CC BY
13
УДК 571.27:578.245:578.74
Влияние липополисахарида из Rhodobacter capsulatus PG на развитие воспаления, вызванного различными штаммами вируса гриппа
С. В. Зубова1*, М. Ф. Ворович2,3, А. С. Гамбарян2, А. А. Ишмухаметов2,3, С. В. Грачев1,3, И. Р. Прохоренко1
1Институт фундаментальных проблем биологии РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН, 142290, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3
2Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН, 142782, Московская обл., пос. Института полиомиелита, Киевское ш., 27-й км, домовладение 8, стр. 1
3Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Минздрава России, 119811, Москва, ул. Трубецкая, 8
*E-mail: zusvet@rambler.ru
Поступила в редакцию 05.12.2018
Принята к печати 15.05.2019
DOI: 10.32607/20758251-2019-11-3-46-55
РЕФЕРАТ Исследованы особенности развития воспалительных процессов у мышей, инфицированных двумя разными штаммами вируса гриппа: A/chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1) и A/Hamburg/2009 МА (H1N1). Оценено влияние нетоксичного липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на выживаемость и изменение массы тела мышей, продукцию антител IgG и индукцию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Показано, что липополисахарид R. capsulatus PG индуцирует синтез интерферона-в как при самостоятельном введении, так и на фоне заражения вирусом гриппа А, а также способствует образованию противовирусных антител в крови инфицированных гриппом животных.
КЮЧЕВЫЕ СЛОВА вирус гриппа, H5N1, H1N1, липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG, мыши, противовирусные антитела, цитокины.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ DAMP - молекулярные структуры, связанные с повреждением; НА - гемагглютинин; HMGB1 - белок амфотерин; IFN - интерферон; Ig - иммуноглобулин; IL - интерлейкин; MD-2 - белок мие-лоидной дифференцировки 2; MDCK - клетки почки собаки; MyD88 - белок миелоидной дифференцировки; NP - нуклеопротеин; PA, PB1 - белки полимеразного комплекса; TLR - Toll-подобный рецептор; TNF - фактор некроза опухолей; ИФА - иммуноферментный анализ; ЛПС - липополисахарид.
ВВЕДЕНИЕ
Эпидемии гриппа продолжают охватывать миллионы людей в мире, несмотря на использование рекомендуемых вакцин, эффективность которых оказывается ниже прогнозируемой [1, 2]. Вирусы гриппа А обладают высокой степенью изменчивости генома и продуцируют резистентные штаммы, которые некоторое время контролируются вакцинами или антивирусными препаратами общеукрепляющего действия. Разработка безопасных и эффективных вакцин остается важной проблемой здравоохранения.
Взаимодействие вирусных компонентов с различными рецепторами активирует внутриклеточ-
ные пути, ответственные за секрецию IFN типа I, провоспалительных цитокинов и хемокинов. Ключевыми факторами, вовлеченными в распознавание вирусных лигандов, являются То11-подобные рецепторы (TLR) клеток врожденного иммунитета. Локализованные на поверхности клеток TLR2 и TLR4 обнаруживают глико/липопротеины оболочки вирусов, а внутриклеточные и эндосомальные TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 - нуклеиновые кислоты [3, 4]. То11-подобные рецепторы могут взаимодействовать с другими рецепторами, стимулируя ответ клеток врожденного иммунитета на патогены, включая вирусы гриппа [4]. TLR4 может активироваться
DAMP (damage-associated molecular patterns), молекулярными структурами, высвобождаемыми из зараженных вирусом клеток [5]. Показано, что разные штаммы гриппа активируют клетки c использованием различных механизмов, что приводит к синтезу различных цитокинов и хемокинов [6, 7].
На мышах линии C57BL/6J показано, что соединение E5564 (Эриторан), синтетический аналог нетоксичного липида А из Rhodobacter sphaeroides, при определенной схеме введения защищает мышей от смерти, вызываемой вирусом гриппа H1N1, адаптированным к мышам [8]. Известно, что ядерный негистоновый белок HMGB1 (High Mobility Group Boxl, или амфотерин), представляющий собой DAMP, высвобождается сравнительно поздно после начала инфекции и участвует в развитии как грамотрицательного сепсиса, так и осложнений при гриппе, взаимодействуя с MD-2 и активируя TLR4 [5, 9, 10]. Активация TLR4 приводит к цито-киновому шторму с огромным выбросом провоспа-лительных цитокинов, включая интерфероны, факторы некроза опухолей, интерлейкины и хемокины [11]. Фармакологическая блокада TLR4 Эритораном значительно снижает смертность мышей от птичьего гриппа [8]. Липополисахарид (ЛПС) из штамма фототрофной бактерии R. capsulatus PG (Rb.) [12], структура липида А которого аналогична структуре липида А R. sphaeroides, является антагонистом эндотоксинов и подавляет активацию синтеза широкого спектра провоспалительных цитокинов клетками крови человека [13], что указывает на его способность блокировать TLR4.
Мыши являются основным инструментом для изучения иммунной системы и иммунных ответов человека. Однако существуют значительные различия между врожденной и адаптивной иммунной системами мыши и человека, которые отличаются соотношением клеток крови, составом плазмы, поверхностными рецепторами, уровнем экспрессии различных цитокинов и хемокинов и т.д. [14, 15]. Это следует учитывать при использовании мышей в качестве моделей болезней человека.
В настоящей работе изучено влияние нетоксичного ЛПС Rb. на индукцию про- и противовоспалительных цитокинов, а также на выживаемость мышей при заражении животных различными штаммами вируса гриппа А. Данное исследование направлено на изучение особенностей развития воспалительных процессов, вызванных вирусами гриппа H1N1 и H5N1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы наборы для ИФА: Mouse TNF alpha Platinum ELISA, Mouse IL-6 Platinum ELISA, Mouse IL-10 Platinum ELISA, Mouse INF gamma
Platinum ELISA (eBioscience, США), Mouse IFN beta ELISA Kit (PBL Assay Science, США).
ЛПС Rb. получен в лаборатории ИФПБ РАН согласно методике, описанной ранее [16].
Вирусы
В работе использовали штаммы вируса гриппа A: chicken/Kurgan/5/2005 (H5N1) и Hamburg/2009 МА (H1N1), адаптированный к мышам. Вирусы культивировали в куриных эмбрионах. 50% инфекционную дозу вируса (TCID50) определяли титрованием в культуре клеток MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). 50% летальную дозу (LD50) определяли путем титрования на мышах. Эксперименты с высокопатогенным вирусом A/сhicken/Kurgan/5/2005 проводили в боксах с уровнем безопасности BSL-3.
Мыши
В работе использовали мышей Balb/c массой 10-14 г возрастом 36-38 дней без различия пола. Животные получены из питомника ФГБУН Научный центр биомедицинских технологий ФМБА. Все манипуляции с животными проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации [17] с соблюдением биологической этики при проведении экспериментов на лабораторных животных.
Экспериментальная гриппозная инфекция у мышей, зараженных штаммом H5N1 вируса гриппа
Мыши были разделены на шесть групп в зависимости от получаемых препаратов. Каждая группа включала не менее 12 животных. Животные пяти групп были заражены интраназально (по 50 мкл) под легким эфирным наркозом высокопатогенным вирусом гриппа птиц H5N1 в дозах от 10 до 105 TCID50 на мышь, что составляло от 10-1 до 103 LD50. Шестая контрольная группа оставалась незараженной. Через 24 ч все группы делили пополам. Одной половине животных ежедневно в течение последующих 4 сут вводили внутрибрюшинно физраствор по 500 мкл/мышь, другой - ЛПС Rb. по 400 мкг/500 мкл/мышь. Контролем служили мыши, которым не вводили никаких агентов. Схема эксперимента представлена на рис. 1. У выживших к концу эксперимента животных (14-й день) после эвтаназии в С02-камере отбирали кровь, клетки крови осаждали, полученную сыворотку замораживали при -20°С до определения в ней титра антител к вирусу гриппа H5N1 методом ИФА.
Экспериментальная гриппозная инфекция у мышей, зараженных адаптированным к мышам штаммом H1N1 вируса гриппа
Использованный в работе пандемический вирус H1N1, адаптированный к мышам, был проведен че-
рез 20 пассажей в легких мышей и отличался от родительского штамма A/Hamburg/2009 (H1N1) деле-цией в нейраминидазе (NA) и мутациями в белках НА, NP, PA и PB1 (таблица). Вирус гриппа H1N1 обладает в 105 раз большей патогенностью для мышей, чем исходный родительский штамм.
Мышей делили на три группы в зависимости от получаемых препаратов. Каждая группа включала не менее 12 животных. Две группы мышей были заражены интраназально (по 50 мкл) под легким эфирным наркозом вирусом гриппа H1N1, адаптированным к мышам, в дозах 10 и 300 TCID50 на мышь. Контрольная группа включала незараженных мышей. Через 2 сут после заражения все группы делили пополам. Одной половине ежедневно в течение последующих 4 сут вводили внутрибрюшинно физраствор по 500 мкл/мышь, другой - ЛПС Rb. по 400 мкг/500 мкл/мышь. Контролем служили мыши, которым не вводили никаких агентов. Схема эксперимента представлена на рис. 2. Через 5 ч после введения ЛПС Rb. у трех мышей каждой группы на 3, 4 и 5 день проводили забор крови после эвтаназии в С02-камере. Кровь центрифугировали, полученную сыворотку замораживали при -20°С до определения содержания цитокинов методом ИФА. У выживших к концу эксперимента (12-й день) животных после эвтаназии в С02-камере отбирали кровь, клетки крови осаждали, сыворотку замораживали при -20°С до определения уровня IgG1 и IgG2a антител к вирусу гриппа H1N1 методом ИФА.
Определение содержания цитокинов
Содержание цитокинов TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-y и IFN-P в образцах сывороток крови мышей, зараженных вирусом гриппа H1N1, определяли с помощью наборов для ИФА по методике, рекомендованной производителем. Оптическую плотность образцов измеряли с помощью иммуноферментно-го анализатора STAT FAX 3200 (Awareness, США) при длине волны 450 нм.
Определение содержания антител к вирусу гриппа
Для определения уровня антител на гемагглю-тинин (НА) вирусов гриппа H5N1 и H1N1 в сыворотке мышей в планшет (Nunc, MaxiSorp, США), сенсибилизированный фетуином, добавляли аллан-тоисную жидкость, содержащую 64 единицы HA одного из вирусов, выдерживали в течение ночи при 40°С, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7.4 с 0.1% Твин-20 и блокировали буфером А (0.1% Твин-20, 0.2% БСА в ФСБ) в течение 1 ч. Для определения антител IgG1 и IgG2a каждую сыворотку титровали на двух разных планшетах. Блокирующий раствор удаляли, в лунки вносили
по 100 мкл сыворотки мышей, инфицированных H5N1, в разведениях от 1 : 40 до 1 : 2560, или H1N1 в разведениях от 1 : 50 до 1 : 3200 в буфере А. Плашки инкубировали в течение 4 ч при 40°С, отмывали ФСБ и добавляли меченные пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши (Sigma, США), либо против IgG1 или IgG2a мыши и инкубировали при 40°С в течение 2 ч. Затем плашки отмывали ФСБ и окрашивали ортофени-лендиамином. Оптическую плотность образцов измеряли с помощью анализатора иммунофермент-ных реакций АИФР-01 Униплан («Пикон», Россия) при длине волны 492 нм. Для исключения неспецифического связывания использовали контрольные лунки без вирусной подложки. Содержание антител в образцах выражали как разведение сыворотки, обеспечивающее сигнал, превышающий в 2 раза значение фона.
Статистический анализ
Для статистического анализа и графического представления данных использовали Microsoft Office Exel 2010 (плагин AtteStat) и OriginPro 7.5. Статистически значимые различия результатов оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считали значимыми при уровне значимости р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Состояние экспериментальных животных оценивали по выживаемости и изменению массы тела. Введение ЛПС Rb. мышам контрольной группы, а также заражение минимальной дозой 10 TCID50 вируса H5N1, независимо от введения ЛПС Rb., не влияло на выживаемость животных до конца эксперимента (14-й день) (рис. 3). Гибель животных в группах, инфицированных дозами 102 и 103 TCID50 вируса H5N1, начиналась на 8-е сут после заражения, в дозе 104 и 105 TCID50 - на 6-е. Все мыши, получившие 103, 104 и 105 TCID50 вируса гриппа, погибли к 10 сут после заражения независимо от введения ЛПС Rb. Дополнительное введение ЛПС Rb. мышам, инфицированным вирусом гриппа в дозе 102 TCID50, повысило их смертность (рис. 3). Кривые изменения веса показали, что введение ЛПС Rb. здоровым животным не влияло на их состояние и вес (рис. 4). Мыши, зараженные 10-102 TCID50 вируса, продолжали набирать вес в течение всего времени эксперимента. Инфицирование дозами 103-105 TCID50 заметно влияло на состояние животных, вызывая значительное воспаление и стремительное снижение веса. Дополнительное введение ЛПС Rb. на фоне заражения вирусом приводило к еще большему снижению веса (рис. 4).
День 0: инфицирование
интраназально
(50 мкл) вирусом Н5№
в разных разведениях
(от 10 до 105 ТСЮ50)
под эфирным
наркозом
Мыши Ва1Ь/с (весом 10-14 г) 36-38 дней без различия пола
День 14
10
~г
11
12
Т"
13
14
Введение
внутрибрюшинно ЛПС из R. capsulatus PG (400 мкг/500 мкл) или физраствора (500 мкл) ежедневно
Рис. 1. Схема эксперимента по инфицированию мышей вирусом гриппа штамма А/сЫскеп/Кигдап/5/2005 (Н5Ж)
День 0: инфицирование
интраназально
(50 мкл) вирусом H1N1
в разведениях 10 и 300
ТСЮ50 под эфирным
наркозом
Мыши Ва1Ь/с (весом 10-14 г) 36-38 дней без различия пола
День 12
"Г
6
~г
8
10
11
12
0
0
9
2
4
5
Введение
внутрибрюшинно ЛПС из R. capsulatus PG (400 мкг/500 мкл) или физраствора (500 мкл) ежедневно
Рис. 2. Схема эксперимента по инфицированию мышей вирусом гриппа штамма А/НатЬигд/2009 МА (Н1Ж)
Замены в вирусе А/НатЬигд/2009 в процессе адаптации к мышам
Штамм вируса Белок вируса, аминокислотная последовательность
ЫА НА ЫР РА РВ1
56-67 158 224 225 289 92 317
НатЬи^/2009 G И D Н N М
Hamburg/2009 МА Del 56-67 Е К G Y S V
80
с
о
м
е
а
в
и
£
60
40
Вы 20
0
■4—< < ^
-*—►
->—►
-i-1-1-1-1-1-1-г
4 6 8 10 12 14 Время эксперимента, сут
т-1-1-1
Рис. 3. Выживаемость мышей в ответ на введение ЛПС Rb., вируса гриппа A/chicken/ Kurgan/5/2005 (H5N1) и на их совместное действие
160
150 -|
£
> £ 140 е ш
Z 130 м а с е
е и н е н е м з И
120 110-1 100 90 80 70
4 6 8 10 12 Время эксперимента, сут
14
Рис. 4. Изменение веса мышей в ответ на введение ЛПС Rb., вируса гриппа A/chicken/ Kurgan/5/2005 (H5N1) и на их совместное действие
Введение ЛПС RЪ. мышам контрольной группы и инфицирование дозой 10 ТСГО50 вируса гриппа НШ1 с последующим введением ЛПС КЪ. не влияло на выживаемость животных до конца эксперимента (12-й день). В группе мышей, зараженных вирусом гриппа в дозе 300 ТСГО50, к концу эксперимента выжило 14% мышей, дополнительное введение ЛПС КЪ. увеличивало смертность мышей (рис. 5). Анализ кривых изменения веса показал, что введение ЛПС КЪ. здоровым мышам не влияло на состояние и вес контрольных животных. Мыши, инфицированные 10 ТСГО50 вируса НШ1, не проявляли признаков болезни и на 3-й день после инфицирования начинали быстро прибавлять в весе до окончания эксперимен-
та (12-й день). Дополнительное введение ЛПС КЪ. животным, инфицированным вирусом в этой дозе, приводило к снижению их веса после 7-го дня эксперимента. Инфицирование вирусом (300 ТСГО50) заметно влияло на состояние мышей, вызывая значительное воспаление и снижение веса. Введение ЛПС КЪ. на фоне заражения вирусом ухудшало состояние животных и приводило к дополнительному снижению веса (рис. 6).
Определение выживаемости и изменения массы животных, инфицированных вирусом гриппа Н5Ш или НШ1, показало, что ЛПС КЪ. не защищал мышей от летальной инфекции (рис. 3-6). Известно, что ежедневное (в течение 5-ти сут) внутривенное
0
2
0
2
<и 3 .0 5
и О
<и га
m у
£ .о со
<и 3
.о
га
и <и
m
<U У I (U I (U
m X
100-
80-
60
40
20
140 135 Ч 130 125 120 -I 115
110 4
105 100 959085 80 75 70
->—I-
-А—■*
2 4 6 8 10 12 Время эксперимента, сут
4
8
10
—г~ 12
Рис. 5. Выживаемость мышей в ответ на введение ЛПС ЯЬ., вируса гриппа А/ НатЬигд/2009 МА (Н1Ж) и на их совместное действие
Рис. 6. Изменение веса мышей в ответ на введение ЛПС ЯЬ., вируса гриппа А/НатЬигд/2009 МА (H1N1) и на их совместное действие
Время эксперимента, сут
введение Эриторана через 2 сут после инфицирования защищало мышей от вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Показано, что защита от DAMP, высвобождаемых к этому времени из инфицированных и разрушенных вирусом гриппа клеток, происходит по TLR4-зависимому механизму [18]. Тип вируса определяет механизмы ответа врожденного иммунитета на инфекцию. Пути сигнализации при инфицировании разными штаммами вирусов H5N1 и H1N1 различаются и определяют выживание и патологию развития воспаления [7]. Очевидно, в наших экспериментах инфекция развивается по молекулярным механизмам, отличным от активации клеток по пути
TLR4. Возможно также, что использованная нами схема введения и концентрация ЛПС КЬ. не эффективны для защиты от этих штаммов вируса.
К признакам вирусной инфекции относятся повышенная индукция провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких, как TNF-a, ^-1, ^-6, ^-8 [19], а также и ^N-7, обладающих противовирус-
ным действием [20, 21].
Введение мышам ЛПС КЬ. вызывало к 3 дню возрастание содержания TNF-a в сыворотке крови в 1.5 раза по сравнению с контрольными мышами, которое сохранялось примерно на том же уровне до 5-го дня эксперимента. Следует отметить, что содержание
0
0
0
2
Л
250-
200
150-
100-
50
3 день
4 день
5 день
150
100-
50
0
Д 80
с
\ 60
С
са
I
^ 40^ 20
3 день 4 день
-Г"
К
3 день 4 день
5 день
Б 2400-
| 2000
. 1600
ш 1200
^
н
га
Ц 800
<и
д
О 400
5 день
3 день
4 день
5 день
| 150
□
е
х
н
га
56 о.
е д
о и
100-
50
3 день 4 день
5 день
Рис. 7. Динамика содержания цитокинов в ответ на введение ЛПС Rb., вируса гриппа А/НатЬигд/2009 МА (Н1Ж), а также на их совместное действие. Л - Т^-а, Б - ^-6, В - П.-10, Г - ^N-7, Д - П^-Р
0
0
К
К
В
Г
К
К
0
TNF-а в сыворотке контрольных мышей отличалось достаточно высоким значением (74.7±8.7 пг/мл), указывающим на сенсибилизированное состояние животных. Образование TNF-a в крови мышей, инфицированных вирусом гриппа, зависело от дозы вируса и имело положительную динамику в ходе эксперимен-
та. Введение ЛПС КЪ. инфицированным мышам усиливало продукцию TNF-a в их крови (рис. 7А).
Динамика синтеза ^-6 во всех вариантах опыта была сходной. Уровень ^-6 значительно возрастал (от 1000 до 2000 раз) к 4-му дню эксперимента. У инфицированных мышей продукция ^-6 зависела
л
0.6 0.5 0.40.30.2 0.1
10
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
•-
100
1000
10 100 1000 Разведение сыворотки
3000
д. е 2500
н.
т
о 2000
л,
е
т и 1500-
нт
а
тр 1000-
-
500
л
10 тсюс,
0 тсю5П + 100 тaD5(
ЛПСЯЬ.
100 тaD50 + лпс яЬ.
Рис. 8. Влияние ЛПС ЯЬ. на уровни антител к вирусу гриппа А/сЫскеп/Кигдап/5/2005 (Н5Ж) в сыворотке мышей, выживших к 14-му дню опыта. Л - доза вируса 10 ТСЮ50; Б - доза вируса 102 ТСЮ50; В - титр антител в отн. ед. *** р < 0.001
В
2
0
Б
2
от дозы вируса. Содержание П1-6 в ответ на введение ЛПС КЬ. было сравнимым с содержанием у мышей, инфицированных вирусом гриппа. Введение ЛПС КЬ. инфицированным мышам незначительно усиливало выработку П1-6 к 5-му дню эксперимента (рис. 7Б).
Из полученных результатов видно, что вирусная инфекция вызывает дозозависимую индукцию синтеза провоспалительных цитокинов TNF-a и ^-6, возрастающую со временем. Эти цитокины вырабатываются, в основном, моноцитами и макрофагами в ответ как на бактерии, так и на вирусы, с использованием независимых путей передачи сигнала с привлечением разных поверхностных и внутриклеточных рецепторов, но одних и тех же адаптерных белков и транскрипционных факторов. Данные по индукции синтеза TNF-a и ^-6 показывают, что введение ЛПС КЬ. мышам, инфицированным вирусом гриппа, усиливало провоспалительный ответ их иммунных клеток (рис. 7А, Б). Это усугубляло состояние животных, о чем свидетельствуют данные по выживаемости и изменению веса (рис. 5, 6).
Введение мышам ЛПС КЬ. вызывало повышение уровня противовоспалительного цитокина ^-10, превышающего к 5-му дню исходный уровень в 3 раза. Вирус гриппа, независимо от дозы, не влиял на выработку противовоспалительного цитокина ^-10. Введение ЛПС КЬ. инфицированным мышам независимо от дозы вируса практически не влияло на индукцию синтеза ^-10 по сравнению с введением только ЛПС КЬ. (рис. 7В). Иммунорегуляторный цитокин ^-10 - ключевой компонент системы, регулирующей чрезмерные иммунные ответы подавлением экспрессии провоспалительных цитокинов, таких, как TNF-a, ^-6 и ^-1 [22, 23]. Уровни продукции ^-10 в ответ на ЛПС значительно выше, чем при вирусной инфекции [24, 25]. Полученные результаты указывают на повышение уровня ^-10 в ответ на введение ЛПС КЬ. как здоровым, так и инфицированным вирусом гриппа мышам. Это может свидетельствовать о том, что ЛПС КЬ. способствует усилению противовоспалительных ответов клеток (рис. 7В).
Л
10
0.6 0.50.40.3 0.20.1 0.0
10
2 1
1 - ЛПС ЯЬ.
2 - Н1Ж1
3 - Н1Ж1 + ЛПС ЯЬ.
18000-^ 16000-^ 14000-<э 12000 ш 10000 -|
I
га
О о.
н
8000 6000 4000 2000
—I-1-1—I—I—I I I I-1-1-1—I—I—I I I I-
100 1000
+ ЛПС ЯЬ.
+ ЛПС ЯЬ.
100 1000 Разведение сыворотки
Рис. 9. Влияние ЛПС ЯЬ. на уровни: Л - IgG1 и Б -IgG2a антител к вирусу гриппа А/НатЬигд/2009 МА (Н1Ж1) (доза вируса 10 ТСЮ50) в сыворотке мышей, выживших к 12-му дню опыта. В - титр IgG антител в отн. ед. *р < 0.05
В
3
Б
3
2
/
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии продукции №N-7 в ответ на введение мышам ЛПС КЬ. Вирус гриппа дозозависимо увеличивает содержание №N-7 в крови мышей. Более того, дополнительное введение ЛПС КЬ. мышам, инфицированным вирусом гриппа НШ1, снижало выработку №N-7 в их крови (рис. 7Г).
Не влияя на выработку №N-7, ЛПС КЬ. вызывал к 4 дню эксперимента увеличение продукции в 4 раза по сравнению с контрольным уровнем. На 5 день содержание снижалось до исходного уров-
ня. Содержание в ответ на инфицирование ви-
русом НШ1 в дозе 10 ТСГО50 возрастало к 5 дню эксперимента в 3 раза. Вирус гриппа в дозе 300 ТСГО50 значительно усиливал индукцию к 4 дню (в 16
раз) по сравнению с исходным значением. Введение ЛПС КЬ. мышам, инфицированным 10 ТСГО50 вируса гриппа, усиливало, а в дозе 300 ТСГО50 снижало содержание цитокина по сравнению с мышами, инфицированными только вирусом гриппа (рис. 7Д).
Полученные результаты показали, что количества №N-7 и синтезируемые при использованной
схеме введения ЛПС КЬ., были недостаточны для эффективной противовирусной защиты против исследуемых штаммов вируса.
входящий в состав вакцины против гриппа, действует как мощный адъювант и способствует индукции синтеза IgG2a и ^А, обеспечивая защиту от заражения. Образование IgG2a антител, характерное для ответа на вирусную инфекцию, оказывает защитное и нейтрализующее действие против вирусов гриппа. В ходе вирусной инфекции экспрессия IFN типа I и генерация IgG2a антител являются взаимосвязанными событиями биологической значимости для последующего защитного иммунитета [26].
Действие существующих вакцин против инфекции вирусами гриппа основано, главным образом, на индукции синтеза нейтрализующих антител в ответ на вирусный НА [27]. Определение уровня антител на НА вируса гриппа Н5№ в сыворотке мышей, показало, что чем выше заражающая доза вируса, тем выше титр антител в сыворотке инфицированных животных. Дополнительное введение ЛПС КЬ. мы-
шам, зараженным вирусом гриппа ^N1, приводило к достоверному росту титра антител (р < 0.001) в сыворотке крови (рис. 8).
Определение уровней IgG1 и IgG2a антител в ответ на инфицирование вирусом гриппа НШ1 показало, что титры IgG2a значительно выше, чем IgG1 во всех группах животных. Введение ЛПС КЬ. статистически значимо увеличивало уровень IgG2a в сыворотке по сравнению с мышами, инфицированными вирусом гриппа без дополнительного введения ЛПС КЬ. (р < 0.05) (рис. 9).
Врожденный иммунный ответ имеет решающее значение в борьбе с вирусами и играет ключевую роль в индукции и регуляции адаптивных иммунных ответов. По этой причине TLR-лиганды рассматриваются в качестве потенциальных адъ-ювантов для включения в вакцинные препараты. Предполагается, что одновременная доставка TLR-лиганда и представляющего интерес антигена более эффективна, чем вакцинация смесью адъюванта и антигена [28, 29].
Из полученных результатов видно, что введение мышам ЛПС Kb. способствует продукции IFN-P (рис. 7Д), а в крови мышей, инфицированных различными дозами вируса гриппа, контролирует его уровень. IFN-P способствует выработке антител клетками приобретенного иммунитета [26]. Результаты данной работы также показывают, что дополнительное введение ЛПС Kb. приводит к выработке антител в крови животных, инфицированных вирусом гриппа А (рис. 8, 9).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенной работы показано, что нетоксичный природный ЛПС Kb. способствует выработке иммуномодулирующего цитокина IFN-P как при самостоятельном введении, так и на фоне заражения штаммами вируса гриппа А/chicken/ Kurgan/5/2005 (H5N1) и A/Hamburg/2009 МА (H1N1), а также способствует образованию антител на НА этих штаммов в крови инфицированных животных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pebody R., Warburton F., Ellis J., Andrews N., Potts A., Cot-trell S., Johnston J., Reynolds A., Gunson R., Thompson C., et al. // Euro Surveill. 2016. V. 21. № 13. P. 30179.
2. McLean H.Q., Thompson M.G., Sundaram M.E., Kieke B.A., Gaglani M., Murthy K., Piedra P.A., Zimmerman R.K., Nowalk M.P., Raviotta J.M., et al. // J. Infect. Dis. 2015. V. 211. № 10.
P. 1529-1540.
3. Finberg R.W., Wang J.P., Kurt-Jones E.A. // Rev. Med. Virol. 2007. V. 17. № 1. P. 35-43.
4. Kawai T., Akira S. // Immunity. 2011. V. 34. № 5. P. 637-650.
5. Yang H., Antoine D.J., Andersson U., Tracey K.J. // J. Leukoc. Biol. 2013. V. 93. № 6. P. 865-873.
6 Sakabe S., Iwatsuki-Horimoto K., Takano R., Nidom C.A., Le M.Q., Nagamura-Inoue T., Horimoto T., Yamashita N., Kawao-ka Y. // J. Gen. Virol. 2011. V. 92. № 6. P. 1428-1434.
7. Leung Y.H., Nicholls J.M., Ho C.K., Sia S.F., Mok C.K., Valkenburg S.A., Cheung P., Hui K.P., Chan R.W., Guan Y., et al. // J. Gen. Virol. 2014. V. 95. № 9. P. 1870-1879.
8. Shirey K.A., Lai W., Scott A.J., Lipsky M., Mistry P., Pletneva L.M., Karp C.L., McAlees J., Gioannini T.L., Weiss J., et al. // Nature. 2013. V. 497. № 7450. P. 498-502.
9. Wang H., Bloom O., Zhang M., Vishnubhakat J.M., Ombrellino M., Che J., Frazier A., Yang H., Ivanova S., Borovikova L., et al. // Science. 1999. V. 285. № 5425. P. 248-251.
10. Alleva L.M., Budd A.C., Clark I.A. // J. Immunol. 2008. V. 181. № 2. P. 1454-1459.
11. Liu Q., Zhou Y., Yang Z. // Cell Mol. Immunol. 2016. V. 13. № 1. P. 3-10.
12. Прохоренко И.Р., Грачев С.В., Зубова С.В. Патент на изобретение RU № 2392309 от 20.06.2010 г.
13. Кабанов Д.С., Серов Д.А., Зубова С.В., Грачев С.В., Прохоренко И.Р // Биохимия. 2016. Т. 81. № 3. С. 401-409.
14. Warren H.S., Fitting C., Hoff E., Adib-Conquy M., Beasley-Topliffe L., Tesini B., Liang X., Valentine C., Hellman J.,
Hayden D., Cavaillon J.M. // J. Infect. Dis. 2010. V. 201. № 2. P. 223-232.
15. Munford R.S. // J. Infect. Dis. 2010. V. 201. № 2. P. 175-177.
16. Махнева З.К., Вишневецкая Т.А., Прохоренко И.Р. // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 4. С. 444-447.
17. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».
18. Shirey K.A., Lai W., Patel M.C., Pletneva L.M., Pang C., Kurt-Jones E., Lipsky M., Roger T., Calandra T., Tracey K.J., et al. // Mucosal. Immunology. 2016. V. 9. № 5. P. 1173-1182.
19. Mogensen T.H., Paludan S.R. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. V. 65. № 1. P. 131-150.
20. Lai C., Wang X., Yang P. // Clin. Microbial. 2014. V. 3. № 3. P. 147-149.
21. Betakova T., Kostrabova A., Lachova V., Turianova L. // Curr. Pharm. Des. 2017. V. 23. № 18. P. 2616-2622.
22. Williams L., Bradley L., Smith A., Foxwell B. // J. Immunol. 2004. V. 172. № 1. P. 567-576.
23. Saraiva M., O'Garra A. // Nat. Rev. Immunol. 2010. V. 10. № 3. P. 170-181.
24. Yu X., Zhang X., Zhao B., Wang J., Zhu Z., Teng Z., Shao J., Shen J., Gao Y., Yuan Z., Wu F. // PLoS One. 2011. V. 6. № 12. P. e28680.
25. Blok D.C., van der Sluijs K.F., Florquin S., de Boer O.J., van't Veer C., de Vos A.F., van der Poll T. // PLoS One. 2013. V. 8. № 3. P. e58191.
26. Proietti E., Bracci L., Puzelli S., Di Pucchio T., Sestili P., De Vincenzi E., Venditti M., Capone I., Seif I., De Maeyeret E., et al. // J. Immunol. 2002. V. 169. № 1. P. 375-383.
27. Cox R.J. // Hum. Vaccin. Immunother. 2013. V. 9. № 2. P. 405-408.
28. Blander J.M., Medzhitov R. // Science. 2004. V. 304. P. 10141018.
29. Blander J.M. // Trends Immunol. 2007. V. 28. № 1. P. 19-25.
