CC BY
22
Результаты исследований
DOI: 10.24412/2071-5315-2021-12334
Фенотипирование ангиотензин-1-превращающего фермента у пациентов с системными проявлениями саркоидоза
Л.Я. Французевич1, 2, А.П. Бобков3, М. Джайн4, О.В. Курилова4, В.И. Шоломова5, М.Ю. Бровко6, А.С. Белевский2, Е.П. Павликова1, 3, Л.М. Самоходская4, 7 8, Т.Н. Краснова
1, 3, 5
1 Отдел внутренних болезней Медицинского научно-образовательного центра ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова " 2 Кафедра пульмонологии ФДПО ФГАОУ ВО "Российский национальный исследовательский
медицинский университет им. Н.И. Пирогова" МЗ РФ, Москва 3 Кафедра внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова" 4 Отдел лабораторной диагностики Медицинского научно-образовательного центра ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова" 5 Кафедра внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет) 6 Клиника ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы № 3 ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет)
7 Евразийский центр по продовольственной безопасности (Аграрный центр МГУ), Москва
8 Лаборатория генных и клеточных технологий Факультета фундаментальной медицины
ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова"
Многообразие клинических проявлений саркоидоза свидетельствует о системном характере заболевания, что существенно осложняет диагностику. С помощью метода определения изменений третичной структуры ангиотензин-1-превращающего фермента (АПФ) (фенотипирование АПФ) была продемонстрирована органо- и тканеспецифичность конформации фермента. Фенотипирование АПФ проведено с использованием цитратной плазмы 85 больных саркоидозом. Метод включал одновременное определение активности АПФ по 2 субстратам, расчет соотношения АПФ-активностей для гидролиза по этим субстратам, определение уровней иммунореактивного белка АПФ и конформации АПФ с помощью набора моноклональ-ных антител к ферменту с последующей статистической обработкой данных. Обнаружены отличия у больных саркоидозом с высокой активностью заболевания по параметрам фенотипи-рования Ш12 и 1G12/9B9 (р < 0,05), а также отмечено изменение показателей i1A8 и i1A8/9B9 при поражении саркоидозом селезенки (р < 0,05). Выявлено значимое влияние на параметры фенотипирования не только ингибиторов АПФ, но и системных глюкокортикостероидов. Метод фенотипирования представляется перспективным скрининговым методом диагностики активного течения саркоидоза. Однако возможности метода в оценке распространенности заболевания, в том числе органоспецифичности, недостаточно аргументированы.
Ключевые слова: саркоидоз, системные проявления саркоидоза, скрининг, ангиотензин-1-превращающий фермент, конформационные изменения.
Контактная информация: Французевич Лайне Яновна, frantsuzevitch@mail.ru
Фенотнпнпованне АПФ при саркондозе
Введение
Значимость саркоидоза в настоящее время определяется повышением его частоты, обусловленным в том числе проблемами возрастающей урбанизации населения, тяжелым прогрессирующим течением в 1 из 10 случаев [1]. В наибольшей степени известны легочные манифестации саркоидо-за, между тем многообразие его клинических проявлений свидетельствует о системном характере заболевания, что связано с его патогенезом, с широким кругом как проявлений гранулематозного воспаления, так и неспецифических (метаболических, аутоиммунных) синдромов [2]. Данное обстоятельство является причиной диагностических проблем в практике врачей разных специальностей [3—7]. Современные подходы иммуносупрессивной терапии саркоидоза опираются на оценку распространенности и активности процесса. Диагностическая значимость определения в качестве критерия активности ангиотензин-1-превращающего фермента (АПФ) остается одной из наиболее дискутируемых [8].
Активность в плазме/сыворотке АПФ (CD143) повышена у большинства больных саркоидозом, что может быть связано с выраженностью гранулематозного воспаления [9—12]. Однако, по данным многочисленных исследований, активность сывороточного АПФ не всегда и не в полной мере коррелирует с активностью заболевания и не отражает концентрацию АПФ непосредственно в гранулемах [10, 13—15].
Ангиотензин-1-превращающий фермент — цинкзависимая карбоксидипепти-даза, участвует в регуляции артериального давления и ремоделировании стенки сосудов. Фермент имеет базовый уровень экспрессии на поверхности эндотелия, ней-ронального эпителия, эпителия нефрона с абсорбирующей функцией и иммунных клетках (антигенпрезентирующие клетки, макрофаги). Источником большинства молекул АПФ в крови являются эндотелио-циты легочных капилляров, с поверхности которых в процессе шеддинга (еще не
идентифицированной секретазой АПФ) в плазму поступает растворимая форма этого белка [16, 17].
Разработанный уникальный набор мо-ноклональных антител (мАТ) более чем к 40 эпитопам N- и C-доменов человеческого АПФ из ткани легкого лежит в основе современного метода исследования АПФ — конформационного фингерпринтинга, базирующегося на идентификации критических функциональных областей третичной структуры фермента [18, 19]. Особенности локальной конформации АПФ, продемонстрированные в ходе выполнения конфор-мационного фингерпринтинга и связанные с гликозилированием различных локусов третичной структуры АПФ в органах и тканях, оказались органо- и тканеспецифиче-скими [18, 20-22].
Целью исследования являлась оценка диагностических возможностей метода фе-нотипирования АПФ в плазме/сыворотке у пациентов с различными вариантами течения саркоидоза, в том числе с системными проявлениями.
Материал и методы
В исследование было включено 85 пациентов с саркоидозом, наблюдавшихся в Клинике ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы № 3 ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ в 2015-2019 годах (директор клиники - профессор, докт. мед. наук С.В. Моисеев).
Диагноз устанавливался согласно критериям клинических рекомендаций по сар-коидозу Министерства здравоохранения РФ, выпущенных в 2013, 2016 и 2019 годах. Пациентам было проведено клинико-ин-струментальное обследование, включавшее сбор анамнеза, объективные осмотр и физическое обследование, определение функции внешнего дыхания или диффузионной способности легких по оксиду угле-Лечебное дело Z.Z0Z1
Результаты исследований
Таблица 1. Системные проявления саркоидоза (количество больных, абс.)
Активное течение Неактивное течение
Орган общая без ИАПФ (п = 46) (п = 38) без ИАПФ и/или СГКС (п = 28) общая (п = 39) без ИАПФ (п = 35) без ИАПФ и/или СГКС (п = 29)
Нераспространенный 17 16 13 24 21 18
вариант саркоидоза (легкие и/или
внутригрудные ЛУ)
Наличие внелегочных 29 22 15 15 14 11
очагов
кожа 13 10 8 7 7 6
селезенка 10 7 6 4 4 3
сердце 6 4 1 2 2 2
почки 7 5 3 1 1 1
глаза 4 3 2 3 2 2
печень 5 2 2 1 1 1
ЦНС 4 1 0 2 2 0
суставы 2 2 1 2 2 1
мышцы 3 1 0 0 0 0
Примечание. При оценке внелегочных очагов саркоидоза учитывалось наличие гранулемы (по данным биопсии или
инструментальных методов) в конкретном органе, при этом у пациентов очаги могли присутствовать в нескольких органах. Обозначения: ЦНС - центральная нервная система.
рода, а также мультиспиральную компьютерную томографию (МСКТ) органов грудной клетки (ОГК). У всех больных исключался туберкулез на основании данных диаскин-теста или Т-спот теста (Т^РОТ.ТВ).
Активность заболевания определяли по наличию клинических или лабораторно-инструментальных проявлений грануле-матозного воспаления. В первую очередь оценивали динамику распространенности интерстициальных изменений по данным МСКТ ОГК, а также у всех пациентов рутинно измеряли уровень АПФ в крови по субстрату ^[3-(2-фурил)акрилоил]^-фе-нилаланил^-глицил^-глицин (FAPGG). Если наблюдалась отрицательная динамика с возрастанием специфических зон поражения легких, отмечалось увеличение в размерах и повышение числа вовлеченных в воспалительный процесс лимфатических узлов (ЛУ) по данным МСКТ, то фазу тече-
ния саркоидоза у пациента оценивали как активную.
В табл. 1 представлено распределение пациентов по вариантам системного (ор-ганоспецифического) поражения при сар-коидозе в 3 когортах:
— общей (п = 85);
— без учета пациентов, принимающих ингибиторы АПФ (ИАПФ) (п = 73);
— без учета пациентов, принимающих ИАПФ и/или системные глюкокортикосте-роиды (СГКС) (п = 57).
Перечисленные выше когорты пациентов (п = 85, п = 73, п = 57) были разделены на группы с активным и неактивным течением заболевания. У 59 пациентов (69,4%) была проведена морфологическая верификация диагноза: биопсия кожи, ткани легкого, ЛУ и т.п.
Помимо общепринятых лабораторных тестов проводилось фенотипирование АПФ крови, включавшее анализ активно-
Фенотнпнпованне АПФ при саркондозе
сти АПФ по 2 субстратам и конформацион-ный фингерпринтинг АПФ: измерение по
1 субстрату активности АПФ, преципити-рованного на различных мАТ.
При фенотипировании использовались следующие субстраты: бензилоксикарбонил-L-фенилаланил-L-гистидил-L-лейцин (Z-Phe-His-Leu, ZPHL) и гиппурил-L-гистидил^-лейцин (Hip-His-Leu, HHL). Антитела к человеческому АПФ из ткани легких, использованные в проведенном исследовании, — это набор мышиных мАТ к человеческому АПФ, распознающих на-тивную конформацию N- и C-доменов человеческого АПФ из эндотелиоцитов легких [18]. У всех пациентов был выполнен фингерпринтинг АПФ с использованием
2 мАТ — 9В9 и 1G12, у части больных использовался набор из 6 мАТ — 9B9, 3A5, i1A8, 1G12, 6A12 и 1E10 к разным участкам третичной структуры фермента.
Анализ активности АЛФ. Активность АПФ в препаратах сыворотки или цитрат-ной плазмы измеряли с помощью флуо-риметрического анализа с 2 субстратами АПФ — раствором 2 ммоль/л ZPHL или раствором 5 ммоль/л HHL [23]. Активность АПФ выражалась в МЕ/л и единицах люминесценции (ед. люм.). Отношение ZPHL/HHL рассчитывалось путем деления флуоресценции образца c субстратом ZPHL на флуоресценцию образца c субстратом HHL и выражалось в относительных единицах (отн. ед.) [24].
Иммунологическая характеристика АЛФ крови с помощью мАТ (фингерпринтинг АЛФ). Уровень иммунореактивного белка АПФ с использованием мАТ 9B9 определяли количественно, как описано ранее [25]. Конформационный фингерпринтинг АПФ крови с остальными мАТ (3A5, i1A8, 1G12, 6A12, 1E10) к АПФ был выполнен и представлен согласно методам, описанным ранее S.M. Danilov et al. (2010) и S.M. Danilov et al. (2018) [18, 22].
Статистические методы. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 23
Statistics software (IBM, США). Для проверки нормальности распределения применяли критерий Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса. В изучаемых группах для подавляющего большинства параметров отсутствовало нормальное распределение (p < 0,05), поэтому для них использовали непараметрический критерий сравнения — U-критерий Манна—Уитни (U-тест). Пороговые значения для параметров фенотипирования АПФ со значимыми различиями в группах были установлены по анализу рабочей характеристики приемника (receiver operating characteristic, ROC-анализ) с оценкой площади под кривой (area under curve, AUC), чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной прогностических значимо-стей (positive and negative predictive values, PPV, NPV) порогового значения. Для сравнения частот нескалированных показателей использовался критерий %2 Пирсона. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05 во всех статистических методах.
Результаты и обсуждение
Как указано выше, исследуемая когорта была разделена на 2 группы: с признаками активности заболевания (n = 46) и без признаков активности (n = 39).
В табл. 2 представлена общая характеристика 2 групп с указанием значимости различий по соответствующим параметрам.
Группы не различались по половозрастному составу, однако в обеих группах преобладали женщины (2 к 1). Медиана возраста составила 48 лет в группе с активным течением саркоидоза, 50 лет — в группе с неактивным течением. Рост, масса тела и индекс массы тела (ИМТ) не различались в 2 группах: у пациентов с активным течением саркоидоза медианные значения этих показателей составили 167 см, 78 кг и 27,7 кг/м2 соответственно, у пациентов с неактивным течением — 164 см, 74,5 кг и 25,69 кг/м2 соответственно. Частота
Результаты исследований
Таблица 2. Клиническая характеристика больных с активным и неактивным течением болезни
Параметр Активное течение (п = 46) Неактивное течение (п = 39) P
Мужчины/женщины, абс. (%) 16/30(34,8/65,2) 12/27 (30,8/69,2) >0,05*
Возраст, годы (Ме Q3]) 48,00 [38,00; 60,25] 50,00 [37,00; 62,00] >0,05**
Рост, см (Ме Q3]) 167,00 [160,75; 178,00] 164,00 [158,00; 176,00] >0,05**
Масса тела, кг (Ме Q3]) 78,00 [68,75; 90,75] 74,50 [63,00; 82,50] >0,05**
Индекс массы тела, кг/м2 (Ме [Q1; Q3]) 27,70 [23,50; 32,40] 25,69 [23,44; 30,25] >0,05**
Сахарный диабет, отн. % 8,7 17,9 >0,05*
Артериальная гипертония, отн. % 47,8 38,5 >0,05*
Легочная гипертензия, отн. % 6,5 2,6 >0,05*
Наличие внелегочных очагов 63,0 38,5 0,024*
поражения саркоидозом, отн. %
Прием ИАПФ, отн. % 17,4 10,3 >0,05*
Прием СГКС, отн. % 25,6 6,1 0,025*
Примечание. Здесь и в табл. 3-5: * - на основании %2-критерия; ** - на основании и-теста. Обозначения здесь и в табл. 4: отн.% - процент пациентов с указанным признаком в группе. Здесь и Ме [01; 03] - медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль]. в табл. 3-5:
Таблица 3. Результаты фенотипирования АПФ у пациентов с активным и неактивным течением саркоидоза (Ме Q3])
Показатель Активное течение (п = 46) Неактивное течение (п = 39) p**
FAPGG, МЕ/л 91,50 [46,50; 121,25] 63,00 [47,25; 88,63] >0,050
ZPHL, МЕ/л 4,99 [3,10; 8,00] 3,31 [2,77; 4,41] 0,025
Нт, МЕ/л 3,06 [2,12; 5,78] 2,51 [2,03; 3,42] >0,050
ZPHL, ед. люм. 2949 [1878; 3684] 2348 [1989; 2776] >0,050
Н^, ед. люм. 1931 [1289; 2664] 1760 [1447; 2092] >0,050
9В9, ед. люм. 6658 [5295; 8027] 5669 [5050; 6625] 0,043
3А5, ед. люм. 3160[2358; 5448] 4032 [2401; 6697] >0,050
ПА8, ед. люм. 564 [342; 674] 478 [220; 968] >0,050
Ш12, ед. люм. 1810 [1236; 2877] 1365 [952; 1790] 0,005
6А12, ед. люм. 569 [275; 1044] 527 [308; 4252] >0,050
1Е10, ед. люм. 1057 [627; 1310] 952 [407; 2184] >0,050
ZPHL/HHL, отн. ед. 1,38 [1,26; 1,55] 1,38 [1,29; 1,43] >0,050
9В9/гРН^ отн. ед. 6,20 [5,40; 7,12] 6,00 [5,41; 6,46] >0,050
9В9/НН^ отн. ед. 8,39 [7,02; 10,71] 8,25 [7,42; 8,99] >0,050
3А5/9В9, отн. ед. 0,64 [0,60; 0,71] 0,65 [0,60; 0,71] >0,050
ПА8/9В9, отн. ед. 0,067 [0,040; 0,080] 0,056 [0,026; 0,114] >0,050
Ш12/9В9, отн. ед. 0,27 [0,22; 0,43] 0,23 [0,21; 0,25] 0,012
6А12/9В9, отн. ед. 0,067 [0,032; 0,123] 0,062 [0,036; 0,502] >0,050
1Е10/9В9, отн. ед. 0,125 [0,074; 0,155] 0,112 [0,048; 0,258] >0,050
Фенотнпнпованне АПФ при саркондозе
встречаемости сахарного диабета (СД), артериальной гипертонии (АГ) и легочной ги-пертензии (ЛГ) статистически значимо не различалась у лиц с разными вариантами течениями заболевания, составив в группе с активным течением 8,7; 47,8 и 6,5% соответственно, а в группе с неактивным течением — 17,9; 38,5 и 2,6% соответственно. Частота приема ИАПФ в группах также не различалась — 17,4% у пациентов с активным течением саркоидоза и 10,3% у пациентов с неактивным течением. Таким образом, группы оказались сопоставимыми, за исключением 2 параметров: наличия вне-легочных проявлений и приема СГКС (63 против 38,5% и 25,6 против 6,1% для групп с активным и неактивным течением соответственно). Клинико-анамнестические параметры, различающиеся у пациентов 2 групп, при проверке с помощью и-теста не продемонстрировали какого-либо значимого влияния на показатели фенотипи-рования АПФ (р > 0,05). То есть дальнейшее сравнение результатов фенотипирования фермента является корректным. В табл. 3 представлены результаты статистического анализа по параметрам фенотипирования АПФ в 2 группах.
При анализе результатов фенотипирова-ния было выявлено различие по показателям ZPHL в МЕ/л, 9В9 в ед. люм., Ю12 в ед. люм. и Ю12/9В9 в отн. ед. с большими значениями в группе с активным течением болезни по сравнению с группой с неактивным течением. При этом активность АПФ, определенная рутинным способом (FAPGG), не различалась в обеих группах.
Исходя из полученных данных, на следующем этапе анализа были выявлены клинические параметры, коррелирующие с результатами фенотипирования АПФ:
• возраст (значимая корреляция Спирмена с FAPGG, Ю12/9В9);
• ИМТ (FAPGG);
• наличие АГ (значимое отличие в и-тесте для FAPGG, Ю12, Ю12/9В9);
и-тест Прием ИАПФ
р = 0,067,''
и-тест р = 0,004
р = 0,002
Рис. 1. Взаимосвязи между клинико-анамне-стическими параметрами, влияющими на результаты фенотипирования АПФ, у пациентов с саркоидозом (п = 85). Сплошные стрелки указывают на статистически значимую связь между двумя клинико-анамнестическими параметрами (р < 0,05), пунктирные — на связь между двумя показателями выше порога статистической значимости. г8 — коэффициент ранговой корреляции Спирмена.
• прием ИАПФ (FAPGG, ZPHL/HHL, 9В9/НН^ Ю12, Ю12/9В9, 6А12, 6А12/9В9).
Графическое отображение взаимосвязей указанных параметров представлено на рис. 1.
Поскольку прием ИАПФ изменяет наибольшее количество показателей фено-типирования АПФ, перекрывая влияние таких параметров, как наличие АГ, повышенный ИМТ и старший возраст, то из дальнейшего анализа были исключены пациенты, принимающие ИАПФ (п = 12).
Результаты первого этапа анализа свидетельствуют о том, что фенотипирование АПФ позволяет лучше, чем рутинным методом, определять активность заболевания, даже в группах, из которых пациенты, при-нимаюшие ИАПФ, не были исключены.
После исключения из анализа всех участников исследования, принимающих ИАПФ, в группу с неактивным течением саркоидоза вошло 35 человек, в группу с активным течением — 38 человек (табл. 4).
Результаты исследований
(а)
а 6500 -
2 5500 —
ч
Э 4500 -
¡э 3500 _
и
о ж 2500 -
х
К 1500 -
500
(б)
Обострение (л = 38)
Ремиссия (п = 35)
5
0,74
0,59
£ 0,44
0,29
0,14
С
Пороговое значение 0,255 отн. ед.
Обострение (п = 38)
Ремиссия (п = 35)
Рис. 2. Показатели активности АПФ, преципитированного на мАТ Ш12 (а), и соотношения активности АПФ по Ш12/9В9 (б) у пациентов с активным и неактивным течением болезни, не принимавших ИАПФ. Прямоугольники означают 1-й и 3-й квартили, отрезки — интервалы от минимального до максимального значения.
Группы оказались однородными по показателям, за исключением частоты приема СГКС, которые являются первой линией терапии саркоидоза в активной фазе [26]. В табл. 5 приведены параметры фенотипи-рования, различавшиеся в группах (Ю12,
Ю12/9В9).
Результаты ROC-анализа, представляющие собой модель классификации пациентов с саркоидозом по параметрам Ю12 или Ю12/9В9 в группу активного течения заболевания, приведены в табл. 6. Графическое отображение результатов представлено на рис. 2.
Таблица 4. Клиническая характеристика пациентов с активным и неактивным течением болезни, не принимающих ИАПФ
Параметр Активное течение (п = 38) Неактивное течение (п = 35) P
Мужчины/женщины, абс. (%) 13/25 (34,2/65,8) 11/24 (31,4/68,6) >0,05*
Возраст, годы (Ме Q3]) 46,00 [37,00; 60,25] 44,00 [35,00; 62,00] >0,05**
Рост, см (Ме Q3]) 166,50 [159,75; 178,00] 166,00 [158,00; 176,00] >0,05**
Масса тела, кг (Ме Q3]) 78,00 [61,75; 86,00] 71,50 [62,75; 82,50] >0,05**
ИМТ, кг/м2 (Ме Q3]) 27,27 [22,77; 32,42] 25,54 [23,39; 29,98] >0,05**
СД, отн. % 7,9 11,4 >0,05*
АГ, отн. % 36,8 31,4 >0,05*
ЛГ, отн. % 7,9 2,9 >0,05*
Наличие внелегочных очагов 57,9 40,0 >0,05*
поражения саркоидозом, отн. %
Прием СГКС, отн. % 24,3 3,3 0,016*
Таблица 5. Показатели Ш12 и Ш12/9В9 у пациентов с активным и неактивным течением болезни, не принимающих ИАПФ (п = 73) (Ме Q3])
Показатель Активное течение (п = 38) Неактивное течение (п = 35) p**
1012, ед. люм. 1664 [1211; 2199] 1281 [946; 1735] 0,011
Ш12/9В9, отн. ед. 0,260 [0,216; 0,307] 0,226 [0,199; 0,248] 0,010
Фенотнпнпованне АПФ при саркондозе
Таблица 6. Результаты ROC-анализа для показателей фенотипирования АПФ (1G12, 1G12/9B9) у пациентов с саркоидозом, не принимающих ИАПФ (n = 73)
Показатель Чувствительность Специфичность РРУ NPV Общая точность АиС Порог*
1G12, ед. люм. 0,37 0,94 0,88 0,58 0,64 0,673 >1906
Ш12/9В9, отн. ед. 0,53 0,86 0,80 0,63 0,68 0,676 >0,255
* Пороговое значение, при превышении которого пациенты в данной модели классифицировались как имеющие активное течение заболевания.
Общая точность ROC-анализа указывает на то, что лучшими характеристиками в диагностике активного течения саркоидоза обладает показатель 1G12/9B9. Но качество такой модели (на основании этого показателя) невысокое, так как AUC находится в промежутке между 0,6 и 0,7, что соответствует слабому качеству модели сравнения ("poor" по классификации [27]).
При оценке влияния других клинико-анамнестических параметров, приведенных в табл. 4, на показатели фенотипирования АПФ у пациентов, не принимающих ИАПФ, по результатам U-теста не было выявлено каких-либо статистических различий в зависимости от пола, анамнеза СД, АГ, ЛГ, наличия внелегочных очагов поражения саркоидозом, а при оценке корреляции Спирмена не получено данных о линейной связи роста, массы тела, ИМТ и возраста с показателями фенотипирова-ния. Однако обнаружено, что у пациентов, принимающих СГКС, был статистически достоверно снижен показатель ZPHL/HHL (p = 0,001; U-тест).
Так как было обнаружено влияние СГКС на кинетические свойства фермента (уменьшение значения ZPHL/HHL), на следующем этапе из статистического анализа были исключены все пациенты, принимающие не только ИАПФ, но и/или СГКС. В полученной когорте пациентов (n = 57) была отмечена статистическая однородность групп с активным (n = 28) и неактивным (n = 29) течением болезни. Были подтверждены различия по показателям 1G12 и 1G12/9B9 (p < 0,05; U-тест) между группами сравнения. При этом не было обнаружено клинико-анамнестических при-
знаков (см. табл. 2, 4), влияющих на показатели фенотипирования АПФ.
Изменение показателей фенотипирования АПФ при различных внелегочных проявлениях саркоидоза. В общей когорте до исключения приема ИАПФ и/или СГКС (n = 85) у пациентов с поражением печени (n = 6) было отмечено изменение параметра фенотипирования АПФ 9B9/HHL (p < 0,05; U-тест). В когорте пациентов, не принимающих ИАПФ (n = 73), поражение центральной нервной системы (n = 3) оказывало влияние на параметр ZPHL/HHL (p < 0,05; U-тест). В когорте пациентов, не принимающих ИАПФ и/или СГКС (n = 57), при наличии поражения селезенки (n = 9) были получены различия по параметрам фенотипирования i1A8 и i1A8/9B9 (p < 0,05; U-тест). Дальнейший статистический анализ перечисленных результатов не представляется возможным из-за малого количества наблюдений.
Заключение
В исследовании, включавшем 85 пациентов с диагностированным саркоидозом, было выявлено, что отдельные показатели фенотипирования АПФ (1G12, 1G12/9B9) более надежны в скрининге обострения саркоидоза, чем рутинное измерение активности АПФ (FAPGG). Вместе с тем для корректной оценки результатов фенотипи-рования требуется либо отсутствие приема ИАПФ, либо их краткосрочная отмена на время выведения препарата из плазмы крови. Сыворотка/плазма пациентов, принимающих ИАПФ, не подходит для проведения фенотипирования АПФ, так как
Результаты исследований
эти препараты изменяют многие показатели: FAPGG, ZPHL/HHL, 9В9/ННЬ, 1G12, Ю12/9В9, 6А12, 6А12/9В9.
Из сильных сторон нового метода следует отметить специфичность для параметра Ю12/9В9, равную 86% (для значения >0,255 отн. ед.), что позволяет с высокой вероятностью исключать реактивацию заболевания (значение Ю12/9В9 ниже порогового) у пациентов с неактивным течением саркоидоза. В исследовании S.M. Danilov et а1. (2010) наблюдалось увеличение тех же показателей (Ю12 и Ю12/9В9) в ЛУ, пораженных саркоидозом, по сравнению с ЛУ без саркоидных гранулем [18].
Другие интересные находки, обнаруженные в ходе анализа, - это влияние приема СГКС на кинетику АПФ, выраженное в изменении отношения активности фермента по 2 субстратам ZPHL/HHL. По полученным данным, прием СГКС не влияет на оценку активности саркоидоза при выполнении фенотипирования, но, возможно, препятствует анализу органоспецифи-ческого поражения. В работе S.M. Dani1ov et а1. (2010) наблюдалось значимое снижение уровня ZPHL/HHL у больных сар-коидозом по сравнению с пациентами без него, однако не было оценено число пациентов, принимавших СГКС, поэтому причинно-следственная связь не была предположена [18].
При поражении селезенки саркоидозом обнаружено изменение показателей ПА8 и ПА8/9В9 (р < 0,05; и-тест), но чувствительность статистических методов стала возможной только после исключения пациентов с анамнезом приема ИАПФ и СГКС. Интересно, что увеличение тех же показателей, продемонстрированное в работе S.M. Dani1ov et а1. (2010), было характерно для ткани легких больных саркоидозом по сравнению с биоматериалом пациентов без него, но не характерно для ткани ЛУ [18].
Таким образом, при проведении фе-нотипирования АПФ в крови пациентов с саркоидозом нам удалось обнаружить ряд маркеров, которые имеют отличия у
больных с активным течением саркоидоза (Ю12, Ю12/9В9), при поражении селезенки (ПА8, ПА8/9В9), при приеме СГКС ^Р^/Н^). Выявлено, что прием СГКС может нормализовывать (снижать повышенный) уровень АПФ в крови у больных саркоидозом [28], т.е. устранять эффект повышения активности АПФ, который, согласно данным S.M. Dani1ov et а1. (2010), вызван не повышенным слущиванием АПФ с эндотелиальных клеток легких, а поступлением АПФ из гранулем ЛУ [18]. У пациентов, принимающих СГКС, можно предположить уменьшение поступления АПФ из гранулем ЛУ, что снижает уровень "гранулематозного" АПФ в крови, который мог бы быть детектирован с помощью метода фенотипирования АПФ. Косвенно эта гипотеза проиллюстрирована у больных с фибрилляцией предсердий, у которых наблюдалось 3-кратное возрастание активности АПФ в тканях сердца [29], но на фено-типировании АПФ в крови данное явление не отражалось, так как только 1% фермента в плазме происходит из тканей сердца [21].
В целом метод фенотипирования АПФ представляется перспективным у пациентов с саркоидозом и интерстициальными заболеваниями легких как в практическом (диагностическом ракурсе), так и для уточнения патогенетических механизмов заболевания, которые с момента его описания остаются не до конца изученными [30]. Эта перспектива может быть реализована в исследованиях с более строгими критериями отбора пациентов и оказаться полезной в диагностике отдельных состояний. Кроме того, мы предполагаем, что совмещение данных этого метода с результатами генетического анализа ^Ю-полиморфизма гена ACE будет иметь положительный эффект, так как генетическое исследование в комплексе с определением активности АПФ позволит дифференцировать рефе-ренсный интервал активности фермента в зависимости от 1/0-генотипа [31-33].
Примечание. Работа выполнена в рамках государственного задания Медицинского
Фенотнпнпованне АПФ при саркондозе
научно-образовательного центра ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова" с использованием биоматериала человека, собранного и сохраняемого в рамках научной программы "Научные основы создания Национального банка-депозитария живых систем" (соглашение РНФ № 14-50-00029), и оборудования, приобретенного за счет
средств Программы развития ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Благодарность. Авторы выражают благодарность докт. биол. наук С.М. Данилову за сотрудничество.
Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Phenotyping of Angiotensin-I-converting Enzyme in Patients with Systemic Manifestations of Sarcoidosis
L.Ya. Frantsuzevich, A.P. Bobkov, M. Jain, O.V. Kurilova, V.I. Sholomova,
M.Yu. Brovko, A.S. Belevskiy, E.P. Pavlikova, L.M. Samokhodskaya, T.N. Krasnova
The variety of clinical manifestations of sarcoidosis indicates the systemic nature of the disease, which significantly complicates the diagnosis. Using the method of determining changes in tertiary structure of angiotensin-I-convert-ing enzyme (ACE), organo- and tissue-specific conformation of the enzyme was demonstrated. ACE phenotyping was performed using citrated plasma from 85 patients with sarcoidosis. The method included the simultaneous determination of ACE activity on 2 substrates, calculation of the ratio of ACE activities for hydrolysis on these substrates, determination of the levels of immunoreactive ACE protein and ACE conformation using a set of monoclonal antibodies to enzyme with subsequent statistical processing of the data. Differences were found in patients with sarcoidosis with high disease activity in phenotyping parameters 1G12 and 1G12/9B9 (p < 0.05), as well as change in i1A8 and i1A8/9B9 indices in spleen sarcoidosis (p < 0.05). A significant effect on phenotyping parameters was revealed not only of ACE inhibitors, but also of systemic glucocorticosteroids. Phenotyping seems to be a promising screening method for diagnosis of active course of sarcoidosis. However, the possibilities of the method in assessing the prevalence of the disease, including organ specificity, are insufficiently reasoned.
Key words: sarcoidosis, systemic manifestations of sarcoidosis, screening, angiotensin-I-converting enzyme, con-formational changes.
