CC BY
469
Р. К. Закиров, Ф. Ю. Ахмадуллина, И. В. Вербенко,
А. С. Сироткин
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ИЛОВ
В ПРОЦЕССАХ ПРОДЛЕННОЙ АЭРАЦИИ СТОЧНЫХ ВОД
Ключевые слова: диагностика, каталазная активность, возраст ила, diagnostics, catalase
activity, the age of silt.
Изучена каталазная активность промышленных илов процесса продленной аэрации. Показана, что активность каталаз зависит от состава сточных вод, возраста, стадии развития, физиологии микроорганизмов смешанной популяции и других факторов. Высокая чувствительность каталаз к изменению условий окружающей среды, обусловливает перспективность использования показателя каталазной активности для оценки состояния биоценоза промышленных илов зрелого возраста с целью регулирования процесса биоочистки сложных по составу сточных вод. Catalase activity of industrial sludge were studied in process of prolong gravity ventilation. Activity of catalases depend on composite wastewater, age, stadium of development, microbial physiology of mixed population and other factors. Catalases are very raw to environmental changes. That is why, index of catalase activity will be useful in valuation of station biocenosis industrial sludge of adult age. It is necessary for regulation biological treatment of water, which has complex mixture.
Наиболее распространенным и используемым в практике водоочистки методом оценки и прогнозирования работы очистных сооружений является использование унифицированных показателей общей загрязненности сточных вод - химическое и биологическое потребление кислорода. Однако последние не отвечают современным требованиям оперативности, экспрессности и полной достоверности, особенно при очистке многокомпонентных стоков, содержащих специфические ингредиенты, как ксенобиотики и экотоксиканты. Эти поллютанты даже в низких концентрациях способны оказывать негативное воздействие на биоценоз активного ила благодаря синергическому эффекту [1]. Поэтому назрела необходимость разработки и совершенствования методов оценки качества работы очистных сооружений, прежде всего биологических. Биохимическая активность ила характеризуется активностью комплекса ферментов его микрофлоры. В связи с этим большое внимание в настоящее время уделяется разработке методов ферментативной диагностики для оценки физиологического состояния активного ила и контроля очистных сооружений [2-4], благодаря высокой чувствительности ферментов к изменению условий внешней среды.
Конститутивный характер дегидрогеназ, центральное положение, которое занимает дегидрирование при биологическом окислении органических веществ, а также относительная простота методов определения активности дегидрогеназ (особенно с применением солей тет-разолия), обусловили широкое применения дегидрогеназной активности (ДАИ) как для оценки состояния экосистемы промышленных илов, так и токсичности сточных вод [5, 6].
Однако применение показателя ДАИ в качестве биохимического критерия контроля актуально и эффективно для очистных сооружений, реализующих процессы аэрации с илами «молодого» и «среднего» возраста. Что касается процессов продленной аэрации с низконагружаемыми илами большого возраста (более 30 суток), их низкая дегидрогеназная
активность значительно снижает информативность ферментативного метода контроля. Очевидно, длительная аэрация сточных вод и, как следствие, глубокое использование субстрата приводит к развитию нитрификационных и стабилизационных процессов в аэротеке. В результате система активного ила переходит на эндогенное дыхание, характеризующееся низкой дегидроге-назной ативностью ила, как было установлено ранее (рис. 1).
Учитывая, что наиболее значимую роль в процессах аэробной биологической очистки сточных вод имеют окислительные процессы, считаем перспективным и целесообразным изучение каталазной активности (КА) зрелых илов с целью контроля за поступлением на очистные сооружения промышленных стоков, тормозящих процесс биологической очистки.
Процесс биологической очистки сточных вод осуществляется аэробными и анаэробно факультативными микроорганизмами, обязательно содержащими каталазу. Присутствие в клетке микроорганизмов активнейшего фермента каталазы может объясняться только универсальностью протекания в них процессов образования, присутствия и накопления в них перекиси водорода как промежуточного продукта трансформации органических загрязнений [9]. В то же время пероксид водорода относится к активным формам кислорода (АФК), обладает высокой цитотоксичностью в отношении любых типов клеток и клеточных образований, может вызвать значительные сдвиги в метаболизме микроорганизмов, приводить к развитию окислительного стресса и относится к соединениям, обладающим высокой мутагенной активностью [10]. В связи с этим как многоклеточные, так и одноклеточные организмы выработали защитные механизмы предотвращения образования повышенных концентраций перекиси водорода - фермент каталазу.
По своей химической природе каталаза - протеид, в состав ее входят порфириновое ядро с железом и белок [11-14]. Каталаза катализирует диспропорционирование перекиси водорода до воды и кислорода, защищая клетки от окислительного эффекта пероксида.
Вышеизложенное, а также причинная взаимосвязь повышения концентрации активных форм кислорода (в том числе Н2О2) в клетке с негативным воздействием экофакторов различной природы, приводящим к нарушению нормального метаболизма, объясняет перспективность исследований в направлении изучения каталазной активности промышленных илов с целью корректировки функционирования очистных сооружений.
Публикации, касающиеся каталазной активности смешанных биоценозов микроорганизмов единичны, тем не менее, в них наглядно и убедительно подтверждается высокая чувствительность молекулярных форм каталаз, участвующих в процессе водоочистки, к неблагоприятным ситуациям, возникающим при эксплуатации биостанций [2].
Рис. 1 - Дегидрогеназная активность промышленных илов
В настоящей работе представлены результаты исследования каталазной активности промышленных илов зрелого возраста, формирующихся на стоках производств органического синтеза, функционирующих в условиях продленной аэрации. На сегодняшний день практически отсутствуют данные о закономерностях изменения каталазной активности «старых» илов. Возникает необходимость систематизации и развития имеющейся информации об оксиредуктазной активности промышленных илов, что представляет не только теоретический, но и практический интерес.
Определяли каталазу оксидиметрическим методом, в котором оставшаяся после действия каталазы неразложившаяся перекись водорода титруется раствором КМп04 [15]. Согласно [3] данная методика определения ферментативной активности отличается более высокой точностью и воспроизводимостью. В результате серии экспериментальных исследований промышленных илов была установлена их высокая каталазная активнсть, изменяющаяся в широком диапазоне: 15,6 - 42,4 мг Н2О2/г-мин. Значительный разброс величин активности фермента вполне закономерен, учитывая различные условия функционирования действующих очистных сооружений: непостоянство состава и расхода сточных вод, колебания нагрузки, возможности влияния специфичных поллютантов и др. Это согласуется с данными ряда авторов [2, 4, 16, 17], показавших, что активность каталаз весьма различна в зависимости от вида, возраста, стадии развития, физиологического состояния организма и от многих других факторов.
Тем не менее, систематизация полученных результатов по ряду определяющих признаков позволила выявить некоторые закономерности изменения каталазной активности смешанных биоценозов. Так, в аналогичных условиях формирования активного ила по специфичным ингредиентам (содержание основных ксенобиотиков и экотоксикантов в реальных стоках колебалось незначительно в пределах проектных данных), рН, кислородному режиму, а также практически при одинаковой дозе ила в аэротенке (4,5 - 4,8 г/л), но существенном изменении загрязненности сточных вод, определяемой по ХПК, наблюдалась обратная зависимость каталазной активности от возраста ила (ВИ) (рис. 2). Последний параметр в работе оценивался опосредованно на основании сопоставления приведенной нагрузки по ХПК и соответствующей дозы циркулирующего ила (табл. 1).
Таблица 1 - Величины приведенной нагрузки и соответствующей дозы циркулирующего ила (аци)
ХПК, мг/л 1080 963 909 760 730 680
Я=ХПК/ааэр, мг/г 240 214 202 168,8 162,2 151,1
аци, г/л 11,0 9,52 9,07 8,74 8,4 7,6
Взаимосвязь ката-
лазной активности и дозы циркулирующего ила может быть описана корреляционной зависимостью: у = -1,719х + 26,511, Н =
0,82.
Высокое значение коэффициента детерминации (Н =0,82) свидетельствует о достаточно хорошей сходимости экспериментальных и расчетных данных.
Очевидно, значи-
тельное колебание величины ХПК сточных вод, и как следствие колебание нагрузок на активный ил обусловливают функционирование ила непостоянного возраста [1]. Причем, прослеживается определенная тенденция: чем больше ХПК, тем моложе должен быть активный ил, тем больше его прирост, что и наблюдалось в наших образцах - увеличение дозы ила после отстаивания во вторичном отстойнике.
По возрасту ила можно судить о физиологических характеристиках смешанной популяции. Согласно [5, 18], в молодых илах биоагент находится в экспоненциальной фазе развития, в зрелых илах - фазах замедленного роста, стационарной и постстационарной фазах. Существуют наблюдения [19], что клетки, которые перестали расти, растут медленно или входят в раннею стационарную фазу, приобретают устойчивость к стрессу, что установлено как для аэробных, так и анаэробно факультативных микроорганизмов. Очевидно, это связано с более активной генерацией АФК, и в первую очередь, супероксид аниона, который служит инициатором ряда реакций, приводящих к образованию других форм кислородных метаболитов и, в первую очередь, к наработке перекиси водорода [20].
О2- + О2- + 2Н+С°3*Н2О2 + О2
- супероксиддисмутаза
И в случае смешанной популяции микроорганизмов активного ила зрелого возраста повышенное образование эндоперекиси, вероятно является причиной более высокой ката-лазной активности, что так же подтверждается результатами наших исследований.
Однако сопоставление каталазной активности промышленных илов различных очередей действующей биостанции, работающих при различных дозах ила, и как следствие нагрузках выявило более сложный характер взаимосвязи активности фермента и возраста ила, более наглядно проявляющийся при низких значениях ХПК стока (табл. 2). В период исследования доза активного ила в I очереди изменялась в пределах 2,5 - 3 г/л, III - 4-4,5 г/л, и следовательно, в последнем случае функционировал активный ил большего возраста (ВИ=/(1/д).
Рис. 2- Влияние возраста ила на каталазную активность циркулирующей иловой суспензии
Таблица 2 - Влияние приведенной нагрузки ^) на каталазную активность
ХПК, мг/л I очередь III очередь
Ч, мг/г КА, мгН2О2/г-мин Ч, мг/г КА, мгН2О2/г-мин
730 162,2 21,0 132,7 19,6
680 151,1 25,7 123,6 17,4
575 127,8 19,5 104,5 16,3
Полученные данные свидетельствуют, что увеличение возраста ила в процессах продленной аэрации, что соответствует стационарной или постстационарной фазе развития микробной популяции [18], приводит к снижению каталазной активности биоценоза смешанной популяции. Аналогичная картина наблюдалась в процессе периодического культивирования B. fragiMs: каталазная активность достигала максимума экспрессии в поздней логарифмической или ранней стационарной фазах роста, снижаясь в стационарной [16]. Возможно, это связано с фактором старвации, приводящим к синтезу ферментов антиокислительной защиты [21-23], возможно с проявлением инактивирующего действия окисленных форм азота. Каталаза обнаруживает особенную чувствительность к нитратным анионам, которые оказывают на нее инактивирующее действие. Аналогичное действии оказывают и нитриты. Нитрит пи определенных условиях способен восстанавливаться до окиси азота - эффективного ингибитора этого фермента [17]. Показана также способность нитрита образовывать комплексы с ферригемсодержащими белками, в том числе и катала-зой. В условиях проведения экспериментальных работ возможно влияние этих двух факторов, так как илы процессов продленной аэрации относятся к низконагружаемым и нитрифицирующим илам.
Что касается влияния экотоксикантов на каталазную активность зрелых илов, то в работе рассматривалось влияние неионогенных синтетических поверхностноактивных веществ (нСПАВ) на активность фермента, так как они являются одной из основных причин нарушения работы очистных сооружений и способности самоочищения водоемов.
Загрязнение окружающей среды, особенно водных объектов ПАВами представляет серьезную проблему, учитывая высокую чувствительность к ним всех гидробионтов [24]. Проблема усугубляется еще и тем, что ПАВы оказывают ингибирующее действие на биохимические процессы разложения других ксенобиотиков [25].
В работе изучалось влияние нПАВов на каталазную активность промышленного ила, являющихся основным специфическим ингредиентом исследуемых сточных вод. Для этого в иловую суспензию с учетом исходного содержания нПАВ в стоке добавлялся аликвотный объем 0,1% раствора полиэтиленоксида (ПЭО), доводя концентрацию исследуемого поллютанта соответсвенно до 10, 20, 30... 100 мг/л, после чего определяли активность фермента. Результаты трех отдельных экспериментов приведены на рис. 3. Полученные качественно аналогичные экстремальные кривые свидетельствуют о едином механизме действия неионогенных СПАВ на зрелые илы в диапазоне концентраций 10-100 мг/л. Однако различия в условиях их формирования: незначительные колебания нагрузки на ил, рН, содержания других ксенобиотиков, обусловили, как и следовало ожидать, количественные изменения относительной величины каталазной активности при разных дозах ксенобиотика. Введение относительных характеристик - это необходимое условие, позволяющее корректно
сопоставить результаты ряда экспериментальных исследований, так как исходные промышленные илы имели различную каталазную активность по выше указанным причинам.
Полученный характер кривых объясняется последствием действия различных концентраций поли-этиленоксида.
На I этапе уменьшение каталазной активности промышленного ила вероятнее всего связано со снижением эффекта лимитирования по субстрату. Как известно, фактор голодания приводит к синтезу анти-окислительных ферментов [21]. В нашем случае объектом исследования являлся нерегенерированный промышленный ил зрелого возраста. Смешение его со сточной водой, содержащие нСПАВы в концентрации от 10 до 30 мг/л снимало эффект репрессии, обусловленный фактором старвации. Что касается негативного воздействия ПЭО, то исследуемый ил адаптирован к концентрациям нСПАВ до 30 мг/л (согласно производственным данным), не последнюю роль играет также наличие эк-зополимерного геля [26], выполняющего защитную функцию [1]. Также необходимо учесть, что нПАВы практически не обладают антимикробной активностью [25], и поли-этиленоксид не является исключением, что обеспечивает его достаточно высокую деструкцию при биологической очистке.
При дальнейшем увеличении концентрации ксенобиотика наблюдался значительный рост активности каталаз, что свидетельствует о стрессировании микроорганизмов смешанной популяции. Согласно [27], деструктирующее действие нПАВов зависит в значительной мере от концентрации ПАВ. Увеличение концентрации полиэтиленоксида повышает вероятность контакта микроорганизмов с поллютантом, который сорбируется на поверхности бактериальных клеток. В случае нПАВ электронейтральные молекулы, по-видимому, связываются с клеточной оболочкой благодаря наличию сильной гидрофобной группы и в результате межмолекулярного Н-связывания сорбируются на клетках, вызывая у микроорганизмов целый ряд повреждений и изменений, и в первую очередь происходит измельчение клеток и колоний [28]. Аналогичная картина наблюдалась и в наших экспериментах по биоиндикации промышленных илов.
При концентрациях полиэтиленоксида 75 и 100 мг/л наблюдается снижение ката-лазной активности, которое, очевидно, связано с механизмом действия ПАВ. После адсорбции и проникновения внутрь клеточной стенки ПАВ взаимодействует с липопротеид-ными комплексами, включая реакции с гидрофобными участками белков и ориентированных липидов, в результате чего мембраны перестают служить барьером проницаемости.
С, мг/л
Рис. З - Влияние концентрации нПАВ на каталаз-ную активность ила в различных опытах
Следствием этого может являться инактивация фермента за счет его комплексообразова-ния с полиэтиленоксидом по донорно-акцепторному механизму [29], аналогично нитриту, который способен образовывать комплексы с ферригемсодержащими белками, в том числе и каталазой, зафиксированные при больших нефизиологических концентрациях нитрита (10-3 - 10-1 М) [17].
Еще одним аргументом, подтверждающим вышеизложенное, могут служить данные по торможению действия каталазы ионами хлора, ацетата, фосфата. Считают [30], что гидроксильный ион, непосредственно участвующий в реакции каталазы с перекисью, может при определенных условиях быть вытесненным другим анионом, который займет его место у железа.
В результате проведенных исследований установлено, что каталазная активность промышленных илов процессов продленной аэрации, функционирующих в условиях непостоянства состава и нагрузок, изменяется в широком диапазоне. Показано влияние возраста ила на активность каталаз, зависящей от стадии развития микроорганизмов смешанной популяции. Установлена общая закономерность изменения каталазной активности от концентрации нСПАВ, выявлен ее сложный экстремальный характер, обусловленный дозой ксенобиотика, возрастом ила и степенью его адаптации к нСПАВам.
Высокая чувствительность каталаз к изменению условий окружающей среды, обусловливает перспективность использования показателя каталазной активности для оценки состояния биоценоза промышленных илов зрелого возраста с целью регулирования процесса биоочистки сложных по составу сточных вод.
Литература
1. Жмур, Н. С. Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками / Н. С. Жмур. - М.: АКВАРОС, 2003. - С. 510 - 512.
2. Негода, Л.Л. Оценка состояния биоценоза биологической пленки по активности окислительновосстановительного фермента - каталазы / Л.Л. Негода [и др.] // Химия и технология воды. -1986. - Т.8. - №6. - С. 82-86.
3. Тимофеева, С.С. Энзимоиндикация качества очистки сточных вод в аэротенке / С.С. Тимофеева // Химия и технология воды. - 1987. - Т.9. - №5. - С. 444-449.
4. Телитченко, М.М. Энзимоиндикация биологической очистки сточных вод / М. М. Телитченко, И. Ф. Шаталаев, Т. Б. Волгина // Водоснабжение и санитарная техника. - 1993. - № 5. - С. 10 - 12.
5. Гюнтер, Л.И. Применение метода определения дегидрогеназной активности ила (ДАИ) для исследования и контроля аэротенков / Л. И. Гюнтер // Научн. тр. АКХ. - 1976. - Вып.23. - С. 67-78.
6. Гюнтер, Л.И. Оценка токсичности компонентов промышленных сточных вод по дегидрогеназной активности ила /Л.И. Гюнтер, М.А.Беляева, М.М. Ребарбар // Водоснабжение и санитарная техника. - 1976. - №9. - С.9 - 12.
7. Наумова, Р.П. Окислительная активность бактерий при биологической очистке промышленных сточных вод / Р.П. Наумова, Л.П. Усманова, В.В. Вороненко, Р.Х. Зеленова // Химия и технология воды. - 1983. - Т. 5. - №1. - С. 71 - 74.
8. Пронина, Е.В. Влияние ультразвука низкой частоты на ферментативную активность промышленного ила / Ф.Ю. Ахмадуллина, Р.К. Закиров, Р.Х. Хузаянов // Химическая промышленность. -2006. - Т.83.- №. 1.- С.37-42.
9. Гамалей, И.А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И. А. Гамалей, И. В. Мобин // Цитология. - 1996.- Т. 38. - С. 1232 - 1238.
10. Кулинский, В. И. Активные формы кислорода / В. И. Кулинский, Л. С. Колесниченко // Успехи соврем. биологии. - 1990. - Т. 110. - С. 20 - 33.
11. Евреинова, Т.Н. Концентрирование веществ и действие ферментов в коацерватах / Т.Н. Евреи-нова- М.: Наука, 1966.- 227 с.
12. Чумаченко, Ю. Ч. Физико-химические свойства каталазы Penicillium vitale pidopl. Et bitai / Ю.
Ч. Чумаченко, М. Ф. Гулый. - Киев : Институт биохимии АН УССР, 1975. - 120 с.
13. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Элиот, Д. Элиот; пер. с англ. - М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002. - 446 с.: ил.
14. Фершт, Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт : пер. с англ. - М.: Мир, 1970. - 693 с.
15. Землянухин, А.А. Малый практикум по биохимии / А.А. Землянухин. - Воронеж: Воронежский университет, 1985. - 128 с.
16. Брюханов, А.Л. Каталаза и супероксиддисмутаза: распространение, свойства и физтческая роль в клетках строгих анаэробов / А.Л. Брюханов, А.И. Нетрусов // Биохимия. - 2004. - Т.69. - №9. -С. 1170-1186.
17. Титов, В.Ю. Взаимодействие нитрита с каталазой как важный элемент его токсичности / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко // Биохимия. - 2004. - Т.68. - №6. - С. 769-776.
18. Коровин, Л.К. Аэробная стабилизация активного ила (теория и практика) / Л.К. Коровин. - М.: Лесная промышленность, 1990. - 128 с.
19. Воробьева, Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий / Л.И. Воробьева // Прикладная биохимия и микробиология.-2004.-Т.40. - №3.-С. 261-269.
20. Зенков, Н.К. Окислительный стресс / Н.К.Зенков, В.З.Ланкин, В.Б.Меньщикова. - М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. - 343 с.
21. Смирнова, Г.В. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий E/coli / Г.В.Смирнова, О.А.Торхова, О.Н.Октябрьский // Микробиология.-2004.-Т.40, №4.-С. 387-397.
22. Турпаев, К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т.Турпаев // Биохимия .-2002.-Т.67, вып.3.-С. 332-352.
23. Marx, J.L. Oxygen free radicals liked to many diseases / J.L. Marx // Science. - 1985.-Vol. 235. - P. 529 - 531.
24. Ставская, С. С. Микробиологическая очистка сточных вод от поверхностно-активных веществ / С.С. Ставская, В.М. Удод, Л.А. Таранова, И.А. Кривец. - Киев: Наук. думка, 1988. - 183 с.
25.Кузнецов, А.Е. Научные основы экологической биотехнологии: Учебное пособие для студентов / Е.А. Кузнецов, Н.Б. Градова. - М.: Мир, 2006. - 504 с.
26 Ахмадуллина, Ф.Ю. Влияние возраста ила на закономерности процесса аэробной стабилизации промышленных илов / Ф.Ю. Ахмадуллина [и др.] // Химическая промышленность. - 2003. - Т.80.
- №7. - С. 454-462.
27. Лукиных, Н.А. СПАВы. Биологическая очистка сточных вод содержащих поверхностноактивные вещества / Н.А Лукиных. - М.: Стройиздат, 1972. -93 с.
28. Кривец, И.А. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием поверхностно-активных веществ / И.А. Кривец // Химия и технология воды. - 1984. - Т.6, №5. - С. 454-462.
29. Гурьянова, Е.Н. Донорно-акцепторная связь / Е.Н Гурьянова, И.П. Гольдштейн, И.П. Ромм. -М.: Химия, 1973. - 400с
30. Еремин, А. Н. Сравнительная кинетическая характеристика каталаз грибов рода Penicillium / А.Н. Еремин, Р.В. Михайлова, Д.И. Метелица // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000.
- Т.36. - №3. - С. 261-266.
© Р. К. Закиров - канд. техн. наук, доц. каф. промышленной биотехнологии факультете пищевых технологий КГТУ; Ф. Ю. Ахмадуллина - ст. препод. той же кафедры И. В. Вербенко - асп. той же кафедры; А. С. Сироткин - д-р техн. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии факультете пищевых технологий КГТУ.
