CC BY
1А.А. Лукин, канд. техн. наук, доц., e-mail: lukin3415@gmail.com
Южно-Уральский государственный университет (Национальный исследовательский университет), г. Челябинск М.Б. Данилов, д-р техн. наук, проф., e-mail: tmkp@mail.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ С.В. Андреева, канд. техн. наук, доц., e-mail: sveta-opina@yandex.ru Забайкальский институт предпринимательства, г. Чита
УДК 637.69.032577.15
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ МЯСНЫХ БЕЛКОВ ПРОТЕАЗАМИ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Изучена возможность гидролиза белков в эмульсии, приготовленной из говядины II сорта (гидромодуль 1:2), ферментами микробного (протезим С, Flavourzyme 1000 L) и животного (протепсин) происхождения. Установлены физико-химические и биохимические условия гидролиза белков мяса. Определены оптимальные параметры ведения процесса гидролиза. Выявлено, что ферментные препараты микробного происхождения имеют более высокий температурный оптимум действия, чем препараты животного происхождения. Показано, что ферментный препарат микробного происхождения протезим С проявляет высокую протеолитическую активность по отношению к белкам мяса при значительно меньших концентрациях, чем Flavourzyme 1000 L - в 4,2 раза, протепсин - 1,7раза. Препараты микробного происхождения предпочитают нейтральный и слабощелочной характер среды. При продолжительности ферментации более 18 ч все исследуемые ферменты не приводят к заметному изменению степени гидролиза белков мясной эмульсии. На основании изучения степени гидролиза белков мяса различными ферментными препаратами установили, что грибные протеазы проявляют более высокую активность по отношению к белкам мяса, чем ферменты животного происхождения.
Ключевые слова: гидролиз, мясные белки, грибные протеазы, ферментные препарат, степень гидролиза.
A.A. Lukin, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
M.B. Danilov, Dr. Sc. Engineering, Prof.
S.V. Bryukhova, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
ENZYMATIVE HYDROLYSIS OF MEAT PROTEINS BY PROTEASES
OF DIFFERENT ORIGIN
The possibility of hydrolysis of proteins in an emulsion prepared from grade II beef (hydromodule 1:2) by enzymes of microbial (Protezim C, Flavourzyme 1000 L) and animal (Protepsin) origin has been studied. The physical-chemical and biochemical conditions of hydrolysis of meat proteins have been established. The optimal parameters of the hydrolysis process have been determined. It was revealed that enzyme preparations of microbial origin have a higher temperature optimum of action than preparations of animal origin. It was shown that the enzyme preparation of microbial origin Prostesim C exhibits high proteolytic activity in relation to meat proteins at significantly lower concentrations than Flavourzyme 1000 L-by 4.2 times, and Protepsin-by 1.7 times.. Preparats of microbial origin prefer a neutral and low-alkaft nature of the environment. With more than 18 hours of fermentation, all enzymes studied do not cause a noticeable change in the degree of hydrolysis of meat emulsion proteins. Based on a study of the degree of hydrolysis of meat proteins by various enzymes, it was established that fungal proteases are more active in relation to meat proteins than animal enzymes.
Key words: hydrolysis, meat proteins, fungal proteases, enzyme preparation, degree of hydrolysis.
Введение
Растущий спрос на белок в мировом масштабе диктует мясоперерабатывающей отрасли новые требования. Для переработки побочных и низкосортных мясопродуктов в более востребованные продукты на рынке необходимы новые методы их переработки. Эффективную переработку побочных продуктов мясной отрасли можно проводить путем ферментативного гидролиза белкового компонента, что позволит повысить его пищевую ценность. Протеоли-тические ферменты составляют одну из наиболее важных групп коммерческих ферментов, которые широко используются в промышленных процессах [3]. Многие ферменты представляют интерес для гидролиза мясных белков (папаин, Алкалаза®, Протамекс®, Flavourzyme®, Нейтраза®, Протозим С и др.).
Ферменты микробного происхождения также применяются для гидролиза мясного сырья. По сравнению с ферментами животного или растительного происхождения микробные ферменты обладают рядом преимуществ, включая широкий спектр каталитических активностей, более высокий рН и температурную стабильность [4].
Химический гидролиз белков, который достигается за счет расщепления пептидных связей кислотой или основанием, является одним из самым недорогих способов получения гид-ролизатов. Однако есть множество ограничений для пищевого сырья при использовании данного метода. Химический гидролиз, несмотря на дешевизну, представляет собой сложный технологический процесс с применением сильнодействующих кислот и оснований, происходящий при экстремальных температурах и рН. Полученные таким образом гидролизаты обычно обладают пониженной биологической ценностью, плохими функциональными свойствами и низкими вкусовыми качествами [2].
Кислотный гидролиз белков используется чаще, чем щелочной гидролиз. Хотя этот процесс сложен и его трудно контролировать, он по-прежнему является предпочтительным методом для получения гидролизатов. Кислотный гидролиз мясного белка обычно включает реакцию белков с соляной кислотой или, в некоторых случаях, с серной кислотой. Белки полностью гидролизуются при высокой температуре и часто под высоким давлением. Во время щелочного гидролиза мясного белка происходит быстрое расщепление белков до крупных водорастворимых полипептидов, за которым следует дальнейшая деградация с более медленной скоростью распада на аминокислоты. Кроме того, как для кислотного, так и щелочного гидролиза необходима нейтрализация, в результате которой образуется большое количество соли, что также усложняет дальнейшие технологические операции и ухудшает качество готового гидролизата.
Ферменты микробного происхождения используются во многих сферах пищевой промышленности. Применение микробных ферментов позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшить качество готовой продукции, увеличить ее выход, сэкономить ценное пищевое сырье, так как их применение позволяет ускорить одновременно несколько технологических процессов. Ферментный гидролиз является более перспективным и эффективным методом обработки мясного сырья [5, 6].
Цель данного исследования - оценка влияния ферментных препаратов (микробного и животного происхождения) на гидролиз белков говядины II сорта.
Материалы и методы исследований
Объекты исследования:
- говядина II сорта;
- Протозим С® - щелочная грибная протеаза (продуцент - Acremoniumchrysogenum), (производство компании «Энзим», г. Львов);
- Flavourzyme®1000 L - комплекс грибной протеазы, полученной при культивировании штамма Aspergillusoryzae, обладает как эндопептидазной, так и экзопептидазной активностью (производство компании Novozymes (Дания));
- Протепсин® - энзимный препарат животной природы (ООО «Завод эндокринных ферментов», п. Ржавки, Московская область).
Мясное сырье сначала измельчали в блендере Bosch®, а затем нагревали при температуре 85 °C в течение 20 мин для инактивации эндогенных ферментов. Для получения мясной эмульсии приготовленное сырье смешивали с дистиллированной водой 1:2 и гомогенизировали в смесителе Bosch® в течение примерно 2 мин при комнатной температуре. Условия гидролиза в зависимости от вида фермента представлены в таблице 1.
Процесс гидролиза проводили в стеклянных колбах объемом 250 мл на встряхиваемой водяной бане при постоянном перемешивании (200 об./мин). По истечении времени гидролиза полученные гидролизаты нагревали до 95 °С и выдерживали 20 мин для инактивации фермента.
Белок в исследуемых образцах определяли методом Кьельдаля. Содержание белка в гид-ролизате выражали в процентах к белку в исходной смеси. Все эксперименты проводились в трехкратной повторяемости [1].
Степень гидролиза белка (СГ) (%), определяли по формуле:
_ NAA-NAA0 NOA-NAA0'
где Noa - содержание общего азота, %; Naao - содержание аминного азота в негидролизован-ном сырье, %; Naa - содержание аминного азота в гидролизате, %.
Результаты исследований и их обсуждение
На первом этапе исследований подбирали условия гидролиза субстрата - мясной эмульсии.
При выборе ферментного препарата для гидролиза того или иного субстрата важно определить оптимальные условия ведения процесса ферментации. В настоящем исследовании для гидролиза принято мясное сырье, которое отличается многокомпонентностью как самого сырья, так и белковой фракции [7-9].
В настоящее время в мясной отрасли широко используются различные пищевые добавки и технологические вспомогательные вещества для улучшения свойств сырья и повышения потребительских показателей готового продукта. Следует отметить, что в каждом конкретном случае уточняются условия применения того или иного препарата, хотя они указываются производителем [10-13].
Были изучены наиболее важные факторы, влияющие на ферментативную активность исследуемых препаратов - грибных протеаз протозим С и Flavourzyme 1000 L и фермента животного происхождения протепсина.
На рисунке 1 представлены результаты изучения влияния температуры на активность исследуемых препаратов.
Исследованиями установлено, что активность изучаемых ферментов в разной степени зависит от температуры субстрата. Максимальную активность они проявляют в диапазоне температур от 37 °С для протепсина до 50 °С - для ферментов микробного происхождения. Отмечено, что повышение температуры свыше оптимальных значений приводит к резкому понижению активности микробиальных ферментов по сравнению с ферментом животного происхождения протепсином. Из рисунка 1 видно, что инактивация ферментов начинается при температуре выше 70 °С и при температуре ближе к 80 °С наступает полная инактивация всех ферментных препаратов.
Рисунок 1 - Влияние температуры на протеолитическую активность ферментов
Другим важным фактором, оказывающим влияние на активность исследуемых протеаз, является pH среды. Известно, что характер среды наряду с ее температурой, приводит не только к денатурационным процессам, но и к конформационным изменениям в активном центре ферментов [14-16].
На рисунке 2 представлены результаты исследования влияния pH-среды на протеолити-ческую активность ферментных препаратов.
■Протепсин —Flavourzyme 1000 L Протозим С
Рисунок 2 - Влияние рН на протеолитическую активность ферментов
Из рисунка видно, что при изменении pH субстрата от 6,0 до 9,0 ферменты проявляют высокую активность. Ферментные препараты микробного происхождения, так же как и при изучении влияния температуры, характеризуются значительно большей активностью, нежели ферменты животного происхождения. Максимальную активность также проявляет прото-зим С.
Другим важным фактором, влияющим не только на степень действия фермента на субстрат, но и на стоимость процесса, является его концентрация. Производители препаратов, как правило, называют достаточно широкий предел эффективной дозы фермента.
Поэтому на следующем этапе исследований изучили влияние дозы каждого ферментного препарата на эффективность ферментации исследуемой эмульсии. Пределы изменения дозы ферментов были приняты от минимальных значений до максимальных, которые рекомендованы производителями.
Результаты исследований представлены на рисунке 3.
60
Доза фермента, %
Протепсин Пауоигиуте 1000 I Протозим С
Рисунок 3 - Влияние дозы фермента на степень гидролиза
Данные рисунка 3 показывают, что при использовании в качестве субстрата мясной эмульсии рекомендуемые производителем дозы препаратов имеют незначительные различия. Наибольшую степень гидролиза при минимальной концентрации (0,06 %) обеспечивает фермент протозим С. Дальнейшее повышение концентрации не приводит к заметному повышению степени гидролиза.
Невысокую степень гидролиза обеспечивает фермент Flavourzyme 1000 L. Следует отметить, что степень гидролиза мясной эмульсии данным ферментом более чем в 2 раза ниже по сравнению с протозимом С, хотя доза последнего увеличивается почти на 40 % для обеспечения максимальной степени гидролиза.
Низкую степень гидролиза обнаружил фермент животного происхождения протепсин -лишь 15 %.
Для определения продолжительности гидролиза, обеспечивающей наибольшую степень гидролиза белков, процесс проводили в течение 18 ч.
Результаты исследований представлены на рисунке 4.
во
50 40
,_- зо 20 Ю О
1 2 3 6 9 12 15 18
Время гидролиза, ч
Протозии С Flavourzyme П ротепсин
Рисунок 4 - Содержание белка в гидролизе в зависимости от продолжительности гидролиза
Из рисунка 4 видно, что с увеличением продолжительности гидролиза для всех исследуемых ферментных препаратов степень гидролиза повышается. Наибольшие значения данного показателя обнаружены при продолжительности процесса 18 ч.
Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза свыше 18 ч не приводило к существенным изменениям степени гидролиза.
На основании данной серии экспериментов и рекомендации производителей ферментных препаратов были приняты следующие параметры ферментации, которые представлены в таблице.
Таблица
Условия гидролиза в зависимости от вида фермента
Показатель Ферментный препарат
Протозим С Flavourzyme 1000 L Протепсин
Температура, °С 50 50 37
Величина рН 9 7 6
Доза фермента, % 0,06 0,25 0,1
Продолжительность гидролиза, ч 18 18 18
Результаты изучения изменений содержания белка в гидролизатах через 1, 10 и 18 ч представлены на рисунке 5.
■ | _
IШIII |Ц
Рисунок 5 - Содержание белка (%) в гидролизате от времени гидролиза
44
Данные рисунка показывают, что гидролизаты, полученные с применением грибных протеаз, содержат большее количество белка. Максимальное содержание белка в гидролизате, полученном при обработке говядины II сорта протозимом С, составляет 82,54 %. Наименьшее содержание белка наблюдается в образце, обработанном протепсином (61,09 %).
Гидролиз белков говядины II сорта с использованием различных ферментов (микробного и животного происхождения) показал значительные различия по СГ белков и содержанию белков в гидролизате. Гидролизаты, полученные ферментативным путем с применением прото-зима С, имеют самое высокое содержание белка и СГ. Использование грибных протеаз (про-тозим С и Flavourzyme 1000 L) для гидролиза белков дает больше преимуществ в экономическом (стоимость ферментного препарата) и экологическом отношении по сравнению с ферментами животного происхождения и химическим гидролизом.
Результаты исследований показали, что гидролизаты, полученные с применением грибной протеазы протозима С, имеют самое высокое содержание белка (82,54 %) в системе через 18 ч гидролиза. Ферментативный гидролиз мясных белков протеазой животного происхождения (протепсин) имеет самое низкое содержание белка в системе (61,09 %).
Выводы
На основании выполненных исследований установлено, что грибные протеазы проявляют более высокую протеолитическую активность по отношению к белкам мяса, чем проте-аза животного происхождения протепсин.
Выявлены оптимальные условия гидролиза мясной эмульсии: грибные протеазы обладают более высокой термоустойчивостью по сравнению с протепсином - 50 °С против 37 °С.
Показано, что грибные протеазы высокую активность проявляют при более высоких значениях рН, чем протеаза животного происхождения: Flavourzyme 1000 L - при рН 7,0, прото-зим С - при рН 9,0. Максимальную активность протепсин проявляет в слабокислой среде -рН 6,0.
При изучении влияния концентрации фермента на степень гидролиза белков эмульсии обнаружены существенные различия: минимальная доза фермента, при которой обеспечивается максимальная степень гидролиза, составляет для протозима С 0,06 %, Flavourzyme 1000 L - 0,25 %, протепсина - 0,10 %.
При продолжительности гидролиза 18 ч все ферментные препараты проявляют наибольшую степень гидролиза. Максимальное содержание белка обнаружено в гидролизате, полученном при использовании Протозима С.
Библиография
1. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. -М.: Колос, 2001. - 376 с.
2. Мелещеня А.В., Савельева Т.А., Гордынец С.А. и др. Аминокислотный состав и сбалансированность коллагенсодержащего сырья, подвергнутого кислотному и щелочному гидролизу // Материалы междунар. конф. молодых ученых «Молодежь - науке». - 2018. - С. 278-284.
3. Соколова Т.В. Применение ферментных препаратов в народном хозяйстве // Пищевая промышленность. - 2001. - № 6. - С. 37-38.
4. Kumar N.S., Sreeja Devi P.S., Nair A.S. A review on microbial proteases // International Journal of Advanced Research. - 2016. - Vol. 4 (7). - P. 2048-2053.
5. Ovissipour M., Abedian A.M., Motamedzadegan A. et al. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from the Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera // Food Chemistry. - 2009. - Vol. 115. - P. 238-242.
6. Souza P.M., BittencourtM.L., Caprara C.C. et al. A biotechnology perspective of fungal proteases // Brazilian Journal of Microbiology. - 2015. - Vol. 46 (2). - P. 337-346.
7. Кудряшов А.С. Физико-химические и биохимические основы производств мяса и мясных продуктов. - М.: Де Ли принт, 2008. - 160 с.
8. Розанцев Э.Г. Биохимия мяса и мясных продуктов. - М.: Де Ли принт, 2006. - 240 с.
9. Корниенко В.Ю., Фомина Т.А., Минаев М.Ю. Обзор мировых тенденций видовой идентификации мяса. Ч. 2 // Мясная индустрия. - 2020. - № 3. - С. 39-42.
10. Хвостов Д.В., Коноров Е.А., Захарова М.В. и др. Применение протеаз в мясной индустрии: обзор // Мясная индустрия. - 2020. - № 11. - С. 32-37.
11. Жуманова Г.Т., Ребезов М.Б. Биотехнологическая обработка коллагенсодержащего сырья // Алматы технология лык университетшш хабаршысы. - 2019. - № 3. - С. 16-19.
12. Литвинова Е.В. Композит на основе биомодифицированного коллагенсодержащего сырья и растительных компонентов: получение, свойства, использование в технологии мясных продуктов: дис. ... канд. техн. наук: 05.18.04. - М., 2015. - 187 с.
13. Горбунков М.В. Физико-химические свойства протеолитического комплекса и применение ферментного препарата «Протепсин» для обработки сырья животного происхождения: дис. ... канд. техн. наук: 05.18.07, 05.18.04. - Воронеж, 2016. - 168 с.
14. Adrio J.L., Demain A.L. Microbial Enzymes: Tools for Biotechnological Processes [Text] // Bio-molecules. - 2014. - Vol. 4 (1). - P. 117-139.
15. Li Sh., Yang X., Yang Sh. et al. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marceting and Engineering [Text] // Comput. Struct. Biotechnol. J. - 2012. - Vol. 2.
16. P. M. de Souza [et al.]. A biotechnology perspective of fungal proteases [Text] // Braz. J. Microbial.
- 2015. - Vol. 46 (2). - P. 337-346.
Bibliography
1. Antipova L.V., Glotova I.A., Rogov I.A. Methods for the study of meat and meat products. - M.: Kolos, 2001. - 376 p.
2. Meleshchenya A.V., Savelev T.A., Gordynets S.A. et al. Amino acid composition and balance of collagen-containing raw materials subjected to acid and alkaline hydrolysis // Coll. of materials of International. Conf. of young scientists "Youth to Science". - 2018. - P. 278-284.
3. Sokolova T.V. The use of enzyme preparations in the national economy // Food industry. - 2001. -N 6. - P. 37-38.
4. Kumar N.S., Sreeja Devi P.S., Nair A.S. A review on microbial proteases // International Journal of Advanced Research. - 2016. - Vol. 4 (7). - P. 2048-2053.
5. OvissipourM., Abedian A.M., Motamedzadegan A. et al. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from the Persian sturgeon (Acipenser persicus) // Food Chemistry. - 2009. - Vol. 115. - P. 238-242.
6. Souza P.M., BittencourtM.L., Caprara C.C. et al. A biotechnology perspective of fungal proteases // Brazilian Journal of Microbiology. - 2015. - Vol. 46 (2). - P. 337-346.
7. KudryashovA.S. Physicochemical and biochemical foundations of meat and meat products. - M.: De Lee print, 2008. - 160 p.
8. RozantsevE.G. Biochemistry of meat and meat products. - M.: De Lee print, 2006. - 240 p.
9. Kornienko V.Yu., Fomina T.A., MinaevM.Yu. Overview of world trends in species identification of meat. P. 2 // Meat industry. - 2020. - N 3. - P. 39-42.
10. Khvostov D.V., Konorov E.A., Zakharova M.V. et al. Application of proteases in the meat industry: review // Meat industry. - 2020. - N 11. - P. 32-37.
11. Zhumanova G.T., Rebezov M.B. Biotechnological treatment of collagen-containing raw materials // Almaty technology luk universitinin khabarshys. - 2019. - N 3. - P. 16-19.
12. Litvinova E.V. Composite based on biomodified collagen-containing raw materials and plant components: production, properties, use in the technology of meat products: dis. ... Cand. Tech. Sci.: 05.18.04. -M., 2015. - 187 p.
13. GorbunkovM.V. Physicochemical properties of the proteolytic complex and the use of the enzyme preparation "Protepsin" for the treatment of raw materials of animal origin: dis. ... Cand. Techn. Sci.: 05.18.07, 05.18.04. - Voronezh, 2016. - 168 p.
14. Adrio J.L., Demain A.L. Microbial Enzymes: Tools for Biotechnological Processes [Text] // Bio-molecules. - 2014. - Vol. 4 (1). - P. 117-139.
15. Li Sh., YangX., Yang Sh. et al. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marceting and Engineering [Text] // Comput. Struct. Biotechnol. J. - 2012. - Vol. 2.
16. P.M. de Souza [et al.]. A biotechnology perspective of fungal proteases [Text] // Braz. J. Microbial.
- 2015. - Vol. 46 (2). - P. 337-346.
