CC BY
74
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ УДК 543.544.5.068.7;943.3; 615.074
количественный анализ кофеина и его метаболитов в плазме крови крыс c применением
высокоэффективной жидкостной хроматографии как метод для определения метаболических
отношений
Я.Г. Новицкая1, А.А. Литвин1, В.П. жердев1, Е.В. Блынская1 , С.э. Кондаков2
£Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, кафедра химической кинетики химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; e-mail: eaureus@mail.ru)
Разработана методика количественного определения кофеина и его метаболитов в биологических пробах (плазме крови крыс) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. Предел количественного обнаружения кофеина, параксантина, теобромина, теофиллина составил 10 нг/мл, 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 25 нг/мл.
Ключевые слова: кофеин, теобромин, теофиллин, параксантин, 1,3,7-триметилмочевая кислота, высокоэффективная жидкостная хроматография, количественное определение.
Кофеин (1,3,7-триметилксантин), часто называемый в фармацевтических публикациях теин, матеин, гуаранин, является алкалоидом пуринового ряда. При попадании кофеина в организм человека и животных в результате его биотрансформации образуется ряд метаболитов (теобромин, теофиллин, параксантин и 1,3,7-триметилмочевая кислота) [1]. Известно, что в организме кофеин метаболизируется в основном представителем суперсемейства цитохромов Р450 изофер-ментом СУР1А2. Данный изофермент участвует также в метаболизме таких фармакологических агентов, как атипичные нейролептики (клозапин, оланзапин), фторхинолоны, циметидин, рифампицин, фенобарбитал и т.д. Все это делает кофеин и его метаболиты одним из наиболее широко используемых маркеров для изучения комбинированного действия лекарственных препаратов [2, 3].
Для анализа кофеина и его метаболитов в биожидкостях широко используются хроматографические методы, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). До настоящего времени исследователи оценивали содержание либо неизмененного кофеина, либо одного или двух его метаболитов [4-6].
Цель настоящей работы - разработка методики количественного определения кофеина и его четырех
метаболитов в плазме крови крыс на основе ВЭЖХ с УФ-детектированием; изучение активности СУР1А2 в комбинированной фармакотерапии селективного анксиолитика афобазола, разработаного в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, и другими препаратами; изучение возможных межлекарственных взаимодействий.
Материалы и методы
Материалы. Кофеин «Fluka» (Германия), теобромин «Sigma» (Германия), теофиллин «Sigma» (Германия), параксантин «Fluka» (Канада), 1,3,7 - триметил-мочевая кислота «Sigma» (Германия), афобазола ди-гидрохлорид «Erregiere SpA.» (Италия), ацетонитрил для хроматографии (марка «УФ») «Merck» (Германия), эфир диэтиловый, химически чистый «МедХимПром» (Россия), метанол «Merck» (Германия), кислота муравьиная «Sigma» (Германия).
Методы. Для анализа проб плазмы крови крыс использовали метод ВЭЖХ. Разделение проводили на жидкостном хроматографе «Beckman Coulter» (США), состоящем из изократической помпы «System Gold 127», ультрафиолетового детектора «System Gold 166» и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм («Мультихром», «Амперсенд», Россия).
Условия хроматографирования. Аналитическая колонка - «Luna C18» («Phenomenex», США; 250x4,6 мм; 5 мкм), детектирование проводили при длине волны 273 нм.
Подвижная фаза (ПФ) - вода (значение рН доведено до 4,0 с помощью 1%-го раствора кислоты муравьиной), ацетонитрил и метанол (80:8:14). Скорость подвижной фазы 1,5 мл/мин.
Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (18-20°С). Перед хроматографи-рованием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане в течение 5 мин. Объем пробы составил 100 мкл.
Результаты и обсуждение
При условиях хроматографирования, приведенных выше, время удерживания кофеина составляет в среднем 6,7 мин, теобромина - 3 мин, параксантина -4,5 мин, теофиллина - 5 мин, 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 5,5 мин. Коэкстрактивные вещества не мешали определению (рисунок).
Предел количественного обнаружения кофеина, теобромина, теофиллина, параксантина для разработанной методики составил 10 нг/мл, а для 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 25 нг/мл.
Валидацию методики проводили в соответствии с «Руководством по валидации аналитических методик для производителей лекарств» [4]. Линейность методики оценивалась по 8 калибровочным стандартам (25, 50, 100, 250, 500,1000, 2500, 5000 нг/мл).
мВ
Стандарты готовили последовательным разведением ПФ матричных растворов кофеина, теобромина, теофиллина, параксантина, 1,3,7-триметилмочевой кислоты (100 мкг/мл в воде). Количество кофеина и его метаболитов в хроматографических фракциях определяли методом абсолютной калибровки. В изучаемом диапазоне концентраций (С) отмечена линейная зависимость между концентрациями анализируемых соединений и соответствующими площадями хроматографических пиков, усредненное значение которых описывается следующими уравнениями (п = 7):
для кофеина
5 = -0,24 + 0,21хС (г = 0,9995); для теобромина
5 = -6,25 + 0,19х С (г = 0,9991); для теофиллина 5 = -5,13 + 0,22х С (г = 0,9993); для параксантина 5 = -4,11 + 0,17х С (г = 0,9998); для 1,3,7-триметилмочевой кислоты 5 = -3,29 + 0,11х С (г = 0,9993),
где 5 - площадь хроматографического пика вещества (в единицах интегрирования хроматографа), С - концентрация, нг/мл.
Разработанная методика метрологически оценена на растворах стандартного образца кофеина и его метаболитов после шести определений. Полученные результаты представлены в табл. 1. Относительная ошибка определения кофеина для
200
_____L . 1_____ 1 1 1 1 1 1 1 _____1_____
_____ 1 1 1 1 1 _____
...... 1 Г ----- " 1----- -----1----- 1 1 -----
: 5 V " - - - ; U ' 6 ¡ 1____L 8 1 , 1_____ 1 1 1 1 _____1_____
5 í ) _____ 1 1 1 1 1 1 _____
7 Г Г 11 7 i í ----- 10 1 1 ,-. || Г Г 1 í -----1----- 1 13 14 15 ----- 16 « ! i
ri,* : ; •1 * 1 • 1.........
10
12
14 16
Время, мин
Хроматограмма плазмы крови крысы после перорального введения кофеина в дозе 50 мг/кг [№/№ пиков: 1-5, 7, 8, 10, 12-16 - пики коэкстрактивных веществ; 6 - теобромин (^ - 3,1 мин); 9 - параксантин (^ - 4,5 мин);
11 - кофеин (^ - 6,7 мин)].
Т а б л и ц а 1
Метрологические характеристики методики определения кофеина и его метаболитов (и = 6)
Анализируемое вещество Взято (нг/мл) Найдено (нг/мл), x SD Ax 8%
Кофеин 25 25,05 2,12 0,87 2,23 8,90
теофиллин 25 25,43 1,84 0,75 1,93 7,59
параксантин 25 24,97 1,90 0,78 2,00 8,00
теобромин 25 25,85 1,52 0,62 1,60 6,18
1.3,7-триметилмочевая кислота 50 50,67 4,47 1,82 4,69 9,25
Примечание, х - среднее арифметическое; ББ - стандартное отклонение; £.7 - стандартное отклонение среднего результата; Ах - 95%-й доверительный интервал результата отдельного определения; 8% - относительная погрешность отдельного определения.
концентрации 25 нг/мл составила не более 8,9%, параксантина - не более 8,0%, теобромина - не более 6,2%, и 1,3,7-триметилмочевой кислоты (для концентрации 50 нг/мл) - не более 9,3%.
Определение процента извлечения кофеина и его метаболитов из биоматериала
В целях определения полноты экстракции кофеина, теобромина, теофиллина, параксантина готовили стандартные растворы в ПФ с концентрациями 500, 1000 и 5000 нг/мл. В центрифужную пробирку с 0,45 мл плазмы крови добавляли 0,05 мл стандартного раствора, содержащего все анализируемые вещества соответствующей концентрации (50,0; 100,0 и 500,0 нг/мл). Смесь тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37°С. Исследуемые вещества извлекали из плазмы крови, для чего осаждали белки с помощью 0,5 мл ацетони-трила, прибавляя его в центрифужную пробирку. Содержимое пробирки перемешивали на вихревом миксере в течение 30 с. Полученный раствор центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант переносили в выпарительную колбу и выпаривали досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в ПФ и аликвоту вводили в петлю инжектора хроматографа. Концентрации анализируемых веществ определяли по три раза в каждом растворе. С учетом того, что чувствительность методики для 1,3,7-триметилмочевой кислоты составила 25 нг/мл, для определения процента извлечения этого соединения из плазмы крови использовали стандартные растворы в ПФ с концентрациями 1000
и 2500 и 10000 нг/мл. Далее поступали так же, как в случае кофеина и его метаболитов. В табл. 2 представлены результаты определения извлечения (%) кофеина и его метаболитов из плазмы крови крыс. Результаты исследования показали, что степень экстракции кофеина составляет 89,4±2,5%, теофиллина - 87,8±2,9%, параксантина - 85,9±4,4%, теобромина - 88,2±2,0% и 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 80,1±2,6%. Установлено, что в плазме крови крыс после введения кофеина в дозе 50 мг/кг содержится неизмененный препарат и два его метаболита (теобромин и параксантин).
Разработанную методику использовали для определения метаболических отношений кофеина, после перорального введения крысам афобазола (беспородные крысы, масса тела 200±20 г, перо-рально вводили афобазол в дозе 25 мг/кг 3 раза в день в течение 4 сут). При применении афобазола в данной дозировке отмечены статистически значимые изменения метаболических отношений кофеина к его метаболитам (теобромин и параксантин). Это может свидетельствовать о наличии межлекарственных взаимодействий при совместном приеме афобазола и препаратов, метаболизируемых изо-формой CYP1A2.
Разработанная методика ВЭЖХ может применяться для количественного определения кофеина и его метаболитов в биопробах. Метод обладает рядом достоинств: время определения каждой пробы составляет около 8 мин, простая пробоподготовка. Методику можно использовать для оценки активности изоформы CYP1A2 при изучении межлекарственных взаимодействий.
Т а б л и ц а 2
Степень извлечения (%) кофеина и его метаболитов из плазмы крови крыс (и = 3)
Анализируемо е вещество Взято (нг/мл) Найдено (нг/мл) Степень извлечения (%)
Кофеин 50 44,0±3,1 88,0
100 87,8±4,5 87,8
500 461,5±2,6 92,3
х ± SD = 89,4±2,5
Теофиллин 50 39,6±4,3 88,8
100 84,5±3,5 84,5
500 449,8±2,7 90,0
X ± SD = 87,8±2,9
Параксантин 50 41,1±6,4 82,2
100 84,7±4,3 84,7
500 453,7±3,8 90,7
X ± SD = 85,9±4,4
Теобромин 50 44,5±5,3 89,0
100 85,9±4,3 85,9
500 448,5±3,1 89,7
X ± SD = 88,2±2,0
1,3,7-Триметилмочевая кислота 100 77,7±5,8 77,7
250 207,1±4,2 82,8
1000 798,5±3,6 79,9
X ± SD = 80,1±2,6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Testa B., Kramer S.D. The biochemistry of drug metabolism: Principles, redox reactions, hydrolyses. Zurich, 2008.
2. Uney K, Tumer I, Tra§ B. // Xenobiotica. 2011. 41. N 7. P. 585.
3. Жердев В.П., Виглинская А.О., Колыванов Г.Б., Литвин А.А. // Тез. 5-й междунар. конф. «Биологический основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». М., 2010. C. 15.
4. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств / Под ред. В.В. Береговых. М., 2008.
5. Oh K.S., et al. // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2012. 895-896. P. 56.
6. Alvi SN, Hammami MM. // J. Chromatogr. Sci. 2011. 49. N 4. P. 292.
Поступила в редакцию 20.09.12
THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF CAFFEINE AND ITS METABOLITES IN RAT BLOOD PLASMA WITH HPLC TECHNIQUE, AS A METHOD FOR DETERMINATION OF METABOLIC RELATIONS
J.G. Novitskaya, A.A. Litvin, V.P. Zherdev, E.V. Blynskaya, S.E. Kondakov
(Federal State Budgetary Institute «Research Zakusov Institute of Pharmacology» under the Russian Academy of Medical Sciences; Chemistry Dept., M.V.Lomonosov MSU, 119991, Moscow, Lenin Hills, bld 3)
The technique of quantitative determination of caffeine and its metabolites in biological fluids (rat blood plasma) with use of a high performance liquid chromatography with UV-detecting was developed. The limits of quantitative detection of caffeine, paraxanthine, theobromine and theophylline were 10 ng/ml, 1,3,7 - three methyluric acid - 25 ng/ml respectively.
Key words: caffeine, theobromine, theophylline, paraksantin, 1,3,7-trimetiluric acid, high performance liquid chromatography, quantified.
Сведения об авторах: Новицкая Янина Геннадьевна - аспирант лаборатории фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (yanina.kolyvanova@yandex.ru); Литвин Александр Алексеевич - вед. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, докт. биол. наук (litbiopharm@yandex.ru); Жердев Владимир Павлович - профессор, зав. лабораторией фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, докт. мед. наук (zherdevpharm@mail.ru); Блынская Евгения Викторовна - ст. науч. сотр. лаборатории готовых лекарственных форм, канд. фарм. наук (eaureus@mail.ru); Кондаков Сергей Эмильевич - вед. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ, докт. фарм. наук (kse@excite.chem.msu.ru).
