CC BY
15// Российский журнал гастроэнтерологии. - 2004. -Т. XIV. - 2. - С. 4-8
2. Болезни печени и желчевыводящих путей: Руководство для врачей под редакцией В.Т. Ивашкина. - 2002.
3. Галимова С.Ф., Надинская М.Ю., Маев-ская М.В., Ивашкин В.Т. Новые данные о диагностике и течении фиброза печени // Рос. Журнал га-строэнтеролгии, гепатологии, колонопроктологии -
2001. - № 4. - С. 22-28.
4. Дешко О.А., Алексанина Ю.В., Беляева Е.А. Повышение уровня трансаминаз у пациентов с хроническими ревматологическими заболеваниями суставов. // Сборник материалов V съезда ревматологов России (тезисы). №134. С. 38.
5. Камалов Ю.Р., Сандриков В.А., Крыжа-новская Е.Ю., Цирульникова О.М. Ультразвуковые доплеровские параметры печеночного кровотока при циррозе печени: зависимость от стадии по Чайлд и степени расширения варикозных вен пищевода: Сб. научных трудов РНЦХ «Ультразвуковая, лучевая и функциональная диагностика». - М.,
2002. - С. 162-163.
6. Клиническая ревматология: Руководство для практических врачей под редакцией проф. В.И. Мазурова. - СПб.: Фолиант. - 2010. - 415 с.
7. Лила А.М., Новик А.А. Роль иммунологических нарушений в патогенезе ревматических
болезней: Иммунодефицитные состояния. Под редакцией проф. В.С. Смирнова и проф. И.С. Фрей-длин. - СПб.: Фолиант. - 2000. - С. 189-235.
8. Макаров В.К. - Новый способ диагностики поражений печени // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - № 12. - С. 8-10.
9. Масевич Ц.Г., Ермолаева Л.Г. Клинические, биохимические и морфологические особенности хронических гепатитов различной этиологии // Терапевтический архив. - 2002. - № 2. - с. 35-37.
10. Ревматология: национальное руководство / под ред. Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой, - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008.-720 с.
11. Северов М.В., Минакова Е.Г., Макаров А.В., Фатхудинов Т.Х., Северова М.М. Фиброз печени - новая страница в клинической гепатологии // Клиническая фармакология и терапия. - 2003.-№12 (1). - С.27-31.
12. Тотров И.Н., Антониади И.В., Еналдиева Р.В., Амбалова С.А., Медоева А.А., Купеева А.М., Албегова З.А. Синдромы патологии гепатобилиар-ной системы при ревматоидном артрите // Владикавказский медико-биологический вестник. - 2015.-Т.21.Вып.33 (3).- С.48-54.
13. Тотров И.Н., Хетагурова З.В. Механизмы развития остеопороза у больных ревматоидным артритом. Владикавказ, 2011, 127 с.
ФИТОКОРРЕКЦИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПОТИРЕОЗЕ
Лемза С.В.
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН г. Улан-Удэ,
к.б.н., старший научный сотрудник Хамаева Н.А.
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН г. Улан-Удэ,
аспирант Торопова А.А.
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН г. Улан-Удэ,
к.б.н., научный сотрудник Петров Е.В.
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН г. Улан-Удэ,
к.фарм.н., научный сотрудник
PHYTOCORRECTION OF THE WHITE RAT HEAD BRAIN CELLS ENERGY STATUS IN EXPERIMENTAL HYPOTHYREOSIS
Lemza S. V., Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude, PhD, senior researcher
Khamaeva N.A., Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude, postgraduate student
Toropova A.A., Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude, PhD, scientific researcher
Petrov E. V., Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude, PhD, scientific researcher
АННОТАЦИЯ
В работе рассмотрено влияние растительного средства «Тиреотон» на энергетический статус клеток головного мозга белых крыс при экспериментальном гипотиреозе, который оценивали по содержанию внутриклеточного АТФ, активности ферментов энергитического метаболизма (пируваткиназа, Н+-АТ-Фаза) и показателям митохондриального дыхания (V40 - субстратное дыхание, V3i- АДФ-стимулируемое дыхание, V41- дыхание в состоянии покоя, коэффициенты стимуляции дыхания, дыхательного контроля и фосфорилирования - АДФ:0). Установлено, что исследуемое фитосредство повышало активность пи-руваткиназы в 1,7 раза, Н+-АТФазы почти в 2 раза по сравнению с данными у крыс контрольных групп,
что отразилось на увеличении содержания внутриклеточного АТФ на 48%. Таким образом, исследуемое фитосредство «Тиреотон» обладает энергопротективным действием усиливая интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в клетках головного мозга белых крыс при экспериментальном гипотиреозе.
ABSTRACT
The paper deals with the influence of phytoremedy «Tireoton» on white rat brain cell energy status in experimental hypothyreosis which was estimated by the content of intracellular ATP, activities of energy metabolism enzymes (pyruvate kinase, H+-ATPase), and mitochondrial respiration parameters (V40 - substrate-dependent respiration, V3i- ADP-stimulated respiration, V4i- resting respiration, respiratory stimulation control ratio, respiratory control ratio and ADP:0 ratio). It has been found that the phytoremedy under study increased pyruvate kinase and H+-ATPase activities in 1.7 and approximately 2 times respectively compared to the corresponding values of control rats that was reflected on 48% increase of intracellular ATP content. Thus, «Tireoton» may be considered as an energy-protective phytoremedy which intensifies oxidative phosphorylation in white rat head brain cells in experimental hypothyreosis.
Ключевые слова: экспериментальный гипотиреоз, «Тиреотон», АТФ, пируваткиназа, Н+-АТФаза, митохондриальное дыхание.
Keywords: experimental hypothyreosis, «Tireoton», ATP, pyruvate kinase, H+-ATPase, mitochondrial respiration.
Заболевания щитовидной железы являются одной из наиболее распространенных форм эндокринной патологии и занимают второе место после сахарного диабета. По данным эпидемиологических исследований, в отдельных группах населения частота гипотиреоза достигает 10-12%, причем распространенность патологии увеличивается с 2% в возрасте 30-39 лет до 12% в возрасте 70-79 лет [1]. В России гипотиреоз встречается приблизительно с частотой 19 на 1000 у женщин и 1 на 1000 у мужчин [2].
Актуальность проблемы гипотиреоза в клинической практике врачей различных специальностей обусловлена тем, что при дефиците тиреоидных гормонов (ТГ), необходимых для нормального функционирования практически каждой клетки, развиваются тяжелые нарушения во всех без исключения органах и системах. Наиболее выраженные нарушения при гипотиреозе отмечаются со стороны центральной нервной системы вследствие её высокой чувствительности к дефициту ТГ. Гипотиреоз сопровождается нарастанием окислительного стресса в результате дестабилизации антиок-сидантной системы защиты организма и нарушением энергетического гомеостаза клеток головного мозга [3].
В настоящее время лечение гипотиреоза заключается в назначении заместительной гормональной терапии препаратами щитовидной железы крупного рогатого скота или, что чаще, синтетическими тиреоидными гормонами (тиреоидин, трийодтиронин, тироксин, тиреотом и др.). К сожалению, при гормональной терапии неизбежны побочные эффекты, приводящие к развитию сопутствующих гипотиреозу осложнений.
Учитывая это, одним из приоритетных направлений в современной фармакологии и эндокринологии является разработка новых лекарственных средств, в том числе на основе растительного сырья, не только тиреотропного, но и более широкого спектра действия. Известно, что препараты из растений по сравнению с синтетическими лекарствами имеют массу преимуществ: они содержат большое
количество биологически активных веществ, которые оказывают многостороннее действие на организм в целом, малотоксичны и не обладают выраженными побочными эффектами. В случае с гипотиреозом необходимо, чтобы препараты оказывали влияние на функциональную активность тиреоид-ных гормонов противостояли окислительному стрессу и поддерживали энергетический баланс клеток головного мозга.
В связи с этим было разработано средство в виде сухого экстракта из трёх видов растительного сырья: корней лапчатки белой (Potentilla alba L.), родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) и шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), взятых в соотношении 2:1:1, условно названное «Тиреотон», с целью изучения его влияния на течение экспериментального гипотиреоза. В настоящей работе основное внимание было сосредоточено на некоторых аспектах энергетического метаболизма в клетках головного мозга белых крыс при данной патологии.
Материалы и методы исследования
Работа была выполнена на 80 белых крысах Wistar обоего пола с исходной массой 160 - 200 г. Содержание животных и проведение экспериментов осуществлялись в соответствии с «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей».
Модель экспериментального гипотиреоза воспроизводили по методу Л.Г. Чугуновой [4] путем ежедневного перорального введения мерказолила (Акрихин, Россия) в дозе 10 мг/кг массы тела в течение 28 дней. После окончания введения мерказо-лила крысы опытной группы 1 получали внутриже-лудочно водный раствор «Тиреотона» в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг один раз утром в течение 21 дня. Животным опытной группы 2 вводили препарат сравнения «Эндокри-нол» («Эвалар», Россия) в форме настоя в эквивалентной дозе по схеме, аналогичной исследуемому фитосредству. Крысам опытной группы 3 за 30 минут до забоя вводили тетрайодтиронин в дозе 10
нг/кг внутрибрюшинно [5]. Животные интактной и контрольной (гипотиреоз) групп получали дистиллированную воду в эквиобъемном количестве по аналогичной схеме.
Энергетическое состояние клеток головного мозга оценивали по содержанию АТФ, активности пируваткиназы (ПК) и Н+-АТФ-азы. Концентрацию внутриклеточного АТФ определяли в гомоге-нате головного мозга по методу [6], активность ПК и Н+-АТФ-азы в митохондриальной фракции по методам описанным в [7].
Митохондрии головного мозга выделяли дифференциальным центрифугированием по методу А.В. Панова [8].
Функциональное состояние изолированных митохондрий оценивали полярографически с помощью электрода Кларка («Эксперт-001 МТХ», Россия) по скорости потребления кислорода в разных метаболических состояниях по Б. Чансу. Скорость потребления кислорода рассчитывали до внесения в систему АДФ (У4о), во время (УЗ1) и после (У40 цикла фосфорилирования добавленного АДФ (150 мкМ). В качестве субстратов окисления использовали комбинацию из глутамата (10 мМ), пирувата (2,5 мМ) и малата (2мМ). С целью оценки уровня окислительного фосфорилирования рассчитывались коэффициенты стимуляции дыхания (отношение У31 к У40) и дыхательного контроля ( отношение У31 к У41), а также АДФ:0 как показатель сопряженности окислительного фосфорилирования.
Нормальность распределения исходных данных оценивалась методом Шапиро-Уилка. В последующем статистическую обработку проводили с помощью пакета программ «Bюstat-2006» с использованием t-критерия Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при Р<0,05.
Результаты и обсуждение
Любые отклонения в работе щитовидной железы, связанные с увеличением или снижением продукции гормонов, сопровождаются нарушениями энергетического обмена [9].
Из таблицы 1 видно, что в контрольной группе животных происходит снижение содержания внутриклеточного АТФ на 23% по сравнению с данными в интактной группе животных, что указывает на то, что при экспериментальном гипотиреозе происходит угнетение энергопродукции и закономерно снижается энергетический потенциал клеток головного мозга. В опытной группе 1 на фоне введения «Тиреотона» содержание АТФ повышается на 48% по сравнению с контрольной группой и примерно сопоставимо с таковым показателем в опытной
группе 3. Содержание АТФ при введении препарата сравнения «Эндокринола» не отличается от его содержания у интактных животных. Что касается активности пируваткиназы, важнейшего гли-колитического фермента, участвующего в реакции субстратного фосфолирирования АДФ с образованием пирувата из фосфоенолпирувата и Н+-АТ-Фазы митохондрий, которая связывает гидролиз или синтез АТФ с трансмембранным перемещением протонов, то видно, что при введении испытуемого средства активность обоих ферментов повышалась: ПК в 1,7 раз, Н+-АТФазы - примерно в 2 раза по сравнению со значениями в контрольной группе животных. Ингибирование активности ферментов при окислительном стрессе - неизбежным при гипотиреозе - может происходить в результате нарушения окислительно-восстановительного баланса внутриклеточной среды и перекисной модификации липидного и белкового слоя мембран, что особенно важно для полноценного функционирования трансмембранных ферментов в том числе и Н+-АТФазы.
Следует отметить, что повышение активности пируваткиназы и Н+-АТФазы незамедлительно отразилось на содержании внутриклеточного АТФ, во-первых, в результате более быстрого превращения фосфоенолпирувата в пируват (активация ПК) и поступления его в цикл трикарбоновых кислот в виде ацетил-СоА, во-вторых, в результате увеличения трансмембранного переноса протонов, сопряженного с синтезом АТФ (Н+-АТФаза) за счет нормализации окислительно-восстановительных процессов в клетках под действием этих препаратов. Будучи аллостерическим ингибитором ПК, концентрация АТФ является фактором регулирующим активность этого фермента.
На фоне введения препарата сравнения «Эндо-кринола» активность ПК увеличилась в 1,6 раза, а активность Н+-АТФазы - в 1,8 раз в сравнении с показателями в контрольной группе. Введение гормона Т4 животным привело к более резкому увеличению активности ПК и Н+-АТФазы: в 2,6 и 2,5 раза соответственно по сравнению с контрольными значениями и приближались к интактным.
Таким образом, результаты исследований показали, что «Тиреотон» при курсовом введении крысам с гипотиреозом улучшает показатели энергетического метаболизма клеток головного мозга, нормализуя процессы окислительного фосфорили-рования и по своей эффективности не уступает препарату сравнения «Эндокринол», однако, уступает гормону Т4 в случае с активностью ПК значительно и умеренно - в случае с активностью Н+-АТФазы.
Таблица 1
Влияние «Тиреотона» на содержание АТФ, активность ПК и Н+-АТФазы в клетках головного мозга при _экспериментальном гипотиреозе в различных группах животных_
Группа животных n=8 Показатель
АТФ мкмоль/г ткани ПК нмоль НАДН/мин/мг белка Н+АТФ-аза мкмоль Pi /час/мг белка
Интактная 2,34±0,05 15,57±0,41 63,9±1,8
Контрольная 1,80±0,04* 5,78±0,46* 28,1±1,6*
Опытная 1 2,67±0,05f 9,87±0,28f 55,1±0,8f
Опытная 2 2,26±0,05f 9,29±0,46f 50,2±0,8f
Опытная 3 2,60±0,04f 15,11±0,42f 69,4±1,6f
Примечание: здесь и далее различия статистически значимы при Р<0,05 * - между интактной и контрольной группами, | - между контрольной и опытной группами.
В таблице 2 представлены результаты оценки влияния «Тиреотона», препарата сравнения «Эндо-кринол» и Т4 на показатели митохондриального дыхания при экспериментальном гипотиреозе.
Как видно из таблицы происходило снижение скорости потребления кислорода в состоянии субстратного дыхания V4o и на стадии активного фос-форилирования (УЗ^ в контрольной группе животных в 1,9 и 3,5 раза соответственно по сравнению с животными интактной группы. Снижение данных показателей возможно обусловлено нарушениями в работе электрон - транспортной цепи митохондрий. Действительно, известно, что при гипотиреозе формируется состояние окислительного стресса, при котором происходит накопление активных форм кислорода, инактивирующих мембранносвязанные ферменты дыхательной цепи.
Потребление кислорода в состоянии субстрат-зависимого дыхания (У40) и в состоянии У31 у леченных «Тиреотоном» животных повышается на
28% и 30%, а на фоне введения «Эндокринола» - в 2 и 2,2 раза соответственно по сравнению с митохондриями контрольных животных. Такой же эффект отмечается при введении гормона Т4: скорость окисления субстратов (V40) повышалась в 2,1 раза, а скорость фосфорилирования (V3:) в 2,3 раза по сравнению с контролем. В этом случае, вероятно, проявляется краткосрочный эффект гормона Т4, который реализуется через связывании дийод-тиронина (Т2) с 28 kDa c-Erb Aa1 белком внутренней мембраны митохондрий, стимулируя митохон-дриальное дыхание [10]. Потребление кислорода в состоянии V4i (состоянии покоя) в контрольной группе животных в 1,5 раза ниже по сравнению с интактом. Этот показатель при введении «Тирео-тона» не превышает контрольных значений, а на фоне введения «Эндокринола» и гормона Т4 он не значительно повышался.
Группа животных Показатель
V 40 V 31 V 41
Интактная 90,81±4,38 438,81±21,11 227,02±9,94
Контрольная 48,40±2,42* 125,03±5,88* 153,27±7,66*
Опытная 1 61,92±3,37f 162,21±8,83f 124,78±7,85
Опытная 2 93,25±5,98f 268,85±17,24f 157,50±10,10
Опытная 3 104,07±6,87f 285,72±15,86f 188,20±12,42f
Таблица 2
Влияние «Тиреотона», «Эндокринола» и Т4 на скорость потребления кислорода изолированными митохондриями клеток головного мозга белых крыс в различных метаболических состояниях при экспериментальном гипотиреозе
В таблице 3 представлены коэффициенты дыхательного контроля, стимуляции дыхания и отношение АДФ:О, которые были рассчитаны по соотношениям скоростей дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях по Б. Чансу.
Как видно из таблицы, отмечается снижение коэффициентов дыхательного контроля и стимуляции дыхания у контрольных животных в 2,4 и 1,9 раза соответственно по сравнению с интактом. При курсовом введении испытуемого фитосредства и препарата сравнения «Эндокринол» коэффициент ДК был выше в 1,6 и 2 раза соответственно по срав-
нению с его значениями в контрольной группе животных. На фоне введения гормона Т4 он превышал контрольные значения в 1,9 раза. Коэффициент СД при введения «Тиреотона», «Эндокринола» и гормона Т4 практически не отличался от контрольных значений. Известно, что отношение АДФ:О используется в качестве индикатора эффективности или сопряженности окислительного фосфорилирова-ния с митохондриальным дыханием. Это отношение в контрольной группе животных снижалось в 1,7 раз по сравнению с интактной группой животных, что в целом свидетельствует о более низкой эффективности окислительного фосфорилирования
в изолированных митохондриях головного мозга крыс больных гипотиреозом. При введении препарата сравнения «Эндокринол» данный показатель повышался в 1,4 раза, при курсовом введении «Ти-реотона» - в 1,6 раза, как и при введении гормона Т4, что свидетельствует о повышении сопряженности митохондриального дыхания. По-видимому,
это связано с ингибированием процессов свободно-радикального окисления мембранных структур митохондрий, что ведет к восстановлению активности мембраносвязанных ферментов дыхательных комплексов.
Таблица 3
Влияние «Тиреотона», «Эндокринола» и Т4 на стимуляцию дыхания, коэффициент дыхательного контроля и АДФ:0 в митохондриях клеток головного мозга белых крыс при экспериментальном гипотиреозе
Группа животных Показатель
ДК СД АДФ:О
Интактная 1,93±0,09 4,83±0,23 3,68±0,18
Контрольная 0,82±0,04* 2,58±0,13* 2,22±0,11*
Опытная 1 1,30±0,07 2,62±0,14 3,54±0,19
Опытная 2 1,71±0,07 2,88±0,15 3,11±0,20
Опытная 3 1,52±0,10 2,75±0,18 3,58±0,24
Таким образом, исследуемое фитосредство «Тиреотон» обладает энергопротективным действием, усиливая интенсивность процессов окислительного фосфорилирования в клетках головного мозга белых крыс при экспериментальном гипотиреозе за счёт нормализации окислительно - восстановительного гомеостаза клеткок, обусловленного, как было ранее установлено [11, 12], выраженными антиоксидантными свойствами фитоэкстракта.
Литература
1. Hollowell J.G., Staehling N.W., Flanders W.D. et al. Serum TSH, T(4), and thyroid antibodies in the United States population (1988 to 1994): National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III)// J. Clin. Endocrinol. Metab., V.87, №2, 2002. pp. 489-499.
2. Мишагин В. А. Эндонорм в лечении гипоти-реоза//Врач, №8, 2014. С. 78-80.
3. Belanger M., Allaman I., Magistretti P.J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation//Cell Metabolism, V.14, 2011. pp. 724-738.
4. Чугунова Л.Г., Рябков А.Н., Савилов К.В. Способ моделирования гипотиреоза//Патент №2165648 Российская Федерация. МПК G 09 В 23128, А 61 К 31/4164.
5. Sterling K., Brenner M.A. Thyroid hormone action: effect of triiodothyronine on mitochondrial ade-ninenucleotide translocase in vivo and in vitro//Metab-olism, V. 44, №.2, 1995, pp. 193-199.
6. Методы биохимических исследований (Под ред. М.И. Прохоровой.) - Л.: 1982. - 272 c.
7. Практикум по биохимии (Под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьевой) - М.: 1989. - 509 с.
8. Панов А.В. Практическая митохондриоло-гия. Новосибирск: 2015. - 240 с.
9. Katyare S.S., Rajan R.R. Influence of thyroid hormone treatment on the respiratory activity of cerebral mitochondria from hypothyroid rats. A critical re-assesment//Experimental Neurology, V. 195. 2005. pp. 416-422.
10. Лобырева О.В. Тиреоидный статус и его влияние на активность окислительных фермен-тов//Медицина и здравоохранение, № 201, 2010. C. 259-263.
11. Архипова Э.В., Водопьянова А.М., Колхир В.К. Влияние экстракта лапчатки белой на течение экспериментального гипотиреоза// Бюл. ВСНЦ СО РАМН, Т.7. №1, 2011. С. 116-118.
12. Лемза С.В., Хамаева Н.А., Торопова А.А., Петров Е.В. «Тиреотон» как фитокорректор дисфункций митохондрий мозга при экспериментальном гипотиреозе//Сиб. мед. журнал, №2, 2015. С. 108-111.
