Научная статья на тему 'Ферментативная активность ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании'

Ферментативная активность ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
528
104
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Нива Поволжья
ВАК
Ключевые слова
КСИЛОТРОФНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ / ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СТРАТЕГИИ / ФЕРМЕНТЫ / БИОКОНВЕРСИЯ

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Ильин Дмитрий Юрьевич, Ильина Галина Викторовна, Лыков Юрий Сергеевич, Морозова Мария Игоревна

Приводятся результаты исследования ферментативной активности культур ксилотрофных базидиомицетов на лигноцеллюлозных субстратах различной структуры. Установлены зависимости уровней ферментативной активности от экологических особенностей видов. Показаны возможности интенсификации некоторых сторон ферментативной активности грибов путем обработки субстрата с целью повышения содержания метоксильных групп лигнина.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Ильин Дмитрий Юрьевич, Ильина Галина Викторовна, Лыков Юрий Сергеевич, Морозова Мария Игоревна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Ферментативная активность ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании»

УДК 582.84

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Д. Ю. Ильин, канд. биол. наук, доцент; Г. В. Ильина, канд. биол. наук, доцент; Ю. С. Лыков*, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник; М. И. Морозова, аспирант

ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА»; *РЦГЭКиМ по Пензенской области ФБУ «ГосНИИЭНП», е-таП: д-1!ута@уа^ех. ги

Приводятся результаты исследования ферментативной активности культур кси-лотрофных базидиомицетов на лигноцеллюлозных субстратах различной структуры. Установлены зависимости уровней ферментативной активности от экологических особенностей видов. Показаны возможности интенсификации некоторых сторон ферментативной активности грибов путем обработки субстрата с целью повышения содержания метоксильных групп лигнина.

Ключевые слова: ксилотрофные базидиомицеты, экологические стратегии, ферменты, биоконверсия.

Разносторонние исследования, посвященные изучению особенностей развития и оптимизации процесса выращивания дереворазрушающих грибов в культуре, имеют особое как теоретическое, так и практическое значение. Наиболее значительную долю культивируемых в мире съедобных и лекарственных базидиомицетов составляют именно виды - представители группы ксилотрофов. Ежегодно в культуру вводятся новые виды, перспективные в качестве продуцентов грибного белка для пищевых целей, а также виды, для которых установлены те или иные ценные свойства. При этом в качестве таких свойств рассматривают как способность грибов продуцировать биологически активные вещества различной природы, так и ферментативную активность, позволяющую использовать дереворазрушаю-щие грибы в качестве деструкторов стойких органических токсикантов, в биоконверсии органических остатков. В природе биодеструкция целлюлозных и лигнинсо-держащих субстратов базидиальными грибами представляет собой подобный конвейеру многоступенчатый полиэнзимати-

ческий процесс, где ведущими факторами являются внеклеточные целлюлазы, кси-ланазы, протеиназы, пектиназы и целый комплекс окислительных ферментов [1].

Различия в типах разложения растительных субстратов грибами заключаются в доле участия ферментов, катализирующих гидролиз или окисление основных компонентов - целлюлозы и лигнина. Разница в типах гниения древесины позволила выделить две группы грибов: возбудители бурой и белой гнили [2]. Грибы бурой гнили разлагают, преимущественно, полисахариды, а разложение лигнина ограничено деметилированием, лишь незначительная часть лигнина может разлагаться до СО2. Наиболее важной группой грибов, способных разлагать лигнин, являются грибы белой гнили древесины. Эти грибы вырабатывают ферменты, деструктирующие лигнин, а также ферменты, разрушающие пектины, по-лиозы и, в том числе, целлюлозу.

Исследования особенностей ферментативной активности коллекционных культур ксилотрофных базидиомицетов проводились на базе межфакультетской лабора-

тории ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА». Было изучено по три штамма следующих видов: Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilát (трутовик скошенный), Phellinus tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P. N. Borisov (ложнотрутовик осиновый), Fomitopsis pinícola (Sw.) P. Karst. (трутовик окаймленный), Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill (трутовик серно-желтый), Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. (трутовик плоский), Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (трутовик лакированный), Fomes fomentarius (L.) J. J. Kickx (трутовик настоящий), Heterobasidion anno-sum (Fr.) Bref. (корневая губка) Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. (трутовик ки-новарно-красный), Fistulina hepatica (Scha-eff.) Sibth (трутовик печёночный). Среди названных видов присутствуют представители различных экологических стратегий (об-лигатные и факультативные паразиты, факультативные сапротрофы, эври- и стено-трофные виды по отношению к субстрату), а также представители грибов бурой и белой гнили древесины. В рамках твердофазного культивирования на различных субстратах (нативном, представляющем собой экстрагированные дубовые опилки, и метанолизном - дериватизированных путем метанолиза дубовых опилках, обладающих более рыхлой структурой и повышенной концентрацией метоксильных групп лигнина) определялись общая окси-дазная, общая пероксидазная и целлюлаз-ная активность мицелия. Оксидазную и пе-роксидазную активности ферментов определяли в вытяжках из субстратов, на которых происходило культивирование изучаемых штаммов грибов, соответствующим буфером. Общую оксидазную активность определяли спектрофотометрически, при 410 нм с использованием в качестве субстрата 1 %-ного пирокатехина в 0,1 М цит-

0,9

0,8

0,7

ж 0,6

о

О 0,5

Ж

К 0,4

с

в о 0,3

0,2

0,1

0

ратно-фосфатном буфере (рН 4,5) [3]. Общую пероксидазную активность определяя-ли также спектрофотометрически, при 440 нм с использованием в качестве субстрата 1 %-ного раствора гваякола в 0,06 М фосфатном буфере (рН 6,7), с добавлением 0,3 %-ного раствора перекиси водорода [4]. О целлюлазной активности судили косвенно по осахариванию экстрагированных на-тивных и метанолизных опилок, определяя концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом [5]. Для определения использовали набор реагентов для определения глюкозы «Фотоглюкоза» фирмы ООО «Им-пакт». Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре КФК-3 при длине волны 500 нм. Этим методом так же оценивали утилизацию глюкозы в процессе глубинного культивирования [6]. Также о целлюлазной активности судили по убыли холоцеллюлозы (сумма целлюлозы и гемицеллюлозы) в субстратах в конце периода культивирования [7]. Для этого определили содержание холоцеллюлозы в нативных и метанолизных опилках перед посевом изучаемых культур. Количество холоцеллюлозы определяли как разницу между массой экстрагированных опилок (нативных и метанолизных) и содержанием в них лигнина (определённого сернокислотным методом в модификации Комарова). Изучение активности ферментов кси-лотрофных базидиомицетов проводилось при твердофазном культивировании на двух субстратах. В качестве субстратов выступали экстрагированные нативные и метанолизные дубовые опилки, пропитанные солевым раствором Чапека. Определение ферментативной активности проводилось на 13-16 сутки роста мицелия, в момент наступления идиофазы, о котором судили по косвенным визуальным призна-

{

12

S

0,11 0,09

Й

0J9

0,11 0,09

0 П

I

0ГВ1 0«2

Í

J,1 j

H M

HM HM H M HM H M HM HM HM

Ph. tremulae F. pinícola L. sulphureus G. G.lucidum F.fomentarius Pyc. H. annosum

applanatum cinnabarinus

%

Рис. 1. Общая оксидазная активность изученных видов грибов на различных субстратах. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей - ошибка средней, р<0,05)

0,45

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 27

кам (появление капель экссудата, пигментирование).

Изученные виды грибов обнаружили различные уровни оксидазной активности в ходе развития на нативном и метанолиз-ном субстратах (рис. 1).

Как видно на рис. 1, при культивировании на метанолизных опилках, по сравнению с нативными, достоверно снижается общая оксидазная активность у таких видов, как Ph. tremulae, L. sulphureus, H. an-nosum и F. hepatica. Выявленное снижение общей оксидазной активности у названных видов грибов, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата. Такое явление можно объяснить тем, что Ph. tremulae и H. annosum являются облигатными паразитами, а L. sulphureus и F. hepatica, как факультативные паразиты, способны колонизировать живые деревья и нормально существовать в таком состоянии длительное время. Кроме того, эти виды достаточно узко специализированы к породам деревьев [8]. Вероятно, повышенное содержание более доступных фенольных компонентов лигнина в метанолизных опилках, подобно содержанию их в фаутной древесине, ингибирует у них выработку оксидазных ферментов. Это, возможно, и является одной из причин приуроченности этой группы грибов к живым деревьям, древесина которых на начальных этапах колонизации имеет небольшое, по сравнению с фаутной, содержание мономерных фенольных структур [9].

Напротив, такие виды грибов, как F. pinícola, G. applanatum и F. fomentarius демонстрируют более выраженную общую оксидазную активность на метанолизном субстрате, чем на нативном. Эти виды характеризуются более широкой трофической специализацией. Названные виды являются эвритрофными по отношению к по-

родам деревьев [10]. Увеличение оксидазной активности у этих видов грибов на субстрате с более доступными фенольными компонентами лигнина может свидетельствовать о выработке у них индуцибельных форм оксидазных ферментов. Кроме того, вероятно, метанолизный субстрат может содержать фенольные компоненты, являющиеся индукторами биосинтеза ферментов, в частности лакказ [11,12]. Стено-трофные виды, приуроченные к ограниченному числу пород деревьев, показали недостоверные отличия оксидазной активности при росте на нативном и метанолизном субстратах. В отношении перок-сидазной активности отмечено, что при развитии на нативном субстрате она в разной степени выражена у изученных видов (рис. 2). Наибольшие значения характерны для возбудителей белой гнили (Ph. tremulae, G. applanatum) и активной смешанной гнили (F. fomentarius). Возбудители белой гнили I. obliquus и P. cin-nabarinus при развитии на нативных опилках проявили относительно слабые уровни пероксидазной активности, которые оказались близки к значениям, полученным для представителей бурой гнили (F. pinicola, L. sulphureus). При развитии на метанолизном субстрате такие виды, как I. obliquus, G. applanatum и F. fomentarius, продемонстрировали рост пероксидазной активности соответственно в 11,0; 2,3 и 1,6 раза, что, как и в случае с оксидазной активностью, может говорить о наличии индуцибельных форм пероксидазных ферментов, вырабатываемых рассматриваемой группой. Все возбудители бурой гнили, а также некоторые представители белой (G. lucidum, P. cinnabarinus) при культивировании на метанолизных опилках показали полное снижение активности пе-роксидазных ферментов.

ш

H | M I. obliquus

0,47

H M Г=П _ H M H M H M H M H M 1_1 _ H M 1_1 _ H M

Ph. tremulae F. pinicola L. sulphureus G. G.lucidum F.fomentarius Pyc. H. annosum

applanatum cinnabarinus

0

h | M

F. hepatica

Рис. 2. Общая пероксидазная активность изучаемых грибов на различных субстратах. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей - ошибка средней, р<0,05)

8

5

9

0,45

ста

0

0

0

0

15

10

1,7

Л

ñ

916

14,6

10,3

I. obliquus IO- Ph. tremulae 3 Pht-3

H

M

H

M

H

M

F. pinicola L. sulphureus G. Fpi-3 Ah-02 applanatum

G-3

G.lucidum Gl- F.fomentarius 6 Lp-05

H

M

H

M

Pyc. H. annosum cinnabarinus Han-3 PyC-4

F. hepatica Fh-5

виды

25

20

3

6

20

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

3

2

6

5

16

5

9

7

3,6

5

0

Рис. 3. Утилизация из субстрата холоцеллюлозы штаммами изучаемых видов базидиомицетов. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей - ошибка средней, р<0,05)

Наряду с исследованием активности лигнолитических ферментных систем была определена также активность целлюлаз-ных ферментных систем изученных видов. О целлюлазной активности тех или иных видов грибов судили по утилизации целлюлозы в материале опилок и, косвенно, по концентрации глюкозы в вытяжке из субстрата, на котором проходило культивирование [13]. Данные приемы целесообразны, поскольку опилки перед культивированием были подвергнуты водной экстракции до полного вымывания глюкозы и других водорастворимых сахаров. Таким образом, появление глюкозы в вытяжке из субстрата после культивирования свидетельствует о работе целлюлазных ферментов и утилизации полисахаридного комплекса древесины. Данный метод отражает активность комплекса целлюлазных ферментов в совокупности.

Исследование содержания холоцеллю-лозы в субстратах до и после ферментации (на 25 день) обнаружило, что все штаммы изучаемых видов грибов более или менее активно утилизировали этот материал (рис. 3).

Культивирование грибов - представителей деструктивной гнили (H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica) на нативных опилках привело к потере холоцеллюлозы соответственно на 10,3, 13,7, 14,1 и 15,9 %. Представители коррозионной гнили (Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. ap-planatum) при росте на нативных опилках утилизировали соответственно 1,7, 6,9, 5,9, 8,3, 8,1 и 7,8 % целлюлозы. Представители бурой деструктивной гнили активнее разрушают целлюлозу, чем представители бе-

лой коррозионной при росте на нативных опилках.

Рост на метанолизных опилках сопровождался более интенсивным потреблением целлюлозы у таких видов, как Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum и H. annosum. Не установлено достоверных отличий в утилизации целлюлозы у L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica. Максимально за 25 суток культивирования деградировали целлюлозу при росте на метанолизном субстрате F. pinicola и G. lucidum (20,3 и 19,6 % соответственно).

Данные, полученные при изучении процесса утилизации целлюлозы, согласуются с результатами определения концентрации глюкозы в вытяжках из субстратов, что позволяет более объективно судить о целлюлазной активности изучаемых ксилотроф-ных базидиомицетов.

Установлено, что более или менее выраженной целлюлазной активностью при развитии на обоих типах субстратов обладали все изученные виды (рис. 4).

Максимальные концентрации глюкозы, обнаруженные в вытяжках из нативного субстрата, отмечены у видов грибов, вызывающих бурую деструктивную гниль (H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. heap-tica), причем значения варьируют соответственно от 0,86 до 1,23 мМоль/л. Показатели содержания глюкозы в вытяжке из нативного субстрата при культивировании видов - представителей белой гнили (Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum) варьируют в пределах от 0,12 до 0,44 мМоль/л соответственно.

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 29

SE 1,5

042

Ш

0,12

n

0,92

51

0,44

043

rfl

06

fL

ж

H M H M H M H M H M H M H M H M H M

I. Obliquus Ph. Tremulae F. Pinicola L. Sulphureus G. Applanatum G.Lucidum F.Fomentarius Pyc. Cinnabarinus H. Annosum

17

Рис. 4. Содержание глюкозы в вытяжке из различных типов субстрата: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду (из трех штаммов) (планки погрешностей - ошибка средней, р<0,05)

В целом, все виды изученных грибов, кроме hepatica, при культивировании на метанолизном субстрате отличаются более высокой целлюлазной активностью по сравнению с таковой при развитии на на-тивных опилках. Согласно литературным данным, отдельные фенольные компоненты лигнина индуцируют выработку целю-лазных ферментов некоторых грибов [14, 15], что подтверждается полученными нами результатами.

Таким образом, в ходе исследования особенностей ферментативной активности мицелия ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре была установлена ее зависимость от структуры лигноцеллюлозно-го субстрата. Так, метанолизный лигноцел-люлозный субстрат ингибирует оксидазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства сапротрофных видов; он стимулирует пероксидазную активность у некоторых видов - представителей белой гнили; виды - представители бурой гнили на обычном лигноцеллюлоз-ном субстрате в культуре интенсивнее разрушают целлюлозу, чем представители белой; на метанолизном субстрате эта закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обеспечивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов. Указанные факты говорят о целесообразности введения модифицированных посредством метано-лиза лигноцеллюлозных источников углерода в различные питательные среды. Это позволяет ускорить процессы адаптации культур за счет активации работы ряда индуцируемых субстратом ферментов. С прикладных позиций полученные результаты

могут иметь ценность в плане разработки способов подготовки лигноцеллюлозных субстратов для оптимизации процесса биоконверсии дереворазрушающими грибами.

Литература

1. Hatakka, A. Biodégradation of lignin / Hatakka, A. // Lignin, Humic Substances and Coal. Wiley-VCH, Germany. 2001. - P. 129-180.

2. Hartig, R. Die Zersetzungsercheiungen des Holzes der Nadelholbaume und der Eiche in forstlicher botanischer und chemischer Richtund / R. Hartig. - Berlin. 1978. - 211 p.

3. Никитина, О. В. Внеклеточные окси-доредуктазы лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Shumach.) Pilat.: автореф. ... канд. биол. наук / О. В. Никитина. - Москва, 2006. - 26 с.

4. Gramss, G. Activity of oxidative enzymes in fungal mycelia from grassland and forest soils / G. Gramss // J. basic microbiol. -1997. - Vol. 37, № 6. - P. 407-423.

5. Синицын, А. П. Биоконверсия лигно-целлюлозных материалов: учебное пособие / А. П. Синицын, А. В. Гусаков, В. М. Чер-ноглазов. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

6. Лабораторные методы исследований в клинике: справочник / Под ред. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

7. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В. И. Билай. - Киев, 1982. -550 с.

8. Стороженко, В. Г. Научные основы устойчивости лесов к дереворазрушающим грибам / В. Г. Стороженко, М. А. Бондар-цева, В. А. Соловьёв. - М.: Наука, 1992. -221 с.

9. Крутов, В. И. Грибные болезни древесных пород / В. И. Крутов, И. И. Минке-вич. - Петрозаводск, 2002. - 196 с.

2,5

1

1

2

3

48

0J3Z

0,5

0,24

0

10. Стороженко, В. Г. Гнилевые фауты коренных лесов Русской равнины / В. Г. Стороженко. - М.: Изд-во ВНИИЛМ, 2002. -156 с.

11. Решетникова, И. А. Поиск грибов -продуцентов пероксидазы / И. А. Решетникова // Микология и фитопатология. - 1992. - Т. 26, вып. 5. - С. 383-387.

12. Решетникова, И. А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами / И. А. Решетникова. - М., 1997. - 197 с.

13. Лыков, Ю. С. Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и

развитие ксилотрофных базидиомицетов: дис. ... канд. биол. наук / Ю. С. Лыков. - М., 2011. - 149 с.

14. Muller, H. W. Effect of phenolic compounds on cellulose degradation by same white-rot basidiomycetes / H. W. Muller, Trosch, K. D. Kulbe // FEMS Microbiol. Letters. -1988. -V. 49, № 1. - P. 87-93.

15. Kelley, R. L. Identification of glucose oxidase activity as a primary source of hydrogen peroxide production in lignolytic cultures of Phanerochaete Chrysosporium / R. L. Kelley, R. C. Andinarayana // Arch. Microbiol. -1986. - V. 144, № 3. - P. 248-253.

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 31

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.