CC BY
202
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 149, кн. 2 Естественные науки 2007
УДК 582.282.22
ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА СЕМЯН ПИВОВАРЕННОГО ЯЧМЕНЯ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ОБРАБОТКИ ИХ ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ МИКРОБНОЙ ПРИРОДЫ
А.В. Черемных, С.Ю. Егоров, Ф.Г. Куприянова-Ашина
Аннотация
Установлено, что на внешних и внутренних тканях семян ячменя присутствуют различные виды микроскопических грибов.
Обработка семян ячменя культуральной жидкостью ризобий вызывала изменения в структуре комплекса микромицетов в сторону уменьшения фитотоксичных и фитопатогенных видов микромицетов. Показано положительное влияние жидкости ЯИіюЬіит теїіїоґі на энергию прорастания семян и их всхожесть, что обусловлено антагонистической активностью метаболитов клубеньковых бактерий в отношении фитопатогенных микромицетов. Показано, что под действием ауторегулярного фактора ^ существенно подавляется рост и развитие отдельных представителей комплекса микромицетов на зернах ячменя.
Введение
В настоящее время значительная часть урожая зерновых культур гибнет от болезнетворных микроорганизмов. Так, в Республике Татарстан возбудителями заболеваний поражается до 30-40% ячменя, который является важной зернофуражной культурой, применяемой в пищевой, пивоваренной и спиртовой промышленностях [1]. В производстве пива ячменный солод служит основным сырьем, и качество этого напитка в значительной мере зависит от инфицирован-ности зерен ячменя фитопатогенными микроорганизмами. Семена ячменя, богатые белками, углеводами и минеральными веществами, представляют собой идеальную среду для развития на них возбудителей различных заболеваний, приводящих к снижению всхожести и энергии прорастания семян, изменению их цвета, запаха, влажности, содержания экстрактивных веществ, а в итоге -к ухудшению качества конечного продукта.
Группа фитопатогенных микроорганизмов, поражающих зерна, разнообразна. В настоящее время известно, что среднемировой уровень потерь урожая вследствие поражения посевов фитопатогенными микроорганизмами оценивается в пределах 15-20%. Из всех известных ныне инфекционных болезней растений 83% вызываются грибами, 9% - вирусами и 7% - бактериями [2, 3]. Среди микроорганизмов, заселяющих семена зерновых культур, встречаются как сапротрофные, так и патогенные формы, многие из которых являются фитотоксичными. Сапротрофные микроорганизмы выявляются почти во всех партиях семян и численно преобладают. В определенных условиях некоторые из них
переходят к паразитированию, частично или полностью разрушая зерно, изменяя его физические свойства и состав. Особенно значительный вред сапротро-фы наносят в период хранения зерна, снижая его качество и даже вызывая гибель.
В арсенале мер борьбы против фитопатогенных микроорганизмов химическая защита растений пока занимает ведущее место, несмотря на то, что с увеличением масштабов применения и расширения спектра ядохимикатов растет число устойчивых к ним фитопатогенных микроорганизмов. Кроме того, действие химических препаратов, как правило, губительно сказывается не только на вредных, но и на полезных микроорганизмах, необходимых для получения высоких урожаев. В связи с указанными недостатками химического способа защиты растений в настоящее время долгосрочной стратегией растениеводства является поиск экологически безопасных эффективных биологических путей защиты растений от болезнетворных микроорганизмов. Применение биологического метода защиты растений является экологически выгодным способом интенсификации сельскохозяйственного производства, так как позволяет снижать численность популяции патогенных видов микроорганизмов с минимальными нарушениями структуры биоценоза.
Перспективными в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами могут явиться продукты жизнедеятельности микробных культур, способные угнетать жизнеспособность, снижать численность фитопатогенов с минимальными нарушениями структуры биоценоза. В этом аспекте представляется интересным использование культуральной жидкости клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti, продукты метаболизма которых обладают антагонистическими свойствами в отношении ряда микромицетов [4-6]. Не менее интересными являются ауторегуляторные факторы di, секретируемые микроорганизмами в процессе их роста и развития [7, 8]. Эти низкомолекулярные алкилоксибензольные (АОБ) соединения, известные как ауторегуляторы физиологического состояния микроорганизмов, в определенных концентрациях индуцируют переход клеток в гипометаболическое (некультивируемое) состояние. Выше сказанное делает возможным применение этих соединений в качестве биологических средств борьбы против болезнетворной микрофлоры семян растений.
Целью работы было исследование микрофлоры зерен пивоваренного ячменя с определением количественного и качественного составов возбудителей заболеваний и оценка эффективности обработки семян ячменя препаратами микробного происхождения.
Условия эксперимента
Объектом исследования служили зерна ячменя, используемые на Казанском пивоваренном заводе АО «Красный Восток», сорт «Зазерский-85».
В качестве биопрепаратов использовали: 1) культуральную жидкость Rhizobium meliloti, 2) ауторегуляторный фактор d1 бактерий. Культуру с исходной плотностью 5-104 кл/мл питательной среды выращивали до начала стационарной фазы роста. В предварительных опытах установили, что наиболее эффективной является культуральная жидкость в разведении 1 : 5. В качестве d1-фак-тора использовали химический аналог (гексилрезорцин, Sigma мол. масса = 196).
Использовали метод наружного осмотра зерен ячменя основанный на выявлении патологических изменений сухих семян: пятнистости, язвы, черноты зародыша, «плесени» на оболочке и т. д.
Метод отмывки зерен ячменя использовали для удаления с поверхности спор грибов (головневых грибов, ржавчины и др.), а микроскопия промывных вод позволяет судить о возбудителях болезни в посевах культуры предыдущего года и о возможности заражения нового посева возбудителями заболеваний растений.
Количественный учет микроорганизмов на поверхности семян ячменя проводили путем анализа поверхностной микрофлоры в смывах стерильной дистиллированной водой. Для выявления внутренней микрофлоры семян анализировали гомогенаты отмытых зерен в дистиллированной воде. Суспензии высевали на поверхность мясо-пептонного агара (МПА) или картофельно-глю-козный агар (КГА) в чашках Петри [9].
Биологический метод, основанный на стимуляции роста и развития микроорганизмов, применяли для определения зараженности зерен грибами и бактериями, особенно при скрытой внутренней инфекции семян. Перед закладкой на питательную среду семена дезинфицировали для уничтожения поверхностной инфекции. В этих условиях микроорганизмы начинают развиваться и из зараженных семян переходят на субстрат, на котором образуют хорошо заметные колонии.
Пораженность семян плесневыми грибами определяли по методу Пуйпене [10], бактериальную инфекцию на семенах - по Коробко [11], микрофлору внутренних тканей зерен ячменя - по методу Наумова [12, с. 60-85].
При изучении структуры комплекса грибов определяли видовой состав организмов определенной трофической группы и устанавливали значимость вида по критерию его встречаемости и (или) обилия. Для оценки типичности вида и его положения в структуре доминирования применяли критерий частоты встречаемости микромицета, под которым понимают отношение числа образцов, в которых вид обнаружен, к общему числу исследованных образцов. Типичные доминирующие виды: пространственная и временная частоты встречаемости выше 60%; типичные частые: пространственная и временная частоты - более 30%; типичные редкие: пространственная и временная частоты - ниже 30% и выше 10%. У случайных видов оба показателя ниже 10% [13].
Видовую и родовую принадлежности микромицетов устанавливали с помощью определителей [14-16].
Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием построения доверительных интервалов (х ± 2s). 95%-ные доверительные интервалы для долей строили, используя биномиальное распределение.
Результаты и обсуждение
Изучение качественного и количественного составов фитопатогенных микроорганизмов внешних и внутренних тканей зерен ячменя выявило большое их разнообразие и было определено нами до вида. Обнаружено 13 различных видов микромицетов, из которых локализованных на поверхности семян оказалось 13, а внутри - 8 видов. Каждый тип зерна характеризовался своеобразием состава
комплекса микромицетов, который был описан нами на основе пространственной частоты встречаемости видов. Это дало возможность выявить типичные доминантные, типичные частые, редкие и случайные виды микромицетов. Полученные данные такого дифференцированного подхода к изучению комплекса фитопатогенных грибов служили мерой для сравнения обсемененности различных типов семян микромицетами и эффективности их обработки биопрепаратами.
Было установлено, что доминирующее положение среди поверхностной и внутренней микрофлоры семян ячменя занимают сапротрофы - представители родов Penicillium, Aspergillus, а также некоторые фитопатогенные микромице-ты: Bipolaris gramineum - возбудители гельминтоспориозов (индуцируют пятнистости, корневые гнили, сажистые налеты на колосьях и семенах), Alternaria alternate, Alternaria tenius - возбудители альтернариозов (заболевания «черный зародыш»).
С высокой частотой встречаемости на внешней поверхности и во внутренних тканях зерен обнаруживались как представители сапротрофов (Aspergillus), так и представители фитопатогенных грибов: Botrytis вызывают плесневение семян; Fusarium - корневые гнили, трахиомикоз; Trichothecium - продуцент фитотоксинов; Bipolaris - возбудитель гельминтоспориозов.
К группе типичных редких видов относились сапротрофы: Penicillium va-rians, Penicilium notatum, Aspergillus fumigatus, Mucor fragilis и фитопатоген Oospora species. Таким образом, нами выявлены опасные возбудители заболеваний ячменя, относящиеся к родам: Alternaria, Botrytis, Fusarium, Trichothe-cium, Bipolaris.
После определения количественного и качественного составов микроорганизмов на семенах ячменя, последние в лабораторных условиях подвергали обработке культуральной жидкостью Rhizobium meliloti. Установлено, что метаболиты клубеньковых бактерий проявляют антагонистическую активность в отношении большого количества грибов, выделенных с поверхности и внутренних тканей семян ячменя. На рис. 1 представлены результаты измерения зон роста вокруг лунок, в которые внесена культуральная жидкость. По зонам роста судили об интенсивности подавления роста микромицетов, выделенных из семян ячменя.
Как оказалось, наиболее выраженное антагонистическое действие ризобий проявлялось по отношению к грибам родов: Bipolaris, Fusarium, Oospora, Tri-hotecium, Botrytis и несколько меньшее ингибирующее действие - к грибам родов: Alternaria, Aspergillus, Penicillium.
Анализ структуры сообщества микромицетов внешних и внутренних тканей семян ячменя после обработки их культуральной жидкостью показал, что фитопатогенные грибы Bipolaris gramineum, Alternaria tenius, Alternaria alter-natа из группы доминирующих перешли в группу типичных редких. Грибы Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, встречающиеся до обработки в группе типичных частых, также перешли в группу редких. Фитопатогенные грибы Trichothecium roseum, Bipolis sorokiniana и Oospora species после воздействия на семена культуральной жидкостью ризобий не были обнаружены ни в одной из групп. Вместе с тем сапротрофы родов Mucor и Aspergillus из группы типичных редких перешли в группу частых, а Penicillium species_Aspergillus niger, Penicillium varians не реагировали на обработку семян.
Тест объект
Рис. 1. Антагонистическая активность ЯИііоЬіит шеіііоґі в отношении фитопатогенных микромицетов, выделенных из семян ячменя
Существенно, что снижение числа видов микромицетов на поверхности и внутренних тканях зерен ячменя после обработки их культуральной жидкостью ризобий коррелирует с уменьшением количества фитотоксических и фитопатогенных видов микромицетов. Это позволяет оценить фитосанитарный риск повреждения зерен ячменя болезнетворными микроорганизмами и определить, какой вклад вносит обработка семян ячменя биопрепаратами в перераспределение фитопатогенных микроорганизмов как за счет снижения частоты встречаемости доминирующих видов, так и за счет уменьшения встречаемости редких видов.
В связи с обнаружением изменений обсемененности семян ячменя после обработки их культуральной жидкостью было изучено влияние продуктов жизнедеятельности ризобий на энергию прорастания и всхожесть семян пивоваренного ячменя. Для этого зерна замачивали в культуральной жидкости бактерий стационарной фазы роста при разведении ее 1 : 5. Установлено, что метаболиты клубеньковых бактерий оказывают положительное влияние на семена ячменя, что выражается в повышении энергии прорастания семян и их всхожести (табл. 1). Стимулирующее действие культуральной жидкости клубеньковых бактерий, очевидно, обусловлено не только ее антагонистическими свойствами, но и содержанием в ней продуктов метаболизма фитогормональной природы. В совокупности это положительно сказывается на прорастании зерен ячменя, что очень важно при солодоращении в процессе изготовления пива.
На следующем этапе работы для защиты растений от болезнетворных микроорганизмов мы использовали фактор ^ (гексилрезорцин) в разных концентрациях и при обработке зерен ячменя исследуемым раствором в течение 10, 30 и 60 мин. Как показано в табл. 2, 10-минутное воздействие 1%-ным раствором фактора ^ на семена приводило к резкому снижению частоты встречаемости доминирующих видов. Все они, за исключением А. niger, перешли в разные группы: М. fragilis - в группу частых, Г оxysporum - в группу редких, а ЯНію
Табл. 1
Влияние метаболитов КЫ2оЬшт тгЫоИ на энергию прорастания и всхожесть семян ячменя (пересчет на 100 проростков)
Вариант Энергия прорастания, % Всхожесть, %
Контроль 1, (вода) 38.9 і 1.41 46.2 і 1.37
Контроль 2, (среда) 41.8 і 1.63 50.3 і 1.80
Опыт (культуральная жидкость) 71.3 і 2.11 79.5 і 2.24
Табл. 2
Структура комплекса микромицетов зерен ячменя, обработанных 1%-ным раствором фактора ^ в течение 10 мин
Микромицеты Частота встречаемости видов микромицетов
Типичные доминирующие, 60-100% Типичные частые, 30-60% Редкие, 10-30%
A. alternata F. oxysporum А . niger A. fumigatus М. Fragilis P. species B. cinerea P. lilacinus 79 і 1.09 35 і 1.69 25 і 0.25 21.67 і 0.31 20 і 0.82 20 і 0.81 20 і 0.84 30 і 1.16
pus oryzae вообще не был обнаружен. Вместе с тем, встречаемость части редких (A. fumigatus, P species) и частых видов (A. аlternata, B. cinerea, Peacilomyces lilacinus) снизилась по сравнению с контролем незначительно (в пределах 10%).
30-минутная обработка зерен 0.7%-ным раствором фактора d1 также привела к перегруппировке в структуре комплекса грибов. Все микромицеты, за исключением A. niger, частота встречаемости которого снизилась лишь на 5%, перешли в группу редких и случайных видов. Присутствие фитопатогенных видов (F. oxysporum, B. sorokiniana, A. alternata, B. cinerea)и сапротрофных (M. fragilis, A. flavus, Rh. oryzae, P. purpurogenum) не обнаружено (табл. 3). Интересным является обнаружение в этих условиях опыта в комплексе микромицетов гриба Trichoderma harzianum, который в контроле вообще не выявлялся. По данным литературы, грибы рода Trichoderma являются известными антагонистами многих возбудителей заболевания растений.
Многочисленными исследованиями показано комплексное влияние этого микроорганизма на растения, фитопатогенные грибы и состояние почвы. Во-первых, представители рода Trichoderma продуцируют ряд активных антибиотиков, газообразные летучие вещества, обладающие антигрибными и антибактериальными свойствами, являются продуцентами комплекса ферментов (глю-каназы, хитиназы, геликазы), разрушающих клеточные стенки фитопатогенных микроорганизмов. Во-вторых, отдельные виды и штаммы триходермы обладают ростостимулирующим действием на растения, улучшают обмен, ускоряют прорастание семян, увеличивают валовый выход урожая и улучшают качество продукции [17, 18].
Табл. 3
Структура комплекса микромицетов зерен ячменя, обработанных 0.7%-ным раствором фактора ^ в течение 30 мин
Микромицеты Частота встречаемости видов микромицетов
Типичные доминирующие, 60-100% Типичные частые, 30-60% Редкие, 10-30% Случайные, до 10%
А. niger А. fumigatus Р. purpurogenum Р. іюН^ш Т. harzianum Р. Н^стт 95.5 ± 2.38 23.75 ± 0.73 25 ± 0.45 26 ± 0.38 20 ± 0.18 7 ± 0.14
Табл. 4
Структура комплекса микромицетов зерен ячменя, обработанных 0.5%-ным раствором фактора ^ в течение 60 мин
Микромицеты Частота встречаемости видов микромицетов
Типичные доминирующие, 60-100% Типичные частые, 30-60% Редкие, 10-30% Случайные, до 10%
В. sorokiniana А. niger А. fumigatus Р. 8РЄСІЄ8 Т. harzianum Р. Н^стт 87.5 ± 2.78 37.5 ± 1.39 11 ± 0.32 15 ± 0.65 7 ± 0.21 10 ± 0.46
Определение структуры комплекса микромицетов, выделенных с семян ячменя после 60-минутной обработки 0.5%-ным раствором фактора ^, показало, что происходит снижение не только количества всех структурных единиц комплекса, но и уменьшение количества видов, которыми он представлен. В этом случае доминировал А. niger, а частота встречаемости большинства видов (Р. purpurogenum, А. fumigatus, В. sorokiniana, Peacilomyces Іііасіпш) была невелика, менее 30%. Лишь Trichoderma с частотой встречаемости 37.5% относилась к группе частых (табл. 4).
Ранговые распределения различных представителей комплекса микроми-цетов по частотам их встречаемости и по разнообразию видов также регистрируют различия в структуре грибных комплексов до обработки (контроль) и после воздействия на них фактором ^ (опыт). В отличие от контроля 30-минутная обработка фактором ^ привела к снижению частоты встречаемости видов в 2 раза, хотя общее видовое разнообразие снизилось незначительно (рис. 2).
Интерпретируя полученные нами данные относительно регуляторного действия фактора ^ на структуру комплекса микромицетов зерен ячменя, можно полагать, что эффект АОБ обусловлен не только угнетением роста микроорганизмов и уменьшением численности микробных клеток. По-видимому, причина кроется и в выщеплении клонов, а именно в увеличении доли минорных
виды микромицетов
□ 0.7%, 30 мин
^ Ю0 т-------------------------------------------------------------------------------------- ^
виды микромицетов
-Л'
# f $ ^
Г
-О4
/ ^ ^
»v Ж if' .ж .<f
J-
А
</ 0/ >'
.•Г .«,<> ^ х4
/ / f / /у / #‘v f / /\/,/' ,‘
b v v .IV -ЛР ^ ^e> fc£V W w _^Y
V> у
.„4° у
>/ ./
\
*0' A* fi ^ /
виды микромицетов
Рис. 2. Ранговое распределение различных представителей комплекса микромицетов по частотам их встречаемости, выделенных с зерен ячменя после обработки фактором ^
клеток в популяции, характеризующихся низкой скоростью роста. Это свойство реализуется через стабилизацию клеточных мембран и макромолекул в их комплексе с АОБ [7].
Таким образом, наблюдаемое под действием биопрепаратов изменение структуры комплекса микромицетов можно рассматривать как регулирование процесса перехода микроорганизмов в гипометаболическое состояние. Выявленное изменение структуры микромицетов на семенах ячменя, обработанных препаратами микробной природы, может быть следствием преобразования вегетативных клеток в покоящиеся (некультивируемые) формы, временно утратившие способность к размножению. Изменение численности и видового разнообразия микроорганизмов в наружных и внутренних тканях семян ячменя, обусловленное ростостимулирующим или угнетающим действием исследуемых биопрепаратов, может быть сопряжено с процессами вытеснения, доминирования или сосуществования отдельных видов микроорганизмов в смешанных культурах, обитающих на зернах ячменя.
Summary
A.V. Cheremnyh, S.U. Egorov, F.G. Kypriyanova-Ashina. The phytopathological expertise of the beer barley seeds and the efficacy of their treatment with an ecologically safe microbial substances.
The presence of various species of microscopic fungi both on the external and internal tissues of the barley seeds was established.
The barley seeds treatment by the cultivative liquid Rhizobium leaded to decreasing of phytotoxic and phytopathogenic species of mycromyces. It was shown a positive influence of the Rhizobium meliloti liquid on the seeds germinating energy and their sprout due to the antagonistic activity of the Rhizobium metabolits concerning to the phytopathogenic micromy-ces. It was found that the treatment of the barley seeds by the di-factor leaded to decrease of the structural units of the micromyces complex and reduction the quantity of species.
Литература
1. Чулкина В.А., Торопова Е.Ю. Научное и практическое обеспечение защиты растений на пороге ХХ1 века // Агро ХХ1. - 2000. - № 6. - С. 35-40.
2. Perkowski J., Kiecana I., Chelkowski J. Susceptibility of barley cultivars and lines to Fusarium infection and mycotoxin accumulation in kernels // J. Phytopathol. - 1995. -V. 143, No 9. - Р. 41-46.
3. RichardsonM.J. Seed mycology // Mycol. Res. - 1996. - V. 100, No 4. - Р. 385-392.
4. Chao W.-L. Antagonistic activity of Rhizobium spp. Against beneficial and plant pathogenic fungi // Lett. Appl. Microbiol. - 1990. - V. 10, No 5. - Р. 213-215.
5. Бутвина О.Ю., Толкачев Н.З., Князев А.В. Высококонкурентные штаммы клубеньковых бактерий - основа эффективности биопрепаратов // Микробиол. журн. -1997. - Т. 59, № 4. - С. 123-130.
6. Наумова Э.С. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность и симбиотические свойства Rhizobium meliloti: Дис. ... канд. биол. наук. - Казань: Казан. гос. ун-т, 1998. - 115 с.
7. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Капрельянц А.С., Островский Д.Н., Козлова А.Н., Вавер В.А., Симонова Т.Н., Хохлова Ю.М., Пропин С.В., Дужа M.B., Поплаухи-на О. Т. Регуляция роста и развития микроорганизмов специфическими ауторегуляторными факторами // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов. -Пущино: НЦБИ АН СССР, 1979. - С. 280-290.
8. Нгуен Тхи Тху Хыонг, Шаненко Е.Ф., Попов М.П., Эль-Регистан Г.И. Действие ауторегуляторного фактора d1 на накопление ферментов в рисовом солоде // Пивоварение. - 1999. - № 3. - С. 23-27.
9. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропром-издат, 1990. - 240 с.
10. Пуйпене И.К., Григалюнайте Б.И. Микромицеты и бактерии, выделенные из семян различных сортов капусты // Науч. достиж. микробиол. нар. хоз-ву. Ч. 2. - Виль-нус, 1988. - С. 94-96.
11. Коробко А.П. Новые возможности микробиометода // Защита и карантин растений. - 1997. - № 5. - С. 8-9.
12. НаумовА.Н. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. - Л.: Агро-промиздат, 1970. - 208 c.
13. Мирчинк Т.Г. Почвенная микробиология. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 220 с.
14. Билай В.И. Фузарии. - Киев: Наук. думка, 1974. - 442 с.
15. Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и Deiteromycetes). -Киев: Наук. думка, 1977. - 126 с.
16. Билай В.И., Курбатская З.А. Определитель токсинобразующих микромицетов. -Киев: Наук. думка, 1990. - 233 с.
17. Бондаренко А.И., Буймистру Л.Д., Николаева СИ. Биологический метод защиты растений от заболеваний // Защита и карантин растений. - 1989. - № 5. - С. 44-50.
18. Игнатова СИ., Багирова С.Ф. Антогонисты патогенных микроорганизмов филло-сферы // Защита и карантин растений. - 1998. - № 2. - С. 32-34.
Поступила в редакцию 18.07.06
Черемных Антон Владимирович - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: anton-cherem@mail.ru
Егоров Сергей Юрьевич - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: Sergey.Egorov@ksu.ru
Куприянова-Ашина Флера Гарифовна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
