CC BY
30
Фенотипирование ангиотензинпревращающего фермента у пациентов с саркоидозом
Л.Я. Французевич, А.П. Бобков, М. Джайн, О.В. Курилова, В.Е. Синицын, В.И. Шоломова, М.Ю. Бровко, А.С. Белевский, Е.П. Павликова, Л.М. Самоходская, Т.Н. Краснова
Увеличение экспрессии ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) в тканях приводит к пропорциональным изменениям активности АПФ в крови. Известно, что повышенный уровень АПФ является одним из маркеров активности гранулематозных заболеваний, в частности саркоидоза. Поскольку манифестация саркоидоза часто сопровождается единственными нарушениями со стороны дыхательной системы, требуются надежные мало-инвазивные методы его дифференциальной диагностики с другими интерстициальными заболеваниями легких (ИЗЛ). Так как при использовании рутинного измерения активности АПФ в крови не было выявлено достоверной ее корреляции с количеством АПФ в гранулемах при саркоидозе, мы предлагаем использовать новый подход к анализу этого белка в крови, основанный на конформационных (пространственных) особенностях фермента, - фенотипирование АПФ. Целью исследования являлось изучение возможности использования метода фенотипирования АПФ в качестве дифференциального диагностического маркера саркоидоза с другими ИЗЛ. Фенотипирование АПФ было проведено с использованием цитратной плазмы 114 пациентов с интерстициаль-ными изменениями легких (из них 89 больных саркоидозом). Метод включал одновременное определение активности АПФ по 2 субстратам (ZPHL и HHL); расчет соотношения гидролиза по этим субстратам (ZPHL/HHL); определение уровней иммунореактивного белка АПФ и конформации АПФ с помощью набора моноклональных антител (МАТ) к АПФ с последующей статистической обработкой данных. Было обнаружено достоверное различие между больными саркоидозом и ИЗЛ по уровню активности АПФ на разных субстратах (ZPHL и HHL), в том числе активности АПФ, преципитированного на МАТ 9В9 (U-тест; р < 0,05). Таким образом, активность АПФ действительно оказалась большей в крови у пациентов с гранулематозным воспалением при саркоидозе, чем у пациентов с ИЗЛ, связанными с другими типами воспалений, в том числе с гранулематозным воспалением с аллергической этиологией (гиперсенситивный пневмонит).
Ключевые слова: ангиотензинпревращающий фермент, саркоидоз, конформационные изменения, скрининг, интерстициальные заболевания легких.
Введение
Саркоидоз - системное воспалительное заболевание с широким спектром клинических проявлений, в основе которого лежит гранулематоз-ное воспаление. Среди причин постоянного возрастания числа больных саркоидозом некоторые авторы указывают влияние окружающей среды и промышленное загрязнение. Несмотря на длительную историю изучения заболевания, этиология и многие аспекты его патогенеза остаются неизвестными [1, 2]. В дебюте саркоидоза чаще всего возникают интерстициальные изменения в легких, что требует проведения дифференциальной диагностики с интерстициальными заболеваниями легких (ИЗЛ) другой патогенетической природы. Именно развитие гранулематозного воспаления, ассоциированного с повышением уровня сывороточного ангиотензинпревращаю-щего фермента (АПФ), или CD143, позволило включить показатель концентрации АПФ как в критерии диагностики, так и в критерии актив-
ности саркоидоза. Однако накопленные в литературе к настоящему времени данные противоречивы, и четкой корреляции между уровнем АПФ в крови и концентрацией АПФ в гранулемах при саркоидозе не обнаружено [3].
Ангиотензинпревращающий фермент представляет собой цинкзависимую карбоксидипеп-тидазу, которая участвует в регуляции артериального давления и ремоделировании сосудистой стенки. Этот белок конститутивно экспрессиру-ется на поверхности эндотелия, нейроэпителия, абсорбирующего эпителия нефрона и в клетках иммунной системы (дендритные клетки, макрофаги). Считается, что АПФ крови в первую очередь происходит из эндотелиальных клеток капилляров легких в результате протеолитическо-го расщепления АПФ еще не идентифицированной секретазой [4]. Экспрессия АПФ в тканях, а следовательно, и уровень АПФ в крови также зависят от генетических факторов, самым известным из которых является 1^-полиморфизм
гена ACE: отсутствие (делеция, D), а не присутствие (вставка, I) Alu-повтора (фрагмент последовательности нуклеотидов длиной 287 пар оснований) в 16-м интроне гена ACE связано со значительно более высокими уровнями АПФ в крови, большей экспрессией АПФ в лимфоцитах и ткани сердца человека. Однако I/D-полиморфизм отвечает только за 20% вариабельности уровня АПФ в тканях и сыворотке [5]. При этом попытки проанализировать генотип АПФ в комплексе с активностью АПФ позволили более точно выявлять больных саркоидозом, устанавливая ре-ференсный интервал активности фермента для каждого генотипа [6-8]. При замене компонента генотипирования АПФ иммунохимическим анализом белка АПФ (фенотипированием АПФ) можно ожидать снижения временных затрат на диагностику, кроме того, это будет способствовать поиску ассоциаций определенных конфор-мационных состояний (фенотипа) АПФ с конкретными клиническими явлениями [5, 9, 10].
В настоящее время выделены моноклональ-ные антитела (МАТ) более чем к 40 различным эпитопам N-домена человеческого АПФ. Локализация эпитопов всех МАТ на молекуле АПФ (картирование эпитопов) позволила идентифицировать и картировать критические функциональные области этого важного фермента и разработать новый подход к исследованиям АПФ -конформационный фингерпринтинг АПФ. Уста-
новлено, что локальная конформация АПФ является органо- и тканеспецифической за счет различных сайтов гликозилирования белка АПФ в органных и тканевых паттернах [11-13].
Целью исследования являлось определение диагностических возможностей фенотипирова-ния АПФ у больных саркоидозом.
Материал и методы
В исследование было включено 114 пациентов с интерстициальными изменениями в легких, наблюдавшихся в Клинике ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы № 3 ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет) (директор клиники - докт. мед. наук, профессор С.В. Моисеев) в 2015-2019 годах.
Основную группу составили 89 больных сар-коидозом, в группу сравнения вошло 25 пациентов с другими ИЗЛ. Среди них поражение легких в рамках системных заболеваний имело место у 4 пациентов (у 3 с болезнью Шегрена и у 1 с системной склеродермией), идиопатические интер-стициальные пневмонии - у 17 больных (неспецифическая интерстициальная пневмония - у 6, криптогенная организующаяся пневмония - у 5, идиопатический легочный фиброз - у 3, лимфо-цитарная интерстициальная пневмония - у 2,
Лайне Яновна Французевич - стажер-исследователь отдела внутренних болезней МНОЦ ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", ассистент кафедры пульмонологии ФДПО ФГАОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" МЗ РФ, Москва.
Александр Петрович Бобков - аспирант кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Марк Джайн — стажер-исследователь отдела лабораторной диагностики МНОЦ ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Ольга Валерьевна Курилова - науч. сотр. отдела лабораторной диагностики МНОЦ ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Валентин Евгеньевич Синицын - докт. мед. наук, зав. отделом лучевой диагностики МНОЦ, профессор кафедры многопрофильной клинической подготовки факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Виктория Игоревна Шоломова - канд. мед. наук, ассистент кафедры внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет).
Михаил Юрьевич Бровко - канд. мед. наук, зам. гл. врача по медицинской части Клиники ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы № 3 ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет).
Андрей Станиславович Белевский - докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой пульмонологии ФДПО ФГАОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" МЗ РФ, Москва. Елена Петровна Павликова - докт. мед. наук, зам. директора МНОЦ, зав. отделом внутренних болезней МНОЦ, профессор кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Лариса Михайловна Самоходская - канд. мед. наук, доцент, зав. отделом лабораторной диагностики МНОЦ, ст. науч. сотр. Евразийского центра по продовольственной безопасности (Аграрный центр), вед. науч. сотр. лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова".
Татьяна Николаевна Краснова - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. отдела внутренних болезней МНОЦ, зав. кафедрой внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", доцент кафедры внутренних, профессиональных болезней и ревматологии Института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" МЗ РФ (Сеченовский университет).
Контактная информация: Французевич Лайне Яновна, frantsuzevitch@mail.ru
респираторный бронхиолит - у 1), лимфангио-лейомиоматоз - у 1 пациента, легочный альвеолярный протеиноз - у 1, гиперсенситивный пневмонит - у 2.
Диагноз саркоидоза устанавливался согласно критериям клинических рекомендаций Министерства здравоохранения РФ. Заболевания из группы ИЗЛ диагностированы согласно критериям ERS/ATS (European Respiratory Society/American Thoracic Society - Европейское респираторное общество/Американское торакальное общество) 2013 г. Пациентам было проведено клинико-инструментальное обследование, включающее сбор анамнеза, объективные осмотр и физическое обследование, определение функции внешнего дыхания или диффузионной способности легких по оксиду углерода и проведение мультиспиральной компьютерной томографии органов грудной клетки, а также исключение туберкулеза легких на основании диаскинтеста или T-SPOT.TB.
Кроме того, у части пациентов с саркоидозом (у 59 (66,7%) из 89), у 2 пациентов с криптоген-ной организующейся пневмонией и у 1 больного интерстициальной пневмонией в рамках системной склеродермии была проведена морфологическая верификация диагноза.
Помимо общепринятых лабораторных тестов проводилось фенотипирование АПФ крови, включавшее анализ активности АПФ по 2 субстратам и конформационный фингерпринтинг АПФ: измерение по 1 субстрату активности АПФ, преципитированного на моноклональных антителах (МАТ).
При фенотипировании использовались такие субстраты, как бензилоксикарбонил^-фенил-аланил^-гистидил^-лейцин (Z-Phe-His-Leu, ZPHL) и гиппурил^-гистидил^-лейцин (Hip-His-Leu, HHL). Антитела к человеческому АПФ, использованные в исследовании, включали набор мышиных МАТ к человеческому АПФ, распознающих нативную конформацию N- и C-доменов человеческого АПФ из эндотелиоци-тов легких [11]. У всех пациентов был выполнен фингерпринтинг АПФ с использованием 2 антител - 9В9 и 1G12, у части больных использовался набор из 6 антител - 9B9, 3A5, i1A8, 1G12, 6A12 и1E10.
Анализ активности АПФ. Активность АПФ в препаратах сыворотки или цитратной плазмы измеряли с помощью флуориметрического анализа с 2 субстратами АПФ - 2 мМ ZPHL или 5 мМ HHL [14]. Активность АПФ у пациентов выражалась в МЕ/л и единицах люминесценции (ед. люм.). Расчет соотношения ZPHL/HHL [15] осуществляли путем деления флуоресценции об-
разца по субстрату ZPHL на флуоресценцию по субстрату HHL.
Иммунологическая характеристика АПФ крови с помощью МАТ (фингерпринтинг АПФ). Уровень иммунореактивного белка АПФ с использованием МАТ 9B9 определяли количественно, как описано ранее [5]. Конформацион-ный фингерпринтинг АПФ крови с остальными МАТ (3A5, i1A8, 1G12, 6A12, 1E10) к АПФ был выполнен и представлен согласно методам, описанным ранее S.M. Danilov et al. [11, 13].
Статистические методы. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS Statistics software (IBM, США). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса; в изучаемых группах для подавляющего большинства параметров отсутствовало нормальное распределение (p < 0,05), поэтому использовались непараметрические критерии сравнения: U-критерий Ман-на-Уитни (U-тест) при бинарном характере значений и критерий Крускала-Уоллиса - при полиномиальном. Пороговые значения для параметров АПФ крови со значимыми различиями в группах были установлены на основе анализа ROC-кривых (receiver operating characteristic -рабочая характеристика приемника) с оценкой AUC (area under curve - площадь под кривой), чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной прогностических значимо-стей (positive and negative predictive values, PPV и NPV) порогового значения. При сравнении частот значений качественных показателей (порядковых и номинальных) использовался точный критерий Фишера (F-критерий) или критерий х2 Пирсона. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Перед сравнением результатов фенотипирова-ния АПФ обе группы больных сопоставили по частоте встречаемости различных интеркуррент-ных состояний. Оказалось, что среди больных саркоидозом превалировали женщины, а пациенты группы ИЗЛ были значимо старше (p < 0,01), с более высокими массой тела (p = 0,02) и индексом массы тела (ИМТ) (p = 0,045). Частота встречаемости синдрома артериальной гипертонии (АГ) и легочной гипертензии (ЛГ) была выше в группе ИЗЛ (значимость точного критерия Фишера p = 0,042 и p = 0,007 соответственно). В то же время различий по частоте приема ингибиторов АПФ (ИАПФ), глюкокортикосте-роидов (ГКС), встречаемости сахарного диабета не обнаружено (p > 0,05) (табл. 1).
Таблица 2. Связь возраста, массы тела, ИМТ и АГ с показателями фенотипирования в исследуемой выборке (п = 114)
Таблица 1. Общая характеристика пациентов с саркоидозом и ИЗЛ
Параметр Группа саркоидоза (п = 89) Группа ИЗЛ (п = 25) Р
Мужчины/женщины, п (%) 30 (33,7)/59 (66,3) 12 (48,0)/13 (52,0) >0,050*
Возраст, годы (Ме Qз]) 48 [37,5; 61,5] 61 [54,5; 66,0] <0,010**
Рост, м (Ме Q3]) 1,67 [1,60; 1,76] 1,72 [1,60; 1,76] >0,050*
Масса тела, кг (Ме Qз]) 76 [65; 89] 83 [78,5; 94,8] 0,020**
ИМТ, кг/м2 (Ме Q3]) 27,1 [23,4; 31,7] 30,8 [25,6; 34,8] 0,045**
Сахарный диабет в анамнезе, п (%) 11 (12,4) 6 (24,0) >0,050*
АГ в анамнезе, п (%) 38 (42,7) 16 (64,0) 0,042*
ЛГ в анамнезе, п (%) 4(4,5) 6 (24,0) 0,007*
Прием ИАПФ, п (%) 13 (14,6) 4 (16,0) >0,050*
Прием системных ГКС, п (%) 14 (15,7) 6 (24,0) >0,050*
* Точный критерий Фишера. ** и-критерий Манна-Уитни. Обозначения здесь и в табл. 4: Ме Q3] - медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль].
Параметр фенотипирования Возраст Масса тела ИМТ АГ
г s Р г s Р г s Р р**
FAPGG -0,350 0,005 -0,248 0,043 -0,319 0,013 <0,001
ит (МЕ/л)* -0,161 0,044 - - - - -
ит (ед. люм.) - - -0,168 0,042 - - -
МАТ Ю12 0,195 0,019 - - 0,161 0,049 0,001
МАТ 6А12 0,398 0,046 - - - - -
ZPHL/HHL 0,174 0,033 - - 0,215 0,014 0,019
9В9/ит 0,157 0,049 0,169 0,042 0,184 0,029 0,045
3А5/9В9* -0,430 0,033 - - - - 0,035
Ю12/9В9 0,254 0,003 0,196 0,021 0,185 0,028 <0,001
6А12/9В9 0,398 0,046 - - - - -
* Данные показатели специфичны только для параметров различия групп саркоидоза и ИЗЛ, т.е. не обнаруживаются среди измененных параметров фенотипирования АПФ при приеме ИАПФ для исследуемой выборки (п = 114). ** И-критерий Манна-Уитни. Обозначения: г, - коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Здесь и в табл. 3, 4: FAPGG - Щ3-(2^игу1)асгу1оу1]^-рЬепу1а1апу1-g1ycy1-g1ycine (субстрат ^[3-(2-фурил)-акрилоил]^-фенилаланил-глицил-глицин).
Возраст, масса тела и ИМТ на значимом уровне коррелировали с рядом показателей фенотипирования АПФ (табл. 2). Было предварительно установлено статистически достоверное различие некоторых параметров фенотипирования у больных АГ (FAPGG, Ш12, ZPHL/HHL, 9В9/Нт, 3А5/9В9, Ш12/9В9).
Как оказалось, различающиеся параметры двух групп были статистически достоверно связаны друг с другом. Так, между возрастом и ИМТ была обнаружена значимая корреляция (гз = 0,313; р = 0,001), как и между массой тела и ИМТ (гз = 0,846; р < 0,001), последнее очевидно. Кроме того, наблюдалось значимое различие по возрасту для лиц, страдающих АГ или ЛГ, а также различие по массе тела и ИМТ для пациентов с АГ (рис. 1). Важно отметить, что такие факторы различий между группами, как возраст и наличие АГ, находятся в статистически значимой взаимосвязи с приемом ИАПФ (значимость и-критерия для возраста р < 0,05; значимость точного критерия Фишера для АГ р < 0,05) (см. рис. 1).
При оценке влияния приема ИАПФ на показатели фенотипирования АПФ было обнаружено, что он оказывает значимое влияние на множество параметров фенотипирования (табл. 3).
Оказалось, что почти все показатели АПФ крови, достоверно коррелирующие или различающиеся у пациентов по возрасту, массе тела,
ИМТ, АГ, ЛГ, также имели статистически значимые различия при приеме ИАПФ (HHL (ед. люм.), Ш12, 6А12, ZPHL/HHL, 9В9/Нт, Ш12/9В9, 6А12/9В9), за исключением отдельных минорных параметров (HHL (МЕ/л), 3А5/9В9).
Поскольку прием ИАПФ сильно влияет на результаты фенотипирования АПФ в крови, в дальнейшем пациенты, принимавшие ИАПФ, были исключены из анализа в обеих группах. Таким образом, в следующий этап анализа было включено только 76 больных саркоидозом и 21 пациент с ИЗЛ. У пациентов из двух групп сохранялись статистически значимые различия по возрасту, массе тела, а также наличию АГ и ЛГ. Для исключения влияния этих показателей на параметры фенотипирования АПФ в группах (без учета приема ИАПФ) был проведен повторный статистический анализ, в результате кото-
Таблица 3. Влияние приема ИАПФ на показатели фенотипирования АПФ
Параметр р** Параметр р**
FAPGG* <0,001 ZPHL/HHL <0,001
НШ, (ед. люм.) 0,025 Ю12/9В9 <0,001
МАТ Ю12 <0,001 6А12/9В9 0,027
МАТ 6А12 0,027 9В9/Нт <0,001
* Активность АПФ крови - рутинное исследование. ** И-критерий Манна-Уитни.
Кластер взаимосвязей между
параметрами различия для групп саркоидоза и ИЗЛ
Рис. 1. Статистические отношения между параметрами различий групп саркоидоза и ИЗЛ. Из 5 параметров 3 имеют по 3 прямые связи, однако для ИМТ одна из связей номинальна, так как масса тела является компонентом для расчета ИМТ, поэтому наиболее четкими связующими компонентами между 5 показателями являются возраст и АГ. Важно, что оба эти показателя находятся также в достоверной взаимосвязи с показателем приема ИАПФ пациентами в выборке (п = 114). гз - коэффициент ранговой корреляции Спирмена.
рого ни один из перечисленных параметров (возраст, масса тела, АГ и ЛГ) не продемонстрировал достоверного уровня влияния (р > 0,05) на какой-либо параметр АПФ.
Таким образом, в анализируемых группах действительно наблюдались различия, которые не оказывали значимого влияния на показатели
(а)
О м
11 Ei .
S S <î g
(д)
16 г
12
(б)
0
12000 г
е
g в и *
а кг m а> о .
&С5
S и g ®
S Е
s
(U 1=1
А ей 1=1 Щ
Саркоидоз ИЗЛ 12000 8000 4000 0
3-
© к
Û « в «
S d
И нн
а й g «
< g
8000
4000
ZU
Саркоидоз ИЗЛ
фенотипирования АПФ, но представляли собой косвенные характеристики самих групп. Известно, что средний возраст диагностики саркоидоза меньше возраста диагностики других ИЗЛ, включенных в анализ (согласно руководству по ИЗЛ ERS/ATS, 2013). В связи с этим мы полагаем, что старший возраст пациентов в группе ИЗЛ являлся причиной более частой встречаемости в этой группе как АГ и ЛГ (значимость U-критерия p < 0,05), так и больших значений массы тела и ИМТ (значимость коэффициента ранговой корреляции Спирмена p < 0,05). Поэтому дальнейшее статистическое сравнение результатов фено-типирования в 2 группах является корректным, несмотря на наличие достоверных различий между группами.
В табл. 4 представлены данные описательной статистики по параметрам фенотипирования для 2 групп.
Согласно статистическому сравнению выявлены достоверные различия в показателях фено-типирования АПФ:
1) активность АПФ (в МЕ/л) по субстратам ZPHL (р = 0,029) и HHL (p = 0,020);
2) активность АПФ (в ед. люм.) по тем же субстратам (p = 0,022 и p = 0,008 соответственно);
3) активность АПФ, преципитированного на МАТ 9B9 (в ед. люм.), по субстрату ZPHL (p = 0,008).
Однако при проведении ROC-анализа было обнаружено невысокое качество модели для использования этих параметров как верифицирующего признака между саркоидозом и другими ИЗЛ (n = 97) - значение AUC от 0,6 до 0,7 (слабое качество модели сравнения - "poor quality" - по классификации, представленной по адресу:
(в) © ч
5 н >0 §
о -г О lJ
м щ
П нн
S И ^ О
3 И
12 г
4 -
0
X
Саркоидоз ИЗЛ
1_
Г
Саркоидоз ИЗЛ
(г)
12000
n i
5 а 8000
S
» J
вв 4000
0
-С
3-
Саркоидоз ИЗЛ
Рис. 2. Сравнение групп саркоидоза (n = 76) и ИЗЛ (n = 21) с учетом результатов ROC-анализа (см. табл. 5) по показателям фенотипирования АПФ, различающихся в 2 группах (без учета пациентов, принимавших ИАПФ): активность АПФ по ZPHL в МЕ/л (пороговое значение 2,46 МЕ/л) (а) и в ед. люм. (пороговое значение 1440 ед. люм.) (б), по HHL в МЕ/л (пороговое значение 2,58 МЕ/л) (в) и в ед. люм. (пороговое значение 1187 ед. люм.) (г) и АПФ, пре-ципитированного на МАТ 9B9 (пороговое значение 5025 ед. люм.) (д). Данные представлены в виде 1-го и 3-го квартилей (прямоугольники; 50% значений выборки) с интервалом минимальных и максимальных значений (отрезки; 100% значений выборки). Значения выше порогового в ROC-анализе для указанных параметров рассматриваются в качестве модели классификации пациентов в группу саркоидоза (диагностика саркоидоза).
Таблица 5. Результаты ROC-анализа для параметров фе-нотипирования АПФ в группах саркоидоза (n = 76) и ИЗЛ
(n = 21)
http://gim.unmc.edu/dxtests/roc3.htm). В табл. 5 приведены основные результаты ИОС-анализа.
Сравнение двух групп с указанием порогового значения, полученного в ИОС-анализе, представлено на рис. 2.
Заключение
Результаты проведенного анализа свидетельствуют о том, что повышение активности АПФ по субстратам ZPHL, HHL, а также АПФ, преци-питированного на МАТ 9В9, было значимо более выраженным у пациентов с гранулематозным воспалением при саркоидозе, чем у пациентов с ИЗЛ, связанными с другими типами воспалений, в том числе с гранулематозным воспалением аллергической этиологии (гиперсенситивным пневмонитом). Прием ИАПФ изменяет многие показатели фенотипирования АПФ (HHL (ед. люм.), 1G12, 6A12, ZPHL/HHL, 9B9/HHL, 1G12/9B9 и 6A12/9B9), что требует проведения исследований при отмене препаратов. Описанная методика также позволяет определить пациентов, принимающих ИАПФ.
Для определения ценности использования метода фенотипирования в качестве дифференциального диагностического критерия саркоидоза и других ИЗЛ, возможно, необходимо большее количество исследований, однако, учитывая, что саркоидоз является системным заболеванием с поражением сердца, почек, печени, нервной системы и др., а интерпретация вовлечения в патологический процесс конкретного органа или системы не всегда однозначна, представляется перспективным изучение применимости феноти-пирования при различных вариантах течения саркоидоза. В настоящей работе прогностическая ценность данной методики не оценивалась из-за точечного характера исследования.
Работа выполнена в рамках государственного задания МНОЦ МГУ им. М.В. Ломоносова с использованием биоматериала человека, собранного и сохраняемого в рамках научной программы "Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем" (соглашение РНФ №14-50-00029), и оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития МГУ им. М.В. Ломоносова.
Авторы выражают благодарность докт. биол. наук С.М. Данилову за сотрудничество.
Список литературы
1. Baughman RP, Lower EE, du Bois RM. Sarcoidosis. The Lancet 2003 Mar;361(9363):1111-8.
2. Terwiel M, van Moorsel CHM. Clinical epidemiology of familial sarcoidosis: a systematic literature review. Respiratory Medicine 2019 Mar;149:36-41.
3. Römer FK. Clinical and biochemical aspects of sarcoidosis. With special reference to angiotensin-converting enzyme (ACE). Acta Medica Scandinavica. Supplementum 1984;690:3-96.
4. Bernstein KE, Ong FS, Blackwell WLB, Shah KH, Giani JF, Gonzalez-Villalobos RA, Shen XZ, Fuchs S, Touyz RM. A modern understanding of the traditional and nontraditional biological functions of angiotensin-converting enzyme. Pharmacological Reviews 2012 Dec;65(1):1-46.
Таблица 4. Параметры фенотипирования в группах саркои-доза и ИЗЛ (Me [Qt; Q3])_
Параметр Группа саркоидоза (n = 76) Группа ИЗЛ (n = 21) Р*
FAPGG, МЕ/л 73 [55; 114] - -
ZPHL, МЕ/л 3,51 [2,80; 5,41] 2,88 [2,05; 3,54] 0,029
ZPHL, ед. люм. 2365 [1921; 3006] 1979 [1186; 2526] 0,022
Нт, МЕ/л 2,61 [2,03; 3,83] 2,13 [1,37; 2,56] 0,020
НШ,, ед. люм. 1768 [1431; 2245] 1337 [829; 1811] 0,008
МАТ 9В9, ед. люм. 6015 [5118; 7217] 4872 [3773; 6370] 0,008
МАТ 3А5, ед. люм. 3282 [2390; 4679] - -
МАТ ПА8, ед. люм. 479 [332; 586] - -
МАТ Ю12, ед. люм. 1427 [1125; 1875] 1236 [814; 2027] >0,050
МАТ 6А12, ед. люм. 392 [271; 813] - -
МАТ 1Е10, ед. люм. 948 [605; 1249] - -
ZPHL/HHL 1,36[1,27;1,41] 1,37[1,31;1,42] >0,050
9В9^Рт 6,19 [5,45; 7,05] 6,42 [4,88; 7,40] >0,050
9В9/Нт 8,16 [7,22; 9,12] 8,74 [6,67; 11,0] >0,050
3А5/9В9 0,65[0,61; 0,71] - -
ПА8/9В9 0,056 [0,039; 0,069] - -
Ю12/9В9 0,23 [0,21; 0,27] 0,25 [0,21; 0,34] >0,050
6А12/9В9 0,046 [0,032; 0,096] - -
1Е10/9В9 0,111 [0,071; 0,147] - -
* U-критерий Манна-Уитни.
Параметр Чувствительность, % Специ-фич- ность, % PPV, % NPV, % Общая точность, % AUC Порог
ZPHL (МЕ/мл) 88 48 86 53 79 0,657 >2,46
ZPHL (ед. люм.) 95 38 85 67 82 0,664 >1440
HHL (МЕ/мл) 52 81 91 32 58 0,666 >2,58
HHL (ед. люм.) 92 43 85 60 81 0,689 >1187
МАТ 9B9 (ед. люм.) 79 57 87 43 74 0,689 >5025
5. Danilov S, Savoie F, Lenoir B, Jeunemaitre X, Azizi M, Tar-now L, Alhenc-Gelas F. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I converting enzyme suitable for large-scale studies. Journal of Hypertension 1996 Jun;14(6):719-27.
6. Kruit A, Grutters JC, Gerritsen WB, Kos S, Wodzig WKWH, van den Bosch JMM, Ruven HJT. ACE I/D-corrected Z-scores to identify normal and elevated ACE activity in sarcoidosis. Respiratory Medicine 2007 Mar;101(3):510-5.
7. Fl0e A, Hoffmann HJ, Nissen PH, Möller HJ, Hilberg O. Geno-typing increases the yield of angiotensin-converting enzyme in sarcoidosis - a systematic review. Danish Medical Journal 2014 May;61(5):A4815.
8. Csongradi A, Enyedi A, Takacs I, Vegh T, Manyine IS, Polik Z, Altorjay IT, Balla J, Balla G, Edes I, Kappelmayer J, Toth A, Papp Z, Fagyas M. Optimized angiotensin-converting enzyme activity assay for the accurate diagnosis of sarcoidosis. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2018 Jun;56(7):1117-25.
9. Montgomery H, Humphries S, Danilov SM. Is genotype or phenotype the better tool for investigating the role of ACE in human cardiovascular disease? European Heart Journal 2002 Jul;23(14):1083-6.
10. Danser AH, Batenburg WW, van den Meiraker AH, Danilov SM. ACE phenotyping as a first step toward personalized medicine for ACE inhibitors. Why does ACE genotyping
not predict the therapeutic efficacy of ACE inhibition. Pharmacology & Therapeutics 2007 Mar;113(3):607-18.
11. Danilov SM, Balyasnikova IB, Danilova AS, Naperova IA, Ara-blinskaya E, Borisov SE, Metzger R, Franke FE, Schwartz DE, Gachok IV, Trakht IN, Kost OA, Garcia JGN. Conformational fingerprinting of the angiotensin-converting enzyme (ACE). 1. Application in sarcoidosis. Journal of Proteome Research 2010 Nov;9(11):5782-93.
12. Tikhomirova VE, Kost OA, Kryukova OV, Golukhova EZ, Bulaeva NI, Zholbaeva AZ, Bokeria LA, Garcia JGN, Danilov SM. ACE phenotyping in human heart. PLoS One 2017 Aug;12(8):e0181976.
13. Danilov SM, Tikhomirova VE, Metzger R, Naperova IA, Bukina TM, Goker-Alpan O, Tayebi N, Gayfullin NM, Schwartz DE, Samokhodskaya LM, Kost OA, Sidransky E. ACE phenotyping in Gaucher disease. Molecular Genetics and Metabolism 2018 Apr;123(4):501-10.
14. Danilov SM, Tovsky SI, Schwartz DE, Dull RO. ACE pheno-typing as a guide toward personalized therapy with ACE inhibitors. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics 2017 Jul;22(4):374-86.
15. Danilov SM, Balyasnikova IV, Albrecht RF 2nd, Kost OA. Simultaneous determination of ACE activity with 2 substrates provides information on the status of somatic ACE and allows detection of inhibitors in human blood. Journal of Cardiovascular Pharmacology 2008 Jul;52(1):90-103.
Phenotyping Angiotensin-converting Enzyme in Patients with Sarcoidosis
L.Ya. Frantsuzevich, A.P. Bobkov, M. Jain, O.V. Kurilova, V.E. Sinitsyn, V.I. Sholomova, M.Yu. Brovko, A.S. Belevskiy, E.P. Pavlikova, L.M. Samokhodskaya, and T.N. Krasnova
An increase in expression of angiotensin-converting enzyme (ACE) in tissues leads to proportional changes in the activity of ACE in blood. It is known that increased level of ACE is one of the markers of the activity of granulomatous diseases, in particular sarcoidosis. Since manifestation of sarcoidosis is often accompanied by only respiratory system disorders, reliable minimally invasive methods of differential diagnosis with other interstitial lung diseases (ILD) are required. Routine measurement of ACE activity in blood did not reveal its reliable correlation with the amount of ACE in sarcoid granulomas, therefore we propose to use a new approach based on conformational (spatial) features of enzyme - ACE phenotyping. The aim of the study was to evaluate the possibility of using ACE phenotyping as differential diagnostic marker of sarcoidosis with other ILD. ACE phenotyping was performed using citrated plasma in 114 patients with interstitial lung changes (89 of them were patients with sarcoidosis). The method included simultaneous determination of ACE activity on 2 substrates (ZPHL and HHL); calculation of ratio of hydrolysis for these substrates (ZPHL/HHL); determination of levels of ACE immunoreactive protein and ACE conformation using a set of monoclonal antibodies to the enzyme with subsequent statistical processing of data. A significant difference was found between patients with sarcoidosis and ILD in the level of ACE activity on different substrates (ZPHL and HHL), including the activity of ACE precipitated on MAT 9B9 (U-test, p < 0.05). Thus, ACE activity was indeed greater in blood in patients with sacroidosis than in patients with ILD associated with other types of inflammation, including granulomatous inflammation with allergic etiology (hypersensitive pneumonitis).
Key words: angiotensin-converting enzyme, sarcoidosis, conformational changes, screening, interstitial lung disease.
