CC BY
49Ферментативный гидролиз плазмы крови как метод химико-токсикологического анализа, используемый для изолирования токсических веществ
Н.А. Чувина,
О.Ю. Стрелова, В.Н. Куклин
ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия», г Санкт-Петербург
При проведении химико-токсикологического анализа биологических сред важным является этап изолирования ксенобиотика из биологического объекта. Для разрушения комплекса токсического вещества с белками плазмы крови предложен метод ферментативного гидролиза. Гидролиз модельного комплекса «лекарственное вещество — плазма крови» проведен с использованием ферментов трипсина, химотрипсина, химопсина, пепсина и папаина. Эффективность предложенного метода изучена на примере лекарственных веществ кофеина, фенобарбитала, барба-
мила, целекоксиба, дифенгидрамина, хлоропира-мина, клемастина, папаверина. Показано, что для изолирования кофеина, целекоксиба, дифенгидра-мина, хлоропирамина, клемастина и папаверина более эффективна методика с использованием хи-мопсина, для производных барбитуровой кислоты — трипсина.
Ключевые слова: ферментативный гидролиз, трипсин, химотрипсин, химопсин, пепсин, папаин, плазма крови, изолирование, жидкость-жидкостная экстракция.
Введение. Химико-токсикологический анализ в случае острых отравлений лекарственными веществами является одним из наиболее важных этапов в комплексе диагностических и лечебных мероприятий. Проведение лабораторного исследования включает четыре основных стадии: изолирование токсического вещества из биологического объекта (биологических жидкостей), очистку полученного извлечения, идентификацию веществ и количественное их определение.
Основным и наиболее важным является этап изолирования ксенобиотика из биологического объекта. На этом этапе можно частично или полностью потерять лекарственное вещество, вызвавшее отравление, и в дальнейшем не обнаружить его даже с помощью современного и высокочувствительного оборудования. Однако существующие методы изолирования химических веществ, разработанные ранее, не отвечают требованиям современной аналитической диагностики.
Для диагностики острых отравлений наиболее информативной жидкостью является кровь, так как именно ее исследование позволяет судить о наличии и фактическом содержании токсикантов в организме в данный момент времени. Для изолирования химических веществ из крови используются методы прямой жидкость-жидкостной экстракции органическим растворителем при оптимальном значении рН среды, изолирование после использования осаждающих агентов (50% раствора трих-лоруксусной кислоты или 10% раствором натрия вольфрамата в среде 25% раствора кислоты серной) или высаливающих агентов (насыщенный раствор аммония сульфата или натрия хлорида),
а также изолирование после гемолиза эритроцитов [2].
После поступления в кровеносное русло любое химическое вещество, в том числе и лекарственное, в той или иной степени связывается с белками плазмы крови, преимущественно альбумином. При этом фармакокинетический показатель степени связывания с белками плазмы крови для некоторых лекарственных веществ может достигать 90-98% (производные 1,4-бенздиазепинов, фено-тиазины и др.) [5]. В то же время существующие методы изолирования из крови не учитывают связанную фракцию токсиканта, а извлекают только его свободную фракцию. Поэтому для целей химико-токсикологического анализа актуальным является вопрос разработки такого метода изолирования, который позволит максимально разрушить комплекс «белок — токсикант» и существенно повысить эффективность лабораторной диагностики острых отравлений.
Весьма перспективной представляется возможность применения с этой целью различных ферментативных препаратов. Методики ферментативного гидролиза биологических жидкостей, преимущественно мочи, в литературе описаны. Авторы предлагают разрушать водорастворимые метаболиты ксенобиотиков, глюкурониды, сульфаты при помощи ферментов Р-глюкуронидазы и Р -сульфотазы [2]. При этом сведения о применении протеолитических ферментов для гидролиза крови или плазмы крови с целью выделения токсических веществ в литературе ограничены [1].
В связи с этим целью настоящего исследования явилась разработка и апробация метода фермен-
тативного гидролиза плазмы крови, способствующего повышению эффективности изолирования химических веществ в ходе химико-токсикологического анализа.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проводился с использованием следующих реактивов: субстанции кофеина, фенобарбитала, барбамила, целекоксиба, дифенгидрамина гидрохлорида, хлоропирамина гидрохлорида, клемастина фумарата, папаверина гидрохлорида по подлинности и степени чистоты соответствующие требованиям Государственной Фармакопеи Х издания; донорская плазма; ферменты пепсин (Merck's Laborpropa), папаин (КМП), трипсин, химотрип-син и химопсин (ООО «Самсон-Мед»); субстанция трилона Б (чда); субстанция цистеина (чда); ацето-нитрил марки ОСЧ; 50% раствор кислоты трихло-руксусной, фосфатный буферный раствор с рН 7,4, ацетатный буферный раствор с рН 4,5 и фосфатный буферный раствор рН 3,0. Буферные растворы готовили по описанной методике[4].
Выполнение исследования осуществлялось с применением следующей аппаратуры: центрифуга ОПн-8, термобаня ТБ-110, хроматограф «Waters 2695», газовый хроматограф с масс-селективным детектором фирмы «Hewlett Packard».
Для создания модельного комплекса «плазма крови — лекарственное вещество» был использован метод, описанный в [9]: к 2,5 мл плазмы крови добавляли 2,5 мл раствора лекарственного вещества в фосфатном буфере с рН 7,4. Концентрация лекарственного вещества составляла 1 мг/мл для кофеина, фенобарбитала и барбамила, 500 мкг/мл для целекоксиба и 100 мкг/мл для дифенгидрами-на, хлоропирамина, клемастина и папаверина. Модельную смесь инкубировали в течение 1 ч при температуре 370С.
На первом этапе исследования оценивали эффективность традиционных методов изолирования,
которые наиболее часто применяются в повседневной практической деятельности судебно-химиче-ских и химико-токсикологических лабораторий — изолирование лекарственных веществ методом жидкость-жидкостной экстракции органическим растворителем и изолирование после осаждения белковой молекулы раствором 50% трихлоруксус-ной кислоты.
Для веществ кислого характера (производных барбитуровой кислоты) и слабо основного характера (кофеин) исследование проводили по следующей схеме. К 5 мл модельной смеси прибавляли по каплям 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной до рН 2-3 (по универсальному индикатору) для барбитуратов и до рН 4-5 для кофеина, переносили в делительную воронку и экстрагировали тремя порциями хлороформа по 3 мл. Хлороформное извлечение фильтровали через складчатый фильтр с безводным натрия сульфатом, предварительно смоченный хлороформом, выпаривали до сухого остатка при комнатной температуре.
Для веществ основного характера (целекоксиба, дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина) изолирование из модельного комплекса выполняли следующим образом: к 5 мл модельной смеси прибавляли по каплям 25% раствор аммония гидроксида до рН 9-10 (по универсальному индикатору), переносили в делительную воронку и экстрагировали тремя порциями хлороформа по 3 мл.
Чистоту полученных извлечений проверяли методом тонкослойной хроматографии в селективных системах хроматографирования. На хрома-тограммах в УФ-свете при 254 нм наблюдалось одно пятно на уровне вещества свидетеля (с характерным значением Rf). Кроме того, проводили исследование извлечений методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на оборудовании фирмы «Hewlett Packard»: газовый хроматограф Agilent Technologies 6890 N
Лекарственное вещество Х ср, % S Л X E % CV
Кофеин 45,5 0,28 0,5 1,2 1,4
Фенобарбитал 29,4 1,04 2,1 7,1 3,8
Барбамил 22,1 0,90 0,3 8,1 4,8
Целекоксиб 18,7 0,38 0,8 4,1 2,4
Папаверин 11,2 0,20 0,4 3,6 1,8
Клемастин 3,2 0,13 0,3 8,4 4,5
Хлоропирамин 16,5 0,67 1,3 8,1 4,6
Дифенгидрамин 8,9 0,32 0,6 7,3 3,7
Таблица 1
Результаты изучения степени экстракции лекарственных веществ из плазмы крови методом прямой экстракции органическим растворителем (Р = 90%, п = 6)
Таблица 2
Результаты изучения степени экстракции лекарственных веществ из плазмы крови после осаждения белковых молекул 50% раствором трихлоруксусной кислоты (Р = 90%, п = 6)
Лекарственное вещество Х ср, % S Л X E % CV
Кофеин 31,1 0,65 1,3 4,2 2,6
Фенобарбитал 23,1 0,14 0,3 1,2 4,2
Барбамил 12,0 0,60 1,2 10,0 5,8
Целекоксиб 13,4 0,28 0,5 1,2 1,4
Папаверин 8,2 0,38 0,7 9,3 4,7
Клемастин 1,5 0,06 0,1 7,9 3,4
с автоинжектором 7683 и масс-селективным детектором 5973 N. Условия хроматографирования: капиллярная колонка с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м (HP5MS), газ-носитель — гелий, скорость потока — 1 мл/мин, температура инжектора 2600 С, температура интерфейса 2900 С, температура колонки программируется от 1300 С до 2900 С со скоростью 200 С/мин, масс-селективный детектор с температурой источника 2300 С, масс-квадрупольный анализатор, энергия ионизации 70 эВ. На хроматограмме отмечался один пик для одного исследованного вещества. Полученные масс-спектры совпадали со спектрами, представленными в библиотеке прибора.
Количественное определение извлечений проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе «Waters 2695» с колонкой Nova Pak C18: размеры колонки 3,9 х 150 мм, размер частиц сорбента в колонке 4 мкм. В качестве элюента использовали фосфатный буфер с рН 3,0 и ацетонитрил сорта 0 в соотношении 40:60 (для кофеина, папаверина, дифенгидрамина, хло-ропирамина и клемастина) или воду деионизован-ную и ацетонитрил в соотношении 40:60 (для фенобарбитала, барбамила и целекоксиба). Скорость подачи элюента составляла 400 мкл/мин, температура колонки — 300 С, объем вводимой пробы — 20 мкл. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при аналитической длине волны 220 нм. На хроматограмме отмечался один пик, время удерживания которого соответствовало временам удерживания стандартных образцов исследуемых лекарственных веществ. Расчет выполняли с использованием калибровочного графика зависимости концентрации от площади пика анализируемого лекарственного вещества. Статистическую обработку полученных данных проводили по результатам шести последовательных экспериментов.
Изолирование лекарственных веществ из плазмы крови после осаждения белковых молекул проводили 50% раствором трихлоруксусной кислоты, для чего к 5 мл модельной смеси добавляли 3 мл 50% раствора кислоты трихлоруксусной. Раствор
центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. На-досадочную жидкость сливали, помещали в делительную воронку. Эксперимент повторяли шесть раз.
На втором этапе исследования для разрушения связи лекарственного вещества с белками крови использовался ферментативный гидролиз по следующим методикам.
1. К 5 мл модельной смеси добавляли 5 мл раствора пепсина (содержание пепсина составляло 0,1 г) в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной. Проводили коррекцию рН до 2,0 и инкубировали полученный раствор при температуре 370 С в течение 1 ч. Изолирование лекарственных веществ проводили по описанной выше методике. Определение количественного содержания вещества в сухом остатке проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2. К 5 мл модельной смеси добавляли 5 мл раствора трипсина (содержание трипсина составляло 0,01 г) в 0,1 М растворе аммония гидрокарбоната с рН 7-9 и инкубировали полученный раствор при температуре 370С в течение 1 ч. Далее поступали по методике, описанной выше. В аналогичных условиях проводили также гидролиз химотрипсином и химопсином.
3. К 5 мл модельного комплекса добавляли 5 мл раствора папаина (содержание папаина составляет 0,1 г) в смеси, состоящей из 3 мл раствора ацетатного буфера с рН 4,5, 1 мл 0,002 М раствора три-лона Б (для связывания ионов тяжелых металлов, инактивирующих фермент) и 1 мл 0,1% раствора цистеина (источника SH-групп, необходимых для активизации фермента). Проводили коррекцию рН до 7-9 с помощью диэтиламина и инкубировали полученный раствор при температуре 370 С в течение 2 ч. Далее поступали по методике, описанной выше.
Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики по методике, изложенной в Государственной Фармакопее XI издания (для вероятности Р = 90% и более), и ОСТ № 220 от 26 мая 2003 г. [3, 6].
Результаты и обсуждение. В качестве объектов исследования нами были выбраны препараты
Таблица 3
Результаты изучения степени изолирования лекарственного вещества из плазмы крови с применением ферментативного гидролиза химопсином (Р = 90%, п = 6)
Лекарственное вещество Х ср, % Б Л X Е % СУ
Кофеин 77,2 0,85 1,7 2,2 1,1
Целекоксиб 52,6 0,47 0,9 1,8 0,9
Папаверин 22,9 0,42 0,8 3,7 1,8
Клемастин 11,9 0,13 0,3 2,2 1,1
Хлоропирамин 36,4 0,64 1,3 3,5 1,8
Дифенгидрамин 22,5 0,78 1,6 6,9 3,5
Таблица 4 Результаты изучения степени изолирования производных барбитуровой кислоты из плазмы крови с применением ферментативного гидролиза трипсином (Р = 90%, п = 6)
Лекарственное вещество Х ср, % Б Л X Е % СУ
Фенобарбитал 62,1 1,5 3,9 4,8 2,4
Барбамил 75,1 1,9 3,8 5,1 3,1
из разных фармакологических групп, которые наиболее часто встречаются в практической деятельности химико-токсикологических лабораторий как объекты исследования: производные пурина (кофеин), производные барбитуровой кислоты (фенобарбитал, барбамил), производное бензол-сульфонамида (целекоксиб), производное бензги-дрола (дифенгидрамин), производное аминопири-дина (хлоропирамин), производное пирролидина (клемастин) и производное изохинолина (папаверин). По данным литературы, степень связывания с белками крови для этих веществ составляет: для кофеина — 40-60%, фенобарбитала и барбами-ла — около 50%, целекоксиба — 97%, дифенгидра-мина — около 80%, хлоропирамина — 70%, клема-стина — 95%, папаверина — около 90% [8].
Сведения о структуре комплекса «альбумин плазмы крови — лекарственное вещество» в литературе практически отсутствуют, поэтому для проведения ферментативного гидролиза мы выбрали протеолитические ферменты с низкой специфичностью растительного — папаин и животного происхождения — трипсин, химотрипсин, пепсин и химопсин (смесь трипсина и химотрипсина). Данные ферменты разрывают неограниченное число пептидных связей в белке и увеличивают возможность высвобождения из комплекса с белком большего количества токсического вещества.
Полученные данные по оценке степени экстракции лекарственных веществ из модельного комплекса «плазма крови — лекарственное вещество» представлены в табл. 1 и 2.
Из приведенных в таблице 1 данных видно, что при изолировании лекарственных веществ из плаз-
мы крови методом прямой жидкость-жидкостной экстракции экстрагируется, в основном, свободная фракция вещества и не учитывается связанная фракция. Полученные данные по степени связывания используемых лекарственных веществ с белками плазмы крови совпадают с данными литературы [8].
Из таблицы 2 видно, что добавление к исследуемому объекту осаждающего агента 50% раствора кислоты трихлоруксусной не приводило к увеличению степени экстракции лекарственных веществ за счет разрыва связи вещества с белками крови, а наоборот, снижало этот показатель за счет адсорбции на осадке белка.
Применение ферментативного гидролиза позволяло существенно повысить степень экстракции лекарственного вещества. Наилучшие результаты были получены при использовании фермента хи-мопсина для кофеина, целекоксиба, дифенгидрами-на, хлоропирамина, клемастина и папаверина (табл. 3). Для производных барбитуровой кислоты (фенобарбитала и барбамила) наилучшие результаты были получены при использовании фермента трипсина (табл. 4).
Известно, что фермент химопсин, являющийся смесью трипсина и химотрипсина, гидролизу-ет связи, образованные тирозином, триптофаном, лейцином, фенилаланином за счет фермента химо-трипсин и связи по карбоксильной группе лизина и аргинина за счет фермента трипсин [7]. Исходя из полученных данных, можно предположить, что кофеин, целекоксиб, дифенгидрамин, хлоропира-мин, клемастин и папаверин образуют связи с молекулой альбумина, содержащей аминокислотный
фрагмент в составе тирозина, триптофана, лейцина, фенилаланина, лизина и аргинина. Для производных барбитуровой кислоты характерно образование связи с фрагментом, содержащим лизин и аргинин.
Разработанная нами методика гидролиза с применением трипсина была апробирована на экспертном материале, предположительно содержащем фенобарбитал. При использовании традиционных методов количество фенобарбитала, выделенного прямой экстракцией, составляло 5,24; 5,5 и 7,7 мг/л. В то же время количество фенобарбитала, выделенного после гидролиза трипсином, составило в соответствующих пробах 7,95; 8,86 и 12,5 мг/л. Таким образом, было зарегистрировано увеличение степени выхода фенобарбитала после гидролиза по сравнению с прямой экстракцией крови на 34,13; 37,90 и 38,40%. Следует также отметить, что в одном из образцов методом прямой экстракции фенобарбитал выделить не удалось, а после проведения ферментативного гидролиза было обнаружено 1,13 мг/л вещества.
Полученные результаты позволяют сделать заключение, что предлагаемая методика позволяет существенно повысить эффективность проводимых судебно-химических и химико-токсикологических исследований при острых отравлениях лекарственными веществами.
Выводы. 1. Метод ферментативного гидролиза может быть использован для разрушения связи лекарственных веществ с белками крови и последующего их изолирования.
2. Изолирование лекарственных веществ из плазмы крови после проведения ферментативно-
1. Бабаков В.Н., Краснов ILA. Идентификация алкштированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное приборостроение. — 2008. — Т. 18. — № 4. — С. 46-53.
2. Вергейчнк Т.Х. Токсикологическая химия: учебник /Под ред. E.H. Вергейчи-ка. — М.: МЕД пресс-информ, 2009. - 400 с.
3. Государственная фармакопея.
4. Горден А., Форд 3. Спутник химика. — М.: Мир, 1976. — 444 с.
5. Куценко С.А. Основы токсикологии. — СПб.: Фолиант 2004. — 720 с.
6. ОСТ № 220 от 26 мая 2003 г Правила проведения внутри лабораторного
го гидролиза приводит к увеличению степени экстракции токсиканта в 1,5-2 раза.
3. Для изолирования производных барбитуровой кислоты может быть рекомендована методика гидролиза с использованием фермента трипсин. Для изолирования кофеина, целекоксиба, дифенгидра-мина, хлоропирамина, клемастина и папаверина рекомендуется методика с использованием фермента химопсина.
стандарта качества количественных методов клинических лабораторных исследований контрольных материалов. — ',1. 2003.
7. Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре: Пер. с англ. — М.: Мир. 1989. —623 с.
8. Томилин В.В., Краснова P.P., Ыелъник В.П. Фармако- и токсикокинетические параметры лекарственных, наркотических и других токсических веществ // Информационное письмо. — ', I . 1999.
9. Чёгёр СЛ. Транспортная функция сывороточного альбумина: Пер. с румын. — М.: Мир, 1975. — 184 с.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
N.A. Chuvina, O.Yu. Strelova, V.N. Kuklin
The enzymatic hydrolysis of blood plasma as a method of chemical and toxicological
analysis to isolate drugs
StPetersburg Chemical Pharmaceutical Academy
A method of enzymatic hydrolysis is proposed to dissociate a complex of a toxic substance and blood proteins. The hydrolysis of model complexes: blood protein — a medical preparation (caffeine, phenobarbital, barbamyl, celewxib, diphenhydramine, chloropyramine, clemastine and papaverine ) was carried out using enzymes tripsin, chemopsin, pepsin, papain. The best results were obtained using the chemopsin enzyme for caffeine, celeraxib , diphenhydramine, chloropyramine, clemastine , papaverin and tripsin was the best for phenobarbital, barbamyl.
Переработанный материал поступил в редакцию 21.11.2012 г
