CC BY
95
9. Cotter P.D., Hill C., Ross R.P. Bacteriocins: Developing innate immunity for food. Nat. Rev. Microbiol. 2005, vol. 3: 777-788.
10. Cameron A., Zaheer R., Adator E.H., Barbieri R., Reuter T., McAllister T.A. Bacteriocin Occurrence and Activity in Escherichia coli Isolated from Bovines and Wastewater. Toxins 2019, vol. 11: 475.
УДК 664.3.098
ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛАГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МИКРОБНОГО, РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
12 3*
С. А. Сухих , , канд. техн. наук, Е. В. Ульрих , д-р техн. наук,
1 2
О. О. Бабич , , д-р техн. наук,
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта», Калининград, Россия
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет», Кемерово, Россия
3Федеральное государственное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия», Кемерово, Россия
Коллаген является важным белком в организме животных и, в основном, находится в соединительных тканях и костях. Он содержит определенные аминокислоты, такие как глицин, пролин, гидроксипролин и аланин, которые также являются основным нерастворимым волокнистым белком во внеклеточном матриксе и соединительной ткани. Для гидролиза коллагена используется ряд таких методов как кислотный гидролиз, щелочной гидролиз и ферментативный гидролиз. Наиболее распространены кислотный и ферментативный гидролиз. Коллагеназы - это протеазы, обладающие способностью разрушать различные типы коллагенов. Актуальность работы заключается в изучении возможности использования микробных коллагеназ в процессе биопереработки коллагенсодержащих отходов для получения высококачественной коллагенсодержащей сырьевой основы с биологически активными веществами хондопротекторного свойства. Целью работы являлось изучение коллагеназной активности ферментов микробного, растительного и животного происхождения и обоснование выбора ферментов для гидролиза коллагенсодержащих отходов. Среди множества ферментов было выбрано четыре наиболее широко применяемых препарата с подтвержденной коллагеназной активностью: папаин, нейтраза, коллагеназа и «Протепсин». Полученные фракции коллагеновых белков, выделенных из коллагенсодержащего сырья (шкура свиная), подвергали ферментативному гидролизу выбранными ферментными препаратами при температуре и активной кислотности, соответствующих оптимуму активности ферментных препаратов. Визуализацию результатов осуществляли методом
электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. Исходя из результатов гидролиза видно, что наибольшую активность в отношении белков коллагенсодержащего сырья проявляют препараты «Коллагеназа пищевая» (источник выделения - ракообразные) и «Нейтраза 1.5 MG» (источник выделения - микроорганизмы). Доля белковой и пептидной фракции в гидролизате при самом высоком белковом профиле (130-70 кДа) составляет 0 и 2,1±0,06% соответственно. В то время как для «Протопепсина» это значение составило 25,9±0,77%, а для папаина - 20,7±0,62%. Таким образом, для проведения дальнейших исследований с целью изучения технологических основ биопереработки ферментами коллагенсодержащих отходов для обеспечения высококачественной коллагенсодержащей сырьевой основой с биологически активными веществами хондопротекторного свойства следует выбрать два ферментных препарата: ферментный препарат коллагеназу (источник получения - ракообразные) и ферментный препарат «Нейтраза 1.5 MG» (источник получения - микроорганизмы).
Ключевые слова: коллаген, ферменты, коллагеназа, гидролиз, коллагенсодержащее сырье, хондропротекторное действие.
Для цитирования: Сухих С.А.,Бабич О.О.,Ульрих Е.В. Изучение коллагеназной активности ферментов микробного, растительного и животного происхождения // АгроЭкоИнженерия. 2021. № 2 (107). С.142-148
STUDY OF COLLAGENASE ACTIVITY OF THE MICROBIAL, PLANT, AND ANIMAL ENZYMES - SUBSTANTIATION OF THE CHOICE OF ENZYMES FOR COLLAGEN-CONTAINING WASTE HYDROLYSIS
S.A. Sukhikh1,2, Cand. Sc. (Engineering), E.V. Ulrikh3 DSc (Engineering) O.O. Babich1,2, DSc (Engineering),
1Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, Russia 2
Kemerovo State University, Kemerovo, Russia
3
Kuzbass State Agricultural Academyб Kemerovo, Russia
Collagen is an essential protein in animals and is mainly found in connective tissues and bones. It contains specific amino acids such as glycine, proline, hydroxyproline, and alanine, which are also the main insoluble fibrous protein in the extracellular matrix and connective tissue. Several methods are used to hydrolyze collagen, such as acidic hydrolysis, alkaline hydrolysis, and enzymatic hydrolysis. The most common are acidic and enzymatic hydrolysis. Collagenases are proteases that can break down various types of collagens. The work's relevance lies in studying the possibility of using microbial collagenases for the collagen-containing waste bioprocessing to obtain a high-quality collagen-containing raw material base with biologically active substances of chondroprotective properties. This work aimed to study the collagenase activity of the microbial, plant, and animal enzymes and to substantiate the choice of enzymes for the collagen-containing waste hydrolysis. Among the many enzymes, four of the most widely used preparations with confirmed collagenase activity were selected: papain, neutrase, collagenase,
and Protepsin. The obtained fractions of collagen proteins isolated from collagen-containing raw materials (pork skin) were subjected to enzymatic hydrolysis with the selected enzyme preparations at a temperature and active acidity corresponding to the optimum activity of the enzyme preparations. The results were visualized by Laemmli polyacrylamide gel electrophoresis. Hydrolysis results showed that the preparations "Food collagenase" (extracted from crustaceans) and "Neutrase 1.5 MG" (produced by microorganisms) had the greatest activity in relation to proteins of collagen-containing raw materials. The share of protein and peptide fractions in the hydrolyzate with the highest protein profile (130-70 kDa) was 0 and 2.1 ± 0.06%, respectively. For "Protopepsin" this value was 25.9 ± 0.77%, and for papain - 20.7 ± 0.62%. Thus, for further research on the technological foundations of bioprocessing the collagen-containing waste by enzymes to provide a high-quality collagen-containing raw material base with biologically active substances of chondroprotective properties, two enzyme preparations should be selected: "Food collagenase" (extracted from crustaceans) and "Neutrase 1.5 MG" (produced by microorganisms).
Keywords: collagen, enzymes, collagenase, hydrolysis, collagen-containing raw materials, chondroprotective effect.
For citation: Sukhikh S.A., Babich O.O., Ulrikh E.V. Study of collagenase activity of the microbial, plant, and animal enzymes - substantiation of the choice of enzymes for collagen-containing waste hydrolysis. AgroEkoInzheneriya. 2021. No. 2(107): 142- 148 (In Russian)
Введение
Коллаген является важным белком в организме животных и в основном содержится в соединительных тканях и костях [1]. Он содержит определенные аминокислоты, такие как глицин, пролин, гидроксипролин и аланин, которые также являются основным нерастворимым волокнистым белком во внеклеточном матриксе и соединительной ткани [1, 2]. Созревший коллаген - это сильно сшитый материал, который обычно нерастворим в воде [3]. Водорастворимый и растворимый в кислоте коллаген можно извлечь только из молодых тканей. Возрастные различия в растворимости кожного коллагена были изучены по их восприимчивости к перевариванию пепсином [4, 5]. Для гидролиза коллагена используется ряд методов, такие как кислотный гидролиз, щелочной гидролиз и ферментативный гидролиз. Однако наиболее распространены
кислотный и ферментативный гидролиз. Для кислотного гидролиза обычно используется уксусная кислота в концентрации 0,5 М из-за ее эффективности по сравнению с другими кислотами, в то время как для ферментативного гидролиза обычно используется пепсин, алкалаза и другие [6]. Как правило, карбонат натрия и оксид магния используются для извлечения коллагена из отходов кожи [7].
Коллагеназы - это протеазы, обладающие способностью разрушать различные типы коллагенов. За счет жесткой тройной спиральной структуры коллагенов; они устойчивы к обычным протеазам, но могут легко расщепляться сайт-специфическим действием фермента коллагеназы [8]. Коллагеназы
преимущественно обнаруживаются в различных источниках, таких как ткани животных, растения и микроорганизмы, которые отличаются специфичностью
субстрата [9]. Недавние исследования показывают, что коллагеназы все чаще используются в фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности.
Актуальность работы заключается в изучении возможности использования микробных коллагеназ в процессе биопереработки коллагенсодержащих
отходов для получения высококачественной коллагенсодержащей сырьевой основы с биологически активными веществами хондопротекторного свойства, а также из-за их легкой доступности и безопасности, т.к. в новых исследованиях сообщается о производстве коллагеназы из непатогенных и аэробных микробных источников [10].
Целью работы являлось изучение коллагеназной активности ферментов микробного, растительного и животного происхождения.
Материалы и методы
В качестве объектов исследований были выбраны ферменты с подтвержденной коллагеназной активностью : папаин, нейтраза, коллагеназа и «Протепсин». Папаин, производимый из латекса плодов папайи, проявляет наибольшую активность по отношению к актомиозину, при 60 °C хорошо гидролизует не только мышечные белки, но также коллаген и эластин. Препарат «Нейтраза 1.5 MG» (Neutrase 1,5 MG) производства датской фирмы "Novozymes A/S" (Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd Denmark) (Дания) содержит нейтральную часть протеаз Bacillus amyloliguefaciens. Препарат «Коллагеназа пищевая» (ТУ 9281-
004-11734126-00) производства ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково Московской обл.), получаемый из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtshatica экстракциией. Ферментный препарат «Протепсин», производимый по ТУ 9219005-42789257 на базе ЗАО «Завод эндокринных ферментов» (Россия, Московская область, поселок Ржавки), является ферментом животного
происхождения и выделяется из мышечного желудка кур.
Для получения коллагенового белка применялся способ, описанный в патенте RU2609635C1. Полученные фракции коллагеновых белков, выделенных из коллагенсодержащего сырья (шкура свиная) подвергали ферментативному гидролизу выбранными ферментными препаратами, при температуре и активной кислотности, соответствующих оптимуму активности ферментных препаратов. Визуализацию результатов осуществляли методом
электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли. Проводили электрофоретическое разделение на однократном электродном буфере с внесением 0,1% додецилсульфата натрия при 15 мА. Гель окрашивали 0,2%-ным Coomassie(R) Brilliant Blue R 250 (Serva, Германия), который предварительно готовили на ледяной уксусной кислоте в течение 7-10 мин, после этого трижды промывали дистиллированной водой.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследований
представлены на рисунке 1 и в таблице 1.
Рис. 1. Результаты электрофоретических исследований коллагеновых белков после гидролиза: 1 - не ферментированная фракция; 2 - ферментация «Коллагеназа пищевая»; 3 - ферментация препаратом «Нейтраза 1.5 MG»; 4 - ферментация препаратом «Протепсин»; 5 - ферментация папаином
Таблица 1
Результаты изучения молекулярной массы коллагеновых белков, выделенных из коллагенсодержащего сырья (шкура свиная), подвергшихся ферментативному гидролизу
ферментными препаратами
Значение молекулярной массы белкового профиля, кДа Доля белковой и пептидной фракции в гидролизате, %
Не ферментирова нная фракция Ферментация препаратом «Коллагеназа пищевая» Ферментац ия препаратом «Нейтраза 1.5 MG» Ферментация препаратом «Протепсин» Ферментац ия папаином
130-70 кДа 5,6±0,17 0 2,1±0,06 25,9±0,77 20,7±0,62
70,0-40 кДа 0,4±0,01 0 8,4±0,25 10,8±0,32 10,4±0,31
40-35 кДа 0 5,2±0,16 10,9±0,32 1,1±0,03 5,9±0,17
35-25 кДа 0 9,6±0,28 25,6±0,76 0 0
25-15 кДа 0 26,8±0,80 24,6±0,73 0 0
15-10 кДа 0 58,4±1,75 30,5±0,91 0 0
Исходя из результатов гидролиза видно, что наибольшую активность в отношении белков коллагенсодержащего
сырья проявляют препараты
«Коллагеназа пищевая» (источник выделения - ракообразные и «Нейтраза
1.5 MG» - источник выделения микроорганизмы. Доля белковой и пептидной фракции в гидролизате при самом высоком белковом профиле (13070 кДа) составляет 0 и 2,1±0,06% соответственно. В то время как для «Протопепсина» это значение составило 25,9±0,77%, а для папаина - 20,7±0,62%.
биопереработки коллагенсодержащих обеспечения i
ферментами : отходов для высококачественной
Таким образом, для проведения дальнейших исследований с целью изучения технологических основ
Выводы
коллагенсодержащей сырьевой основой с биологически активными веществами хондопротекторного свойства следует выбрать два ферментных препарата: ферментный препарат коллагеназу (источник получения - ракообразные) и ферментный препарат «Нейтраза 1.5 MG» (источник получения -
микроорганизмы).
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных
1. Mashiko T., Takada H., Wu S. H., Kanayama K., Feng J., Tashiro K., Takato T. Therapeutic effects of a recombinant human collagen peptide bioscaffold with human adipose-derived stem cells on impaired wound healing after radiotherapy. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2018. Vol. 12. No. 5: 1186-1194.
2. Ferrario C., Rusconi F., Pulaj A., Macchi R., Landini P., Paroni M., Candia Carnevali M. D. From food waste to innovative biomaterial: sea urchin-derived collagen for applications in skin regenerative medicine. Marine drugs. 2020. Vol. 18. No. 8: 414.
3. Taylor N. Nonsurgical management of osteoarthritis knee pain in the older adult. Clinics in geriatric medicine. 2017. Vol. 33. No. 1: 41-51.
4. De Luca P., Colombini A., Carimati G., Beggio M., de Girolamo L., Volpi P. Intra-Articular Injection of Hydrolyzed Collagen to Treat Symptoms of Knee Osteoarthritis. A Functional In Vitro Investigation and a Pilot Retrospective Clinical Study. Journal of clinical medicine. 2019. Vol. 8. No. 7: 975.
5. Bhagwat, P. K., Dandge P. B. Collagen and collagenolytic proteases: A review. Biocatalysis and agricultural biotechnology. 2018. No. 15: 43-55.
6. Kiew P. L., Don M. M. The influence of acetic acid concentration on the extractability of collagen from the skin of hybrid Clarias sp. and its physicochemical properties: A preliminary study. Focus Mod. Food Ind. 2013. Vol. 2: 123-128.
7. Fu Y., Young J. F., Rasmussen M. K., Dalsgaard T. K., Lametsch R., Aluko R. E., Therkildsen M. Angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptides from bovine collagen: insights into inhibitory mechanism and transepithelial transport. Food Research International. 2016. Vol. 89:
8. Pal G. K., Suresh P. V. Sustainable valorisation of seafood by-products: Recovery of collagen and development of collagen-based novel functional food ingredients. Innovative food science and emerging technologies. 2016. Vol. 37: 201-215.
исследований (проект №20-316-70002\19 от 21.11.2019.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
373-381.
9. Baehaki A. A., Suhartono M. T., Syah D., Sitanggang A. B., Setyahadi S., Meinhardt F. Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11. 4. African Journal of Microbiology Research. 2012. Vol. 6. No. 10: 2373-2379.
10. Mao J. S., Cui Y. L., Wang X. H., Sun Y., Yin Y. J., Zhao H. M., De Yao K. A preliminary study on chitosan and gelatin polyelectrolyte complex cytocompatibility by cell cycle and apoptosis analysis. Biomaterials. 2004. Vol. 25. No. 18: 3973-3981.
