or at 1.5-3 hours after intraperitoneal injection with LPS (45 ig/kg). According to received data, complex application of preparations modulates the cytokine synthesis and secretion in dose-dependent manner. A mix of preparations did not change or slightly suppressed the level of cytokines in a dose of 0.7 mg/mouse in uninfected mice and after injection with LPS. The level of cytokines was significant increased in a dose of 7.0 mg/mouse in blood. Thus, complex application of preparations regulates the synthesis of pro- and antiinflammatory cytokines, providing immunity to a bacterial infection.
Key words: metosept, vitanorm, maxifam, baktrum, regulation, inflammatory cytokines, mice.
