CC BY
49
раза чаще, чем у подростков [10]. Такую возрастную вариабельность заболеваемости кампилобактериозом можно объяснить, лишь допустив существование какого-то еще механизма распространения инфекции, который дифференцированно воздействует на людей разного возраста. Не исключено, что его реализуют мухи. Маленький ребенок не способен избегать контактов с ними в той же степени, как это делают более взрослые дети.
б. Превалирование спорадических случаев. Если потребление мяса, не прошедшего достаточной термической обработки, служит основным путем заражения КБ, то тогда чаще заболевали бы сразу несколько членов семей. Однако, как показывает опыт шведских врачей [21], обычно регистрируют спорадические случаи болезни (если не принимать во внимание массовых вспышек кампило-бактериоза, которые случаются не так уж часто). Единственное объяснение этого состоит в том, что только в тарелке заболевшего члена семьи оказалось достаточное для заражения количество КБ. Как они попали туда — не при помощи ли мух?
Заключение
Все подтверждения гипотезы о роли мух как вектора КБ носят случайный характер, и им можно дать другое объяснение. Поэтому она нуждается в экспериментальной и эпидемиологической проверках. Одним из лучших способов ее доказательства, наверное, стал бы контролируемый опыт по снижению инцидентности кампилобакте-риоза посредством уничтожению мух, как это было раньше сделано при шигеллезе [5, 11]. Его надо будет провести в месте с высокой инцидентностью болезни и при хорошей лабораторной поддержке. В районе с умеренным климатом такой эксперимент даст менее демонстративные результаты. Также нужно собрать больше информации о носительстве КБ мухами в разных местах. Альтернативным и более инновационным подходом является сопоставление информации об эндемичных по кампилобактериозу районах с данными географической информационной системы (GIS), характеризующими последние.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Allos B.M. Clin Infect Dis, 2001, 32, 1201—1206.
2. Blaser M.J. Campylobacter and related species. In: Mandell G.L., Bennett J.E. (Ed.). Principles and practice of infectious diseases 4th Ed. Dolin, NY, Churchill Livingstone, 1995.
3. Bolton F.J., Coates D., Hutchinson D.N., Godfree A.F. J Appl Bacteriol, 1987, 62, 167—176.
4. Bolton F.J., Surman S.B., Martin K. et al. Epidemiol Infect, 1999, 122, 7—13.
5. Chavasse D.C., Shier R.P., Murphy O.A. et al. Lancet, 1999, 353, 22—25.
6. Cohen D., Green M., Block C. et al. Lancet 1991, 337, 993—997.
7. Coker A.O., Isokpehi R.D., Thomas B.N. et al. Emerg Infect Dis, 2002, 8, 237—244.
8. Crum N.F. Curr Gastroenterol Rep, 2003, 5, 279—286.
9. Eberhart-Phillips J., Walker N., Garrett N. J Epidemiol Com Health, 1997, 51, 686—691.
10. Ekdahl K., Andersson Y. BMC Infect Dis, 2004, 4, 54.
11. Emerson P.M., Lindsay S.W., Walraven G.E. et al. Lancet, 1999, 353, 1401— 1403.
12. Gregory E., Barnhart H., Dreesen D.W. et al. Avian Dis, 1997, 41, 890— 898.
13. Hald B., Skovgerd H., Bang D.D. et al. Emerg Infect Dis, 2004, 10, 1490— 1492.
14. Jones K., Betaib M., Telford D.R. J Appl Bacteriol, 1990, 69, 235—240.
15. Kapperud G., Rosef O. Appl Environ Microbiol, 1983, 45, 375—380.
16. Kapperud G., Skjerve E., Bean N.H. et al. J Clin Microbiol, 1992, 30, 3117— 3121.
17. Khalil K., Lindblom G.B., Mazhar K., Kaijser B. Epidemiol Infect, 1994, 113, 435—444.
18. Levine O.S., Levine M.M. Rev Infect Dis, 1991, 13, 688—696.
19. Luechtefeld N.A.W., Blaser M.J., Reller L.B., Wang W.L.L. J Clin Microbiol, 1980, 12, 406—408.
20. Nichols G.L. Emerg Infect Dis, 2005, 11, 361—364.
21. Normann B. Smittskydd, 2004, 2, 24—25.
22. Nylen G., Dunstan F., Palmer S.R. et al. Epidemiol Infect, 2002, 128, 383—390.
23. Park S.F. Int J Food Microbiol, 2002, 74, 177—188.
24. Patrick M.E., Christiansen L.E., Waino M. et al. Appl Environ Microbiol, 2005, 70, 7474—7480.
25. Rosef O., Kapperud G. Applied Envir Microbiol, 1983, 45, 381—383.
26. Samuel M.C., Vugia D.J., Shallow S. et al. Clin Infect Dis, 2004, 38(Suppl3), 165—174.
27. Schönberg-Norio D., Takkinen J., Hänninen M.L. et al. Emerg Inf Dis, 2004, 10, 1474—1477.
28. Shane S.M., Montrose M.S., Harrington K.S. Avian Dis, 1985, 29, 384—391.
29. Stanley K., Jones K. J Appl Microbiol, 2003, 94, 104—113.
30. Studahl A., Andersson Y. Epidemiol Infect, 2000, 125, 269—275.
31. Ullman U., Kischkel S. Infection, 1981, 9, 210.
32. Wallis M.R. Br J Biomed Sci, 1994, 51, 57—64.
33. West L.S. The housefly. Its natural history, medical importance and control. NY, Comstock Publ, 1951.
34. Wright E.P. J Hyg (Lond), 1983, 91, 223—226.
35. Swedish Inst Inf Dis Control: Updated statistics covering the notifiable diseases in Sweden. [http://www.smittskyddsinstitutet.se/mapapp/build/intro.html].
K. Ekdahl, B. Normann, Y. Andersson. Could flies explain the elusive epidemiology of campylobacteriosis? BMC Inf Dis, 2005, 5, 11, doi: 10.1186/1471-2334-5-11. OA.
УДК 619:616.98:579.843.1-078
Фенотипирование кампило-бактерий C. jejuni и C. coli посредством количественного анализа антиоиотико-грамм по эвклидовым расстояниям
Дж^. Мур, R.E. Голдсмит, Northern Ireland Public Health Laboratory
(г. Белфаст, Великобритания)
Сокращения: КБ — кампилобактерия(и); с/х — сельскохозяйственный
Введение
Без понимания источников и путей передачи КБ трудно обеспечить профилактику гастроэнтеритов, вызываемых этими микроорганизмами у человека [2]. В последнее время отмечается рост устойчивости КБ к ряду АП, в т.ч. к фторхино-лонам [5]. Это сделало еще более актуальной задачу создания воспроизводимой, чувствительной и стандартизированной схемы типирования КБ, позволяющую идентифицировать штаммы с повышенной резистентностью к антибиотикам. Такая схема была бы весьма полезной при лечении пациентов, проведении эпидемиологического/эпизоотологического
мониторинга и прогнозировании дальнейшей эволюции резистентности КБ. Существующие молекулярно-генетические схемы типирования КБ, к сожалению, пока не доступны для обычных диагностических лабораторий. В связи с этим мы предприняли попытку разработать простой способ феноти-пирования C. jejuni и C. coli, основанный на сравнении МИК ряда АП, применяемых для лечения людей и животных, а также добавляемых в корм последних.
Материалы и методы
Изоляция КБ. Campylobacter spp. изолировали из печени 400 свиней, доставленных на бойню с 37 ферм Северной Ирландии. Пробы брали из глубины органа сразу же после убоя животных и помещали на селективную агаровую среду. Изо-
лировать КБ удалось в 6 % случаев: 67 % изолятов признали C. coli, 30 % — C. jejuni и 3 % — C. lari.
Подготовка изолятов КБ. Для проведения работы использовали 30 изолятов, в т.ч. 10 изолятов C. jejuni и 20 изолятов C. coli. Каждый из них прошел 2 пассажа на неселективной основной среде без антибиотиков, т.е. на агаре № 2 (Oxoid Ltd., Великобритания), обогащенном дефибринированной кровью лошади (Oxoid Ltd.).
Определение чувствительности изолятов к АП. МИК
использованных АП по отношению к изолятам КБ проводили посредством включения этих АП в агар. На агаре № 2 с дефибринированной кровью лошади выращивали культуры в течение 18 ч при 37 °C в микроаэрофильных условиях (5 % O2 + 10 % CO2 + 85 % N2). Бактериальные клетки каждого изолята, собранные из двух чашек Петри, ресуспендировали в 0,1%-м (масса/объем) пептоновом растворе, приготовленном на физиологическом растворе. Бактерии переносили на поверхность агара Мюллера-Хинтона с помощью многоточечного инокулятора (Denley Instruments, Великобритания). При этом пользовались 3-иголь-ной насадкой для избежания перекрестной контаминации разными изолятами. Каждой иглой вносили на поверхность агаровой среды приблизительно по lg 6,7 колониеобразую-щих единиц КБ.
Для определения чувствительности изолятов к АП пользовались агаровой средой Мюллера-Хинтона как наиболее богатой питательными веществами средой из числа применяемых для выращивания КБ [1, 7]; только в случае котриметаксозола к ней добавляли 5 % дефибринированной крови овцы. Чашки со средой инкубировали в темноте 24 ч при температуре 30 °C для подсушивания поверхности агара, что повышало его абсорбционные свойства и предотвращало слияние посевов разных изолятов КБ. С той же целью повышали концентрацию среды до 2 % за счет добавления агара № 1 (Oxoid).
14 серийных разведений (0...500 мкг/мл) АП готовили непосредственно перед их внесением в агар Мюллера-Хинтона. Чашки Петри без АП служили контролем. После инокуляции АП чашки инкубировали при 37 °C в течение 24 ч, а затем учитывали результаты. Критерием резистентности к АП считали наличие сплошного или почти сплошного роста изолята на поверхности среды. МИК определяли как наименьшую концентрацию АП, которая полностью ингибировала рост изолятов КБ в течение 24 ч.
Тестированные АП. В работе использовали следующие АП:
а) применяемые в медицине: цефалоспорин C, ципрофлок-сацин гидрохлорид, котриметоксазол (комбинацию сульфа-метоксазола и триметоприма 20 : 1), эритромицин и гента-мицин;
б) применяемые в ветеринарии: диметридазол, монензин натрия, сульфадимидин, сульфаметоксазол, тетрациклин;
в). Добавляемые в корма: низин.
Результаты
Выделенные от свиней изоляты C. jejuni и C. coli продемонстрировали вариабельность резистентности к протестированным АП. В целом изоляты C. coli оказались значительно более устойчивыми к АП по сравнению с изолятами C. jejuni. Кроме того, их резистентность к ветеринарным АП была выше, чем к медицинским препаратам. Все 30 изолятов признали чувствительными к протестированным АП, за исключением монен-зина натрия, который даже в максимальной использованной концентрации (500 мкг/мл) не ингибировал рост ни одного изолята C. jejuni и C. coli. О проявлении КБ специфической резистентности к АП сообщалось ранее [4]. Была установлена стабильность такой резистентности в процессе субкультивирования изолятов КБ. При проведении эксперимента мы регистрировали резистентность изолятов в баллах — от 1 до 14 в соответствии с тем, какое максимальное разведение АП
ингибировало их рост: 1 балл соответствовал отсутствию инги-биции роста, а 14 баллов — МИК > 500 мкг/мл. Такую оценку резистентности каждого изолята провели в отношении 11 АП и построили для каждого изолята свою антибиотикограмму. Статистический анализ антибиотикограмм показал отсутствие среди них идентичных как для C. jejuni, так и для C. coli, что свидетельствовало о значительной вариабельности чувствительности исследованных изолятов КБ к АП. Расчет эвклидовых расстояний между значениями резистентности к 11 АП сгруппированных пар изолятов проводили по формуле: [l-(x-xi)] : Амплитуда колебаний. На основании полученных данных с помощью компьютерной программы Genstat 5 (версии 2.2) и компьютерной системы VAX/VMS5 [3] построили дендро-грамму (рисунок), отражающую фенотипическое родство 30 исследованных изолятов КБ.
Дендрограмма родства 10 изолятов C. jejuni и 20 изолятов C. соП, построенная на основании количественного анализа их антибиотикограмм по эвклидовым расстояниям
Обсуждение
C. jejuni и C. coli — одни из наиболее опасных возбудителей заболеваний пищеварительного тракта людей — в развивающихся странах они вызывают острый гастроэнтерит чаще других бактерий [2]. В большинстве (99 %) случаев кампило-бактериоз протекает спорадически. Отсутствие простых и недорогостоящих схем типирования КБ служит причиной того, что обычно диагностические лаборатории ограничиваются идентификацией возбудителя на родовом уровне.
В настоящее время типирование изолятов этих бактерий на субвидовом уровне чаще всего проводят по фенотипиче-ским признакам, в т.ч. морфологии колоний и качественном анализе их чувствительности к ограниченному числу АП, про-
Сравнение разных методов типирования КБ
Параметры Количественный анализ антибиотикограмм по эвклидовым расстояниям Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции Серотипирование
Время,затрачиваемое на получение результата, ч 24 9 2
Относительная стоимость Умеренная Высокая Высокая
Простота Простой Сложный Умеренно простое
Воспроизводимость Хорошая Хорошая Хорошая
Необходимость в сложном оборудовании Умеренная Высокая Умеренная
Пригодность для рутинной диагностики Пригоден Непригоден Непригодно*
'Непригодно из-за трудности получения качественной антисыворотки
водимом дисково-диффузионным методом. По стоимости и возможностям такая схема типирования КБ сопоставима с мо-лекулярно-генетическим типированием посредством анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции гена flaA (анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции, таблица).
Хотя апробированный нами способ типирования КБ в ходе проведенного эксперимента давал воспроизводимые результаты, важно разработать систему контроля его показаний и стандартизировать методику проведения, включая питательные среды, набор референтных и контрольных штаммов КБ с известной чувствительностью к АП и т.д.
Фенотипирование КБ посредством количественного анализа антибиотикограмм обладает рядом преимуществ, которые позволяют получать с его помощью первичную внутривидовую характеристику изолятов КБ, что упрощает диагностику вспышек кампилобактериоза первичными диагностическими лабораториями. Специалисты лабораторий имеют большой опыт определения чувствительности изолятов бактерий к антибиотикам, а метод позволяет типировать все изоляты КБ, что значительно облегчит его освоение и применение. Количественный анализ антибиотикограмм позволит осуществлять мониторинг изменения чувствительности КБ к применяемым в животноводстве АП. Это особенно важно для C. jejuni, рост резистентности которого к антибиотикам в последнее время значительно ускорился.
Заключение
Фенотипирование C. jejuni и C. coli посредством количественного анализа антибиотикограмм — простой, недорогой и надежный метод типирования изолятов этих бактерий на внутривидовом уровне. Он будет полезен первичным диагностическим лабораториям, в которых нет возможностей для применения более сложных фенотипических и молекулярно-генетических способов типирования КБ. Его применение позволит быстро диагностировать кампилобактериоз и проводить мониторинг чувствительности КБ к АП.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Butzler J.P., Dekeyser P., Lafontaine T. Antimicrob Agents and Chemother, 1974, 5, 86—89.
2. Engberg J., Aarestrup P.M., Taylor D.E. et al. Emerg Inf Dis, 2001, 7, 24—34.
3. Lawes Agricultural Trust: Genstat V. Release 1.3. Rothamsted Exp. Station, England. 1990.
4. Moore J.E., Madden R.H., Kerr J.R. et al. Vet Rec, 1996, 138, 306—307
5. Moore J.E., Crowe M., Heaney N., Crothers E. J Antimicro Chemother, 2001.
6. Skirrow M.B., Benjamin J. J Clin Pathol, 1980, 33, 1122.
7. US National Committee for Clinical Laboratory Standards Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Second information supplement. NCCLS document M100-S2. Villanova, Pennsylvania, U.S.A., 1987.
J. Emoore, C.E. Goldsmith. Phenotyping of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by a quantitative antibiogram [MIC] typing scheme using Euclidean distances. BMC Microbiology 1:13. OA.
НАША СПРАВКА
УДК 619:616.98:578.842.1
Диагностика кампилобактериозов
Б.Ф.Шуляк, РВЖ СХЖ
Сокращения: КБ — кампилобактерии
В 1886 г Т. Эшерих обнаружил в фекалиях ребенка некультивируемую спиральную бактерию, которую назвал Vibrio felinus. В 1963 г. этот микроорганизм и ряд других морфологически сходных с ним бактерий пищеварительного тракта животных и человека объединили в отдельный род Campylobacter. В настоящее время последний входит в состав рода Campylobacter класса e-Proteobacteria. Число видов этого рода постоянно растет: в настоящее время валидными признают по меньшей мере 22 вида кампилобак-терий (КБ): C. canadensis, C. coli, C. concisus, C. cuniculor-um, C. curvus , C. faecalis, C. fetus (подвиды fetus и venerea-lis), C. gracilis, C. helveticus, C. hominis, C. hyointestinalis (C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis, C. hyointestinalis subsp. lawsonii), C. insulaenigrae, C. jejuni (подвиды. doylei
и jejuni), C. lanienae, C. lari(dis), C. lawrenceae, C. mucosa-lis, C. peloridis, C. rectus, C. showae, C. sputorum (подвиды bubulus и sputorum) и C. upsaliensis. Наиболее изучены 3 вида КБ, наиболее опасные для человека, — С. upsaliensis, С. jejuni и C. coli.
У с/х животных кампилобактериозы обычно протекают бессимптомно. Поэтому основу их диагностики составляют лабораторные методы обнаружения КБ. Серологическими методами диагностики кампилобактериозов в ветеринарии не пользуются.
КБ проявляют высокую чувствительность к сопутствующей кишечной микрофлоре и ее кислым продуктам метаболизма, а также обычным атмосферным условиям. Поэтому пробы фекалий должны доставляться в лабораторию в охлажденном виде (4...6 °С) в течение срока, не превышающего 1 ч после совершения животным акта дефе-
