CC BY
39
УДК 615.322.074:582.929.4
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-9-100-103
ФИТОХИМИЧЕСКИИ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ИЗВЛЕЧЕНИЙ листьев БОДЯКА РАЗНОЛИСТНОГО
Касьянов З.В., Непогодина Е.А., Старкова А.В., Буканова Е.В., Турышев А.Ю.
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация
Аннотация. В статье представлены результаты анализа химического состава листьев бодяка разнолистного по содержанию органических кислот, дубильных веществ и фла-воноидов, а также гемостатической (коагуляционной) и противовоспалительной активности извлечений из этого сырья. Сырье собрано во время цветения растения. Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) установлено, что преобладающими кислоты листьев - винная и лимонная, ал-калиметрически определено, что суммарное содержание кислот в пересчёте на лимонную составляет более 6%. Качественными реакциями установлено, что дубильные вещества листьев бодяка гидролизованной природы, перманга-натометрически определено их содержание в пересчете на танин, составляет более 13%. Методом ТСХ по характеру флюоресценции и расположению пятен на хроматограм-мах идентифицировано содержание нескольких флавоноид-ных соединений, два из которых - рутин и кверцитин. Исследование коагуляционной активности водного извлечения проведены с помощью коагулометра «АПГ4-02-П», для исследования использовали цитратную кровь кроликов. Результаты свидетельствуют о выраженном гемостатиче-ском действии извлечения, активность которого превосходит препарат сравнения этамзилат. Противовоспалительную активность изучали у сухого спиртового экстракта на беспородных крысах обоего пола на модели острого воспалительного отёка, вызванного субплантар-ным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина, при пероральном приёме. Торможение отёка стопы составило более 30%, что свидетельствует о выраженности противовоспалительного действия сухого спиртового экстракта листьев бодяка разнолистного.
Ключевые слова: бодяк разнолистный, органические кислоты, дубильные вещества, флавоноиды, гемостатическая активность, противовоспалительная активность.
PHYTOCHEMICAL ANALYSIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF EXTRACTS OF THISTLE HETEROPHYLLOUS LEAVES
Kasyanov Z. V., Nepogodina E.A., Starkova A. V., Bukanova E.V., Turyshev A.Yu.
Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
Annotation. The article presents the results of chemical composition analysis of thistle heterophyllous leaves of content of organic acids, tannins and flavonoids, as well as the haemostatic (coagulative) and anti-inflammatory activity of extracts from this raw material. Raw materials collected during flowering plants. Thin layer chromatography (TLC) revealed that the predominant acid of the leaves is tartaric and citric, alkalimetri-cally determined that the total acid content in terms of citric acid is more than 6%. Qualitative reactions established that the leaves tannins have hydrolyzed nature, it is permanganometri-cally determined their content in terms of tannin, is more than 13%. By the TLC method, the fluorescence character and the location of spots on the chromatograms identified the contents of several flavonoid compounds, two of which are rutine and quer-cetine. The coagulation activity of aqueous extraction was studied using the «APG4-02-P» coagulometer, rabbit citrated blood was used for the study. The results indicate a pronounced hemostatic effect of the extract, whose activity is superior to the eth-amzylate comparison preparation. Anti-inflammatory activity was studied in dry alcohol extract on mongrel rats of both sexes on the model of acute inflammatory edema caused by subcutaneous introduction of 0,1 ml of a 1% aqueous solution of carra-geenin into the rat's hind paw with oral ingestion. Deceleration of foot swelling was more than 30%, which indicates the severity of the anti-inflammatory effect of the dry alcohol extract of thistle heterophyllous leaves.
Key words: bodyak multi-leaf, organic acids, tannins flavonoids, hemostatic activity, anti-inflammatory activity.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Касьянов З.В., Ганькова К.Л., Шустов М.В. Фарма-когностическое изучение бодяка разнолистного - но_вого потенциально лекарственного вида растения //
REFERENCES
[1] Kasyanov Z.V., Gankova K.L., Shustov M.V. Pharmacog-nostic study of thistle heterophyllous - a potentially new _medicinal plant // Proceeds of XXI Russian conference of
XXI Всеросс. конф. молодых ученых-химиков (с меж-дунар.уч.) : тез. докл., Нижний Новгород 15-17 мая 2018 г. Нижний Новгород : Издательство Нижегородского госуниверситета, 2018. С. 288.
[2] Касьянов З.В., Непогодина Е.А., Буканова Е.В., Старикова А.Н. Фитохимический анализ травы пупавки красильной // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2017. Т.20, №3. С. 102-106.
[3] Федосеева Л.М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 2005. №3. С. 45-50.
[4] Лобанова И.Ю., Турецкова В.Ф. Выделение и изучение состава флавоноидов листьев осины обыкновенной // Химия растительного сырья. 2011. №2. С. 117122.
[5] Руководство по проведению доклинических исследований средств / А.Н. Миронов. Часть первая. И.: Гриф и К. 2012. 197 с.
Актуален поиск новых лекарственных растений с целью создания эффективных безопасных препаратов. Одним из таких является представитель семейства Астровые, бодяк разнолистный. Согласно собранным сведениям народной медицины, кашицу из свежих листьев (или листья целиком), а также сухие листья, растёртые в порошок, накладывают на ссадины и гноящиеся раны в качестве наружного ранозаживляющего и противовоспалительного средства [1]. Химический состав и биологическая активность данного растения изучены мало, что делает их исследование актуальными.
Цель настоящей работы - расширение представления о химическом составе и фармакологической активности бодяка разнолистного и изучение соответствия народного применения научно-исследовательским данным. В связи с чем, задачами явились изучение ге-мостатической и противовоспалительной активности извлечений из листьев данного растения, а также анализ содержания органических кислот, дубильных веществ и флавоноидов, как групп веществ, согласно ряду исследований, отвечающих за подобные активности.
Объектом исследования служил образец листьев бодяка разнолистного, заготовленный в июле 2017г. в окрестностях г. Перми (д. Васильевка).
Органические кислоты. Для качественной оценки содержания органических кислот было приготовлено водное извлечение (1:5). 5,0 г измельченного сырья заливали 50 мл воды очищенной и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечения фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды очищенной, и дважды повторяли операцию. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли и упаривали под
young scientists-chemists, Nizhny Novgorod 15-17 may 2018. Publishing house of Nizhny Novgorod state University, 2018. P.288.
[2] Kasyanov Z.V., Nepogodina E.A., Bukanova E.V., Staro-kova A.N. Phytochemical analysis of golden chamomile herb // Zhurnal nauchnyh statej «Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke». 2017. Vol.20, №3. P. 102-106.
[3] Fedoseeva L.M. Tannins studying of underground and elevated vegetative bodies of a leather bergenia (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), growing in Altai // Himija ras-titel'nogo syr'ja. 2005. №3. P. 45-50.
[4] Lobanova I.Yu., Turetzkova V.F. Isolation and study of flavonoid composition of aspen leaves // Himija ras-titel'nogo syr'ja. 2011. №2. P. 117-122.
[5] Guidelines for pre-clinical studies of the means. Edited by A.N. Mironov. Part 1. 2012. 197p.
вакуумом и доводили до 25 мл. Извлечение также было использовано для идентификации дубильных веществ.
Наличие органических кислот подтверждено реакциями комплексообразования с солями металлов: меди сульфата (зеленовато-синяя окраска), кальция хлорида (белый осадок).
Обнаружение органических кислот проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в восходящем токе растворителей со свидетелями (1% водные растворы винной, аскорбиновой, лимонной, щавелевой и янтарной кислот) на пластинках «Силу-фол иУ 254» в системе: спирт этиловый 96% - раствор аммиака концентрированный (16:4,5), проявитель -спиртовой раствор бромкрезолового зеленого. На линию старта наносили 0,01 мл извлечения (соответствует 2 мг сырья). Условия разделения хромато-граммы: температура - 20°С, время насыщения камеры - 40 мин. Время хроматографирования составило 30 мин [2].
В щелочной среде детектируемые кислоты проявлялись на синем фоне в виде желтых пятен. В листьях бодяка разнолистного достоверно идентифицированы лимонная (Я^ 0,15) и винная (Я^ 0,32) кислоты.
Количественное содержание свободных органических кислот проводили титриметрически [2]. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 5,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу объемом 250 мл, заливали 200 мл воды и выдерживали в течение 2 часов на кипящей водяной бане, затем охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 220 мл, доводили объем извлечения водой до метки и перемешивали. Отбирали 10,0 мл извлечения, помещали в колбу вместимостью 500 мл, прибавляли 300 мл свежепрокипяченной воды
и титровали 0,1 М раствором натрия гидроксида. Конечную точку титрования устанавливали потенцио-метрически.
Содержание свободных органических кислот в пересчете на лимонную кислоту в абсолютно сухом сырье в процентах (C, %) вычисляли по формуле:
V • 0,009605 • 220 • 100 • 100
С, % =-
, т-10 • (100 -W)
где 0,009605 - количество лимонной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, в граммах; V - объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование, в миллилитрах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Среднее содержание органических кислот в пересчёте на лимонную кислоту в листьях бодяка разнолистного составило 6,55±0,41% (n=5).
Дубильные вещества. Качественное определение проводили в водном извлечении (1:5) с помощью качественных реакций: со свежеприготовленным 1% раствором желатина и кислотой хлористоводородной 10% получается муть, исчезающая от избытка реактива (дубильные вещества); с 1% раствором антипирина образуется аморфный осадок (дубильные вещества); с 10% раствором кислоты уксусной и 10% раствором средней соли свинца ацетата - бурый аморфный осадок (гидро-лизованные дубильные вещества); с 1% раствором же-лезоаммониевых квасцов - черно-синее окрашивание (гидролизованные дубильные вещества) [3].
Количественное определение дубильных веществ проводили по стандартной фармакопейной методике в пересчёте на танин, содержание составило 13,80±0,59% (n=5) [2].
Флавоноиды. Извлечение для качественного анализа получали по следующей методике. 5,0 г измельченного до 1-2 мм сухих травы пупавки красильной экстрагировали спиртом этиловым 70% до полного истощения сырья (4 раза) методом дробной мацерации, извлечения объединяли и упаривали до 50 мл. Для пробирочных реакций для лучшего просмотра оттенка реакции, извлечение немного разбавляли водой очищенной.
Результатом проведения реакции с раствором аммиака стало жёлто-оранжевое окрашивание, с железа хлоридом получилось синее окрашивание. При добавлении ацетата свинца появлялся оранжевый осадок. С раствором алюминия хлорида проявлялась зелёная окраска, а с минеральными кислотами получалось жёлтое окрашивание. Эффекты реакций свидетельствуют о наличии флавоноидов.
Для доказательства подлинности флавоноидов в полученном извлечении мы использовали метод тонкослойной хроматографии на пластинках «Сорбфил
ПТСХ-П-А-УФ» восходящим способом. Проводилось два параллельных хроматографирования в двух разных системах растворителей этилацетат: уксусная кислота: вода в соотношении 7:1:2 и бутанол: уксусная кислота: вода в соотношении 4:1:5. Полученные хро-матограммы последовательно просматривались сначала в УФ-свете, затем обрабатывались парами аммиака, после чего опрыскивались 5%-ым спиртовым раствором алюминия хлорида. Для этого были подготовлены две хроматографические камеры с системами растворителей. Насыщение камеры осуществляли в течение 40 минут, время хроматографирования - 30 минут. На каждую пластинку были нанесены извлечение и растворы веществ-свидетелей (кверцетин и рутин). Далее пластинки погружались в хроматографические камеры. После получения хроматограмм, их высушивали и просматривали в УФ-свете, затем обрабатывали парами аммиака, после чего опрыскивали 5%-ым спиртовым раствором алюминия хлорида [4].
По характеру флюоресценции и расположению пятен на хроматограммах идентифицировано содержание нескольких флавоноидных соединений, два из которых - рутин и кверцитин.
Гемостатическая активность. Для изучения гемо-статической (коагуляционной) активности было получено водное извлечение (1:10). 5,0 г измельчённого сырья заливали 50 мл воды очищенной и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечения фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды очищенной, и повторяли операцию дважды. Водные извлечения, полученные после трёхкратной экстракции, объединяли, упаривали под вакуумом до 50 мл.
Исследования проведены с помощью коагулометра «АПГ4 - 02 -П». Для исследования использовали цит-ратную кровь кроликов, взятую в соотношении 9 частей крови, 1 часть 3,8% раствора цитрата натрия. Затем, из этой крови получали плазму, богатую тромбоцитами путем центрифугирования в течение 10 минут при скорости 1000 оборотов в минуту. Для определения активности в кювету помещали 50 мкл плазмы и добавляли 50 мкл исследуемого извлечения. Для контроля вместо вещества добавляли 50 мкл изотонического раствора хлорида натрия. В качестве препарата сравнения добавляли 50 мкл раствора этамзилата в концентрации 0,2%. Пробы инкубировали в течение 60 сек. Добавляли 50 мкл 1% раствора хлорида кальция и приступали к измерению [5].
Исследование влияния водного извлечения листьев бодяка на время свертывания крови показало, что данное извлечение обладает выраженным гемостатиче-ским действием, активность которого превосходит препарат сравнения этамзилат (табл. 1).
Таблица 1
Результаты исследования коагуляционной активности водного извлечения (1:10) листьев бодяка разно-
литного
Препарат Время свертывания, сек; контроль Время свертывания, сек; опыт % изменения N P
Извлечение 147,5±3,42 101,6±5,51 +31,1% 10 <0,001
Этамзилат 144,1 ±7,83 121,0±7,20 + 16,0% 10 <0,05
Противовоспалительная активность. Противовоспалительную активность изучали у сухого экстракта, полученного путём полного отгона растворителя у извлечения, полученного для качественного анализа.
Противовоспалительную активность проверяли на крысах массой 220-270 г., обоего пола (группа включала 6 животных) на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% водного раствора карраге-нина. Увеличение объема стопы, свидетельствующее о развитии отека, оценивали онкометрически до введения и через 3 часа после введения каррагенина.
Исследуемые вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг за 1 час до введения флогогенного агента. Контролем служили животные, не получавшие препарата. Определяли эффект торможения воспаления в процентах к контрольному уровню. О наличии противовоспалительного действия судили по выраженности торможения воспалительной реакции. Если этот показатель был больше 30%, результат учитывался как положительный [5].
Результаты изучения противовоспалительной активности указаны в табл. 2.
Таблица 2
Результаты исследования противовоспалительной активности сухого спиртового экстракта листьев
бодяка разнолистного
Объект Объем стопы до введения флого-гена, мл Объем стопы через 3 часа, мл % прироста объема стопы через 3 часа Торможение отека через 3 часа, %
Сухой экстракт 1,52±0,06 1,89±0,06 25,3±5,9 61,90
Контроль 0,77±0,05 1,26±0,08 66,5±10,2 -
Сухой спиртовой экстракт листьев бодяка разнолистного обладает выраженным противовоспалительным действием.
Заключение. Проведено фитохимическое изучение листьев бодяка разнолистного. Качественно подтверждено наличие в химическом составе органических кислот и дубильных веществ. Установлено, что преобладающими кислотами являются винная и лимонная, а дубильные вещества - гидролизованные. Количественно установлено содержание органических
кислот (6,55±0,41%), дубильных веществ (13,80±0,59%). Подтверждено наличие флавоноидов рутина и кверцетина. Установлено, что водное извлечение листьев бодяка разнолистного обладает выраженной коагуляционной активностью, а сухой спиртовой экстракт - противовоспалительным действием. Актуально дальнейшее изучение химического состава и биологической активности бодяка разнолистного.
