CC BY
61
УДК 615.322.074:582.929.4
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-8-94-98
АНАЛИЗ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА ЛИСТЬЕВ БОДЯКА РАЗНОЛИСТНОГО
Касьянов З.В., Ганькова К.Л., Шустов М.В., Гольдштейн А.Г.
ФГБОУВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация
Аннотация. В статье представлены результаты анализа полисахаридного комплекса листьев бодяка разнолистного, перспективного лекарственного растения народной медицины. Подтверждено наличие связанных сахаров (полисахаридов) в листьях бодяка разнолистного. Выделен полисаха-ридный комплекс по фракциям, которые представляют собой аморфные порошки различных оттенков. Проведено хроматографическое изучение нейтрального моносахарид-ного состава гидролизованных полисахаридных фракций. В водорастворимом комплексе листьев бодяка разнолистного обнаружены глюкоза и арабиноза, в пектиновых веществах - галактоза, ксилоза и рамноза, в гемицеллюлозе А - галактоза, в гемицеллюлозе Б - ксилоза. Для определения средней летальной дозы использован метод Прозоровского В.В., исследуемое соединение вводили перорально белым мышам. Фракции полисахаридного комплекса являются нетоксичными соединениями в соответствии с классификацией Сидорова. Исследование противовоспалительной активности проводилось на беспородных крысах на модели острого воспалительного отёка, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу крысы водного раствора каррагенина. Увеличение объёма стопы, свидетельствующее о развитии отёка, оценивали онкометрически до и после введения карраге-нина. Наилучшую противовоспалительную активность оказывала гемицеллюлоза А, действие сопоставимо с диклофе-наком. Полученные данные могут быть использованы при комплексном фармакогностическом изучении бодяка разнолистного с целью последующей разработки препаратов на основе его сырья.
Ключевые слова: бодяк разнолистный, растительное сырье, фитотерапия, полисахаридный комплекс, острая токсичность, противовоспалительная активность.
ANALYSIS OF CHEMICAL COMPOSITION AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF THISTLE HETEROPHYLLOUS LEAFS POLYSACCHARIDE
COMPLEX
Kasyanov Z. V., Gankova K.L., Shustov M. V., Goldshtein A. G.
Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
Annotation. The article presents the results of polysaccharide complex analysis of thistle heterophyllous leafs, promising medicinal plant of traditional medicine. The presence of associated sugars (polysaccharides) in leafs of thistle heterophyllous has confirmed. A polysaccharide complex is distinguished by fractions, which are amorphous powders of different shades. Chro-matographic study of neutral monosaccharide composition of hydrolyzed polysaccharide fractions was carried out. Glucose and arabinose were found in the water-soluble complex of thistle heterophyllous leafs, galactose, xylose and rhamnose were found in pectin, galactose was found in hemicellulose A and xylose was found in hemicellulose B. To determine the average lethal dose, Prozorovsky V. V. method was used, the test compound was administered orally to white mice. The fractions of the polysaccharide complex are non-toxic compounds according to Sidorov's classification. The study of anti-inflammatory activity was carried out on non-native rats on the model of acute inflammatory edema caused by subcutaneous introduction of a carrageenin aqueous solution into the rat's hind paw. The increase in foot volume, indicating the development of edema, was assessed on-cometrically before and after the administration of carrageenin. The best anti-inflammatory activity had hemicellulose A, the effect is comparable with diclofenac. The obtained data can be used at complex pharmacognostic studying of thistle heterophyllous for the purpose of subsequent development of medicines on basis of its raw materials.
Key words: Cirsium heterophyllum, vegetable raw materials, phytotherapy, polysaccharide complex, acute toxicity, antiinflammatory activity.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Касьянов З.В., Ганькова К.Л., Шустов М.В. Фарма-когностическое изучение бодяка разнолистного - нового потенциально лекарственного вида растения // XXI Всеросс. конф. молодых ученых-химиков (с меж_дунар.уч.) : тез. докл., Нижний Новгород 15-17 мая
REFERENCES
[1] Kasyanov Z.V., Gankova K.L., Shustov M.V. Pharmacognostic study of thistle heterophyllous - a potentially new medicinal plant // Proceeds of XXI Russian conference of young scientists-chemists, Nizhny Novgorod 15-17 may _2018. Publishing house of Nizhny Novgorod state Univer-
—--—
Журчи, i включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 94 ~
2018 г. Нижний Новгород : Издательство Нижегородского госуниверситета, 2018. С. 288.
[2] Демидова М.А., Дегтярева А.С., Касьянов З.В., Старкова А.В. Изучение биологической активности извлечений из листьев бодяка разнолистного // Вестн. Перм. гос. фармац. акад.: науч.-практ. журнал. 2018. № 21. С. 105-106.
[3] Растительные ресурсы России. Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.5. Семейство Asteraceae (Compositae). Часть 1. Роды Achillea - Doronicum / Отв. ред. А.Л. Буданцев. Спб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2012. 317 с.
[4] Гуляев Д.К., Белоногова В.Д., Рудакова И.П. Состав и биологическая активность полисахаридов побегов и листьев малины обыкновенной (Rubus Idaeus L.) // Традиционная медицина. 2017. Вып. 4(51). С. 39-42.
[5] Руководство по проведению доклинических исследований средств / А.Н. Миронов. Часть первая. И.: Гриф и К. 2012. 197 с.
Несмотря на достижения в области синтетической фармацевтики, интерес к фитотерапии сохраняется во всем мире. Довольно высокая приверженность лечению компонентами растений в разных уголках мира во многом обусловлена социальными и культурологическими особенностями. Ряд опросов пациентов как за рубежом, так и в России, пользующихся методами народной и альтернативной медицины, показал, что мотивацией к данным видам лечения послужили отсутствие эффекта от терапии обычными методами, а также высокая приверженность здоровому образу жизни.
Бодяк разнолистный (Cirsium heterophyllum Hill) -многолетнее травянистое растение семейства Астровые (Asteraceae), европейско-сибирский бореально-горный вид, распространённый в Северной Европе, в горах Центральной Европы, в Европейской части России и Западной Сибири. Бодяк обладает лекарственным потенциалом, собранные сведения народной медицины указывают, что у коми-пермяков настои и настойки сырья бодяка применяют при эпилепсии, болезнях печени, астме и туберкулёзе лёгких [1]. По данным других источников, кашицу из свежих листьев (или листья целиком), а также сухие листья, растёртые в порошок, накладывают на ссадины и гноящиеся раны [2]. Согласно немногочисленным литературным данным по изучению химического состава и биологической активности известно, что листья содержат флавоноиды (7-0^-Э-глюкопиранозид и 4'-О-глюкозид лютеолина), а также что флавоноидное извлечение обладает противовоспалительной активностью [3, С. 144].
Перспективна для исследования группа растительных полисахаридных комплексов.
sity, 2018. P.288.
[2] Demidova M.A., Degtyaryova A.S., Kasyanov Z.V., Starkova A.V. Study of biological activityof thistle heterophyllous leafs extracts // Vestnik permskoj farmatzevtich-eskoj akademii. 2018. №21. P.105-106.
[3] Plant resources of Russia. Wild growing plants, their component composition and biological activity. Vol.5. Asteraceae (Compositae). Part 1. Edited by A.L. Budantzev. 2012. 317p.
[4] Guljaev D.K., Belonogova V.D., Rudakova I.P. Structure and biological activity of polysaccharides of sprouts and leaves of european raspberry (Rubus Idaeus L.) // Tradi-cionnaja medicina. 2017. Vol. 4(51). P. 39-42.
[5] Guidelines for pre-clinical studies of the means. Edited by A.N. Mironov. Part 1. 2012. 197p.
Согласно предварительному исследованию, сырьём, оптимальным для заготовки (с максимальным выходом биологически активных веществ), являются листья, собранные в фазу цветения. Применение листьев в народной медицине также обуславливает выбор этого объекта для детального изучения.
Целями и задачами настоящей работы явились выделение, анализ химического состава, острой токсичности и противовоспалительной активности полиса-харидного комплекса листьев бодяка разнолистного.
Объектом исследования служил образец листьев бодяка разнолистного, заготовленный в июле 2017 г. в окрестностях г. Перми (д. Васильевка).
Полисахаридный комплекс. Идентификацию полисахаридов проводили в водном извлечении (1:5) по реакции Бертрана (кирпично-красный осадок оксида меди (I), по объёму превышающий аналогичный при определении свободных сахаров) и по добавлению трехкратного объема спирта этилового 96% (рыхлый осадок).
Полисахариды из лекарственного растительного сырья выделяли по методу Н.К. Кочеткова фракциями [4].
Выделение водорастворимого полисахаридного комплекса (ВРПК). Для получения полисахаридных фракций было взято 0,2 кг воздушно-сухого сырья листьев бодяка разнолистного. Сырьё экстрагировали спиртом этиловым 70% для извлечения фенольных соединений. Далее полученный шрот экстрагировали горячей водой 1:20 при нагревании до 95°С в течение 2 часов при постоянном перемешивании. Повторное извлечение полисахаридов проводили дважды в соотношении 1:10 в течение часа. Растительный материал отделяли центрифугированием, а объединённые водные извлечения упаривали до 1/5 первоначального
—--—
Журчи. л включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 95 ~
объёма. С целью дополнительной очистки от феноль-ных соединений водные извлечения пропускали через слой полиамидного сорбента высотой 50 мм на воронке Бюхнера диаметром 300 мм. Сорбент промывали небольшими порциями воды, которые присоединяли к основной массе элюатов. После этого полисахариды осаждали трёхкратным объёмом спирта этилового 96% при комнатной температуре. Выпавшие плотные осадки полисахаридов отфильтровывали, промывали спиртом этиловым, ацетоном и высушивали.
Выделение пектиновых веществ (ПВ). Для получения ПВ использовали шрот сырья, оставшийся после выделения ВРПК. Шрот сырья экстрагировали смесью растворов кислоты щавелевой и аммония ок-салата 0,5% (1:1) в соотношении 1:20 при 80°C в течение 2,5 часов. Повторное извлечение проводили дважды в соотношении 1:10. Экстракты концентрировали, диализовали и осаждали спиртом этиловым 96% (1:5). Выпавшие осадки ПВ отфильтровывали, промывали спиртом этиловым и высушивали.
Выделение гемицеллюлозы А. Шрот сырья, оставшийся после выделения ПВ, использовали для получения гемицеллюлозы А. Для этого его заливали пятикратным объёмом 10% водного раствора натрия гидроксида и оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Затем процеживали через четыре слоя марли. К полученному фильтрату прибавляли два объёма кислоты уксусной. Образовавшийся осадок отфильтровывали через фильтр. На фильтре получался осадок гемицеллюлозы А в виде зеленовато-коричневой массы.
Выделение гемицеллюлозы Б. К фильтрату добавляли двукратный объем спирта этилового 96% для осаждения гемицеллюлозы Б. Полученный осадок отфильтровывали через фильтр, промывали спиртом этиловым, высушивали.
Выделенные и высушенные фракции представляют собой гигроскопичные аморфные порошки разных оттенков. Фракции хорошо растворимы в воде.
Кислотный гидролиз фракций. Для определения мономерного состава ВРПК, ПВ и гемицеллюлоз А и Б проводили гидролиз кислотой серной. Навески по-лисахаридных комплексов 0,05 г помещали в ампулы ёмкостью 10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора кислоты серной 2М, запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 105°С в течение 6 часов для ВРПК, 24 часов для ПВ и 48 часов для гемицеллюлоз А и Б. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды очищенной, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой, очищенной до объёма фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объёма спирта этилового 96% при исследовании ВРПК, гемицеллюлоз А и Б и 5 объёмов для ПВ, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 2 ч. Фильтраты упаривали на кипящей водяной бане до получения объема около 0,5 мл (раствор А). Гидролиз полисахаридов на мономеры подтверждали с реактивом Фелинга.
Хроматографирование нейтральных моносахаридов (раствор А) осуществляли методом восходящей бумажной хроматографии в системе н-бутанол - пиридин - вода (6:4:3) с образцами нейтральных моносахаридов (1% водные растворы галактоза, глюкоза, рамноза, фруктоза, арабиноза, ксилоза). Насыщали камеру в течение 30 мин., хроматографировали около 2 ч., высушивали, затем обрабатывали анилинфталат-ным реактивом и выдерживали в сушильном шкафу при 100оС в течение 10 мин.
Пятна сахаров проявлялись в виде красноватых пятен различных оттенков (рис. 1). В ВРПК травы пупавки красильной идентифицированы арабиноза (И 0,63), глюкоза (И 0,36) и галактоза (И 0,28); в составе ПВ - фруктоза (Rf 0,41), в составе гемицеллюлозы А - фруктоза (Rf 0,40) и рамноза (Rf 0,71).
—--—
Журчи. I включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
I
о
0
f\ !
t
i
0
s
10
Рис. 1. Схема хроматограммы продуктов кислотного гидролиза полисахаридных фракций
(раствор А - нейтральные сахара)
1 - арабиноза (К/ 0,63), 2 - галактоза (К/ 0,32), 3 - глюкоза (К/ 0,35), 4 - ксилоза (К/ 0,50), 5 - рамноза (К/ 0,72), 6 - фруктоза (К/0,41), 7 - ВРПК, 8 - ПВ, 9 - гемицеллюлоза А, 10 - гемицеллюлоза Б
Определение острой токсичности. Острая токсичность определена в опытах на белых нелинейных мышах обоего пола массой 28-30 г, содержащихся на обычном рационе вивария [5]. Для определения средней летальной дозы использован метод В.В. Прозоровского. Исследуемое соединение вводили перо-рально. Каждую дозу вводили двум животным. Всего в опыте использовано 10 мышей. Вводили различные дозы по возрастанию.
При учёте выживших мышей обнаружено, что все мыши остались живы. Соединения данного ряда в соответствии с классификацией Сидорова можно отнести к практически не токсичным.
Изучение противовоспалительной активности. Исследование проводилось на крысах массой 180-250 г., обоего пола (группа включала 6 животных) на модели острого воспалительного отёка, вызванного субплан-тарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина. Увеличение объёма стопы, свидетельствующее о развитии отёка, оценивали онкометрически до введения и через 3 часа после введения каррагенина. В качестве препарата срав-
нения использовали диклофенак. Водное извлечение травы пупавки красильной и диклофенак вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 0,5 часа до введения флогогенного агента. Контролем служили животные, получавшие вместо препарата дистиллированную воду. Статистическую обработку проводили по методу Стьюдента. На основе полученных результатов определяли эффект торможения воспаления в процентах к контрольному уровню. О наличии противовоспалительного действия судили по выраженности торможения воспалительной реакции. Если этот показатель был больше 30%, результат учитывался как положительный.
Использованный в работе метод исследования позволил изучить влияние препарата в основном на проявление острой воспалительной реакции, в которой важное значение имеет повышение уровня медиаторов воспаления. Антиэкссудативную активность изучали на модели каррагенинового отека конечности у крыс.
(табл. 1, 2).
Таблица 1
Изучение противовоспалительной активности (% прироста объёма стопы)
Шифр Доза, мг/кг, п/о Прирост объёма стопы, после 1 часа, % Прирост объёма стопы, после 3 часов, % Прирост объёма стопы, после 5 часов, %
ВРПК 50 26,45±0,12 52,12±0,097 57,43±0,148
ГА 50 19,21±0,074 36,20±0,043 50,47±0,075
пектин 50 27,65±0,12 51,76±0,097 58,61±0,097
ГБ 50 25,03±0,148 53,83±0,15 62,79±0,23
Контроль 46,61±0,049 65,21±0,179 75,81±0,139
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 97 ~
Таблица 2
Протокол экспериментального изучения противовоспалительной активности
(% торможения отёка стопы)
Шифр Доза, мг/кг, п/о Торможение отёка стопы, после 1 часа, % Торможение отёка стопы, после 3 часов, % Торможение отёка стопы, после 5 часов, %
ВРПК 50 41,34** 19,92 23,14*
ГА 50 57,21** 43,32* 33,56**
ПВ 50 40,67** 20,62 22,68*
ГБ 50 46,29* 17,45 17,17
Диклофенак 10 - - 62,1
P<0,01 *; P<0,05** по сравнению со соответствующим контролем.
Таким образом, установлено, что фракция водный раствор гемицеллозы А оказывает противовоспалительную активностью сопоставимую с действием препарата сравнения диклофенаком.
Заключение. Выделен полисахаридный комплекс листьев бодяка разнолистного по фракциям: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б. Фракции представляют собой аморфные порошки различных оттенков; проведено хроматографическое изучение моносахаридного состава гидролизованных нейтральных полисахаридных фракций; в водорастворимом
комплексе листьев бодяка разнолистного обнаружены глюкоза и арабиноза, в пектиновых веществах - галактоза, ксилоза и рамноза, в гемицеллюлозе А - галактоза, в гемицеллюлозе Б - ксилоза; фракции поли-сахаридного комплекса являются не токсичными соединениями; наилучшую противовоспалительную активность среди фракций комплекса оказывает ге-мицеллюлоза А, действие сопоставимо с диклофена-ком; актуально дальнейшее изучение химического состава и биологической активности извлечений бодяка разнолистного.
—--—
Журчи. I включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
