CC BY
51
2013
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616.37-051.2 В. И. Утехин
ФЕНОМЕНОЛОГИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ЭПИТЕЛИЯ
ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
В связи с возрастающей хирургической активностью на поджелудочной железе (ПЖ) растет и необходимость в понимании особенностей ее регенерации в ответ на повреждение. Кроме того, в последние годы в связи с ростом заболеваемости сахарным диабетом все более актуальной становится проблема новообразования остров-ковых В-клеток [1-4]. Этим вопросам посвящено определенное количество работ и, в первую очередь, выполненных Е. Ш. Герловиным и его учениками [5-9], однако ряд важных аспектов детализации происходящих в ответ на повреждение событий (особенно в эндокринном отделе ПЖ) остается недостаточно изученным и до настоящего времени.
Цель работы — характеристика основных морфологических параметров эпителия поджелудочной железы в ответ на частичную резекцию ее селезеночного отдела.
Материал и методы. Исследование проведено на крысах-самцах Вистар со средним весом 166±2г (64 шт.). Контролем служили ложнооперированные животные (41 шт.). Всем подопытным животным была произведена продольная резекция селезеночного отдела поджелудочной железы по методике А. А. Пузырева [1]. В различные сроки после начала опыта (1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 и 60 сут) крыс забивали декапитацией после суточного часового голодания в 11 ч утра.
Световая микроскопия. Кусочки ПЖ фиксировали в жидкостях Карнуа, Буэна, обезвоживали и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином Ясвоина и трехцветной смесью Гомори [10]. «Суммарные белки» выявляли сулемой — бром-феноловым синим (СБФ) в модификации П. В. Макарова [11]. Для выявления цито-типов в панкреатических островках (ПО) 4-микронные срезы окрашивали параль-дегидфуксином (PAF) [12] или хромовым гематоксилином [13] и докрашивали трехцветной смесью Гомори.
Морфометрические исследования включали: изучение веса животных, веса головки и тела ПЖ, общего островкового объема, В/А — клеточного объемного отношения, площади ядер и ядрышек.
Утехин Владимир Иосифович — кандидат медицинских наук, доцент, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: utekhin44@mail.ru
© В. И. Утехин, 2013
Изучение веса животных. Все животные взвешивались после 24-часового голодания до начала опыта и в момент забоя. Сравнивали средние значения веса тела до начала опыта и через 30 суток. Вычисляли средний привес.
Изучение веса головки и тела ПЖ. Головку и тело ПЖ подопытных (25 шт.) и контрольных (32 шт.) животных тщательно иссекали и помещали в жидкость Буэна. Через несколько минут отделяли ткань железы от окружающих тканей и помещали в тот же фиксатор на 24 ч, после чего кусочки обсушивали и взвешивали на торзионных весах.
Для определения общего объема островковой ткани использовали метод HeИman [14 a,b,c]: в каждом десятом из 200 серийных 4-микронных срезов, окрашенных PAF и трехцветной смесью Гомори, подсчитывали число панкреатических островков VI и более VI классов (средние и крупные островки), что достоверно отражает объем островковой ткани. Классы островков определяли шаблоном, рекомендованным Tejning [15]. Количество животных в контроле составило 5, в опыте — 6.
В/А — клеточное объемное отношение изучали «выборкой по точкам» [16] на срезах, на которых определяли общий объем островковой ткани. Количество животных в контроле было 5, в опыте — 4.
Для определения площади ядер и ядрышек использовали формулу эллипса, наибольший и перпендикулярный ему диаметры которого определяли винтовым окуляр-микрометром МОВ-15 при общем увеличении 750Х (для ядер) и 3375Х (для ядрышек). Количество животных в контроле было 3, в опыте — 3.
Изучение уровня синтеза ДНК. Для характеристики уровня синтеза ДНК использовали 3Н-тимидин («Изотоп», уд. акт. 9,8 мкКюри/мл), который вводили вну-трибрюшинно за 1 ч до забоя.
Одновременно с подсчетом количества меченых 3Н-тимидином ядер в различных отделах панкреатического эпителия подсчитывали количество митозов и количество дегенерированных ядер, руководствуясь при этом рекомендациями Г. С. Ка-тинаса [17].
Во всех случаях анализа количественных данных для определения различий в контроле и опыте использовали ^-критерий [18].
Для электронно-микроскопического исследования кусочки ПЖ брали под тиопенталовым наркозом, фиксировали в 2% глутаральдегиде на буфере Миллонига, постфиксировали в фиксаторе Колфилда, обезвоживали и заливали в смесь эпон-аралдит или в эпон 812 [19]. После предварительного просмотра полутонких срезов производили прицельную заточку блоков и делали ультратонкие срезы, которые окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-7A при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Результаты. Средний начальный вес животных контрольной группы составил 161,8±2,8 г. Через 30 суток животные контрольной группы прибавили 18,0±0,9 г (при забое их средний вес составил 179,0±5,7 г). Средний начальный вес подопытных крыс был 168,0±2,1 г. Через 30 суток опыта животные прибавили в среднем 16,0±3,3 г. Различия не достоверны (Р > 0,050).
Средний вес головки и тела ПЖ у животных контрольной группы составил 370,0±14,1 мг.
Через 30 суток опыта средний вес головки и тела ПЖ подопытных животных был 333,0±17,1 мг, что достоверно не отличалось от аналогичных уровней у животных контрольной группы (Р > 0,050).
Количество ПО VI и более VI классов, характеризующее общий объем остров-ковой ткани в ПЖ, было в эксперименте 146,0±12,4 против 89,6±8,8 в контроле (различия значимы на уровне Р < 0,005), что свидетельствует о возрастании общего островкового объема у подопытных животных (+61%).
При анализе процессов, происходящих в ПЖ после частичной резекции, железу условно разделяли на «область резекции» и область, «удаленную от места резекции» («отдаленная» часть) [1].
Полученные данные морфометрического и ауторадиографического изучения различных отделов ПЖ контрольных и подопытных животных представлены в таблицах 1-7, а данные ауторадиографического изучения включения 3Н-тимидина в различные отделы панкреатического эпителия дополнительно проиллюстрированы рисунками 1 и 2.
Рис. 1. Влияние частичной панкреат-эктомии на включение 3Н-тимидина в ядра клеток эпителия регенерата.
Значимые отклонения от контрольных уровней в процентах. ПО — панкреатические островки. П1 — вставочные отделы протоков и центро-ацинарные клетки. П2 — внутри- и междолько-вые протоки. А — ацинусы. ТА — эпителиальные трубки по отношению к ацинусам. Тш — эпителиальные трубки по отношению к П1.
Рис. 2. Влияние частичной панкреат-эктомии на включение 3Н-тимидина в ядра клеток эпителия отдаленной от места резекции части поджелудочной железы крыс.
Значимые отклонения от контрольных уровней в процентах. Классы островков по Те;шп§ (1947).
Таблица 1. Включение 3Н-тимидина в эпителиальные структуры поджелудочной железы животных контрольной группы (среднее значение индекса мечения ядер ± стандартная ошибка)
Эндокринная часть Экзокринная часть
классы ПО эпителий ацинусов эпителий протоков
П-1У 1У-1Х X и >Х околоостров-ковые удаленные от ПО вставочные отделы и цен-троацинарные клетки внутри- и междольковые
0,48±0,060 0,20±0,005 0,17±0,015 0,17±0,015 0,11±0,007 1,05±0,070 0,86±0,030
Р < 0,001 N8 Р < 0,001 Р > 0,050
Примечание: N8 — различия не значимы. Классы панкреатических островков по Те^ш^ (1947).
Таблица 2. Данные морфометрического изучения эпителиальных клеток поджелудочной железы контрольных крыс вреднее значение площади в мкм2 ± стандартная ошибка)
Экзокринная часть
Околоостровковые ацинусы Удаленные от островков ацинусы
клетка ядро ядрышко клетка ядро ядрышко
104,34±3,13 22,39±0,65 4,23±0,08 85,99±2,58* 20,67±0,82 3,58±0,12*
Эндокринная часть
А В
клетка ядро клетка ядро
52,88±2,12 20,03±0,60 101,22±7,06* 23,43±0,58*
Примечания: Приведены данные для ПО 1У-1Х классов, составляющих основную массу общего остров-кового объема. Достоверно отличающиеся значения для околоостровковых и удаленных от островков ацинусов, а также эндокринных В-клеток и А-клеток отмечены звездочкой.
Таблица 3. Абсолютные значения площадей (мм2), относительные объемы островковых компонентов (проценты) и В/А клеточные объемные отношения в панкреатических островках различных размеров в группе контрольных крыс (среднее значение ± стандартная ошибка)
Классы островков Размерность А В К А+В+К
11-1У мм2 13,56±0,79 68,96±1,36 6,44±0,32 88,06±1,28
%% 15,24±0.88 77,52±1,53 7,24±0,36 100,00±1,44
В/А 5,09±0,28
У-Х1 мм2 85,20±3,40 336,80±10,56 31,32±1,36 467,76±10,84
%% 21,30±0,73 72,00±2,26 6,70±0,29 100,00±2,32
В/А 3,38±0,28
Х11-Х1У мм2 314,80±41,00 128,8±98,80 118,80±25,28 1722,40±122,60
%% 18,27±2,38 74,83±7,11 6,90±1,46 100,00±7,11
В/А 4,09±0,94
Примечания: Классы островков по Те)ш^ (1947). А — А-клетки; В — В-клетки; К — структуры иные, чем А- и В-клетки (капилляры и соединительная ткань).
Таблица 4. Пролиферативная активность регенерата поджелудочной железы крыс (среднее значение ± стандартная ошибка)
Срок после частичной панкреатэктомии (сутки) Индекс меченых ядер (проценты) Митотический индекс (промилли) Индекс дегенерирован-ных ядер (промилли)
ЭКЗОКРИННАЯ ЧАСТЬ
Эпителий концевых отделов
1 0,26±0,04** 0 0
3 0,49±0,02**** 1,74±0,23 4,78±0,58
5 1,67±0,05**** 2,70±0,29 2,12±0,12
7 1,61±0,11**** 5,50±0,53 0
20 0,73±0,21* 2,34±0,20 0
30 0,21±0,02*** 0 0
60 0,10±0,01 0 0
Эпителиальные трубки
3 7,63±0,13**** 16,30±0,38 5,40±0,46
5 3,40±0,11**** 6,61±0,24 4,02±0,21
7 4,16±0,21**** 5,45±0,26 8,86±0,28
10 5,06±0,10**** 13,90±0,82 6,62±0,60
20 4,58±0,23**** 9,05±0,64 8,35±0,85
30 3,29±0,30**** 6,35±0,80 4,16±0,26
60 2,24±0,24**** 0 0
Эпителий вставочных отделов протоков и центроацинарные клетки
1 0,90±0,01 0 0
3 9,52±0,18**** 7,90±0,70 4,50±0,15
5 1,23±0,06 3,95±1,99 0
7 1,29±0,10* 3,22±1,76 0
Эпителий внутри- и междольковых протоков
1 3,00±0,34**** 0 0
3 5,38±0,37**** 5,92±0,50 ЕД
5 1,80±0,13**** 0 0
7 2,30±0,18 0 0
ЭНДОКРИННАЯ ЧАСТЬ
1 0,30±0,02 0 0
3 1,08±0,23** ЕД 0
5 1,07±0,20 0 0
7 1,40±0,14**** 0 0
10 1,05±0,07**** 0 0
20 0,40±0,05 0 0
30 0,24±0,03 0 0
60 0,29±0,05 0 0
Примечание. Уровни значимости полученных от контроля отличий обозначены: * — Р < 0,05; ** — Р < 0,025; *** — Р < 0,010; **** — Р < 0,001. ЕД — единичны.
Таблица 5. Пролиферативная активность отдаленной от регенерата части поджелудочной железы крыс (среднее значение ± стандартная ошибка)
Срок после частичной панкреатэктомии (сутки) Индекс меченых ядер (проценты) Митотический индекс (промилли) Индекс дегенерирован-ных ядер (промилли)
1 2 3 4
ЭКЗОКРИННАЯ ЧАСТЬ
Эпителий пограничных регенерату ацинусов
1 0,69±0,01**** 0 ЕД
7 0,63±0,03***** ЕД 0
10 0,86±0,14**** 0 0
30 0,30±0,05*** 0 0
Эпителий околоостровковых ацинусов
3 0,55±0,08**** ЕД 0
5 1,42±0,17***** ЕД ЕД
7 1,28±0,25** ЕД ЕД
10 0,34±0,03***** 0 0
30 0,20±0,03 0 0
60 0,22±0,09 ЕД 0
Эпителий ацинусов, удаленных от островков
3 0,28±0,05** 0 0
5 1,00±0,08***** ЕД ЕД
7 0,37±0,01***** ЕД ЕД
10 0,16±0,01** 0 0
30 0,12±0,01 0 0
60 0,12±0,01 ЕД 0
Эпителий вставочных отделов протоков и центроацинарные клетки
3 1,94±0,12***** 0 0
5 1,82±0,06***** 0 0
7 1,52±0,17* 0 0
10 1,45±0,16 0 0
20 0,94±0,07 0 0
30 0,88±0,08 0 0
60 1,00±0,08 0 0
Эпителий внутри- и междольковых протоков
3 0,87±0,04 0 0
5 1,20±0,11* 0 0
7 0,72±0,06 0 0
10 0,81±0,03 0 0
20 0,48±0,05**** 0 0
30 0,52±0,07**** 0 0
60 0,83±0,05 0 0
1 2 3 4
ЭНДОКРИННАЯ ЧАСТЬ
Мелкие панкреатические островки
3 1,33±0,17**** 0 0
5 1,06±0,06**** 0 0
7 0,72±0,13 0 0
10 0,70±0,06 0 0
20 1,10±0,24 0 0
30 0,43±0,13 0 0
Средние панкреатические островки
3 0,62±0,10** 0 0
5 0,35±0,23 0 0
7 0,33±0,07 0 0
10 0,18±0,12 0 0
20 0,16±0,10 0 0
30 0,34±0,08 0 0
60 0,42±0,17 0 0
Примечание. Уровни значимости полученных от контроля отличий обозначены: * — Р < 0,05; ** — Р < 0,025; *** — Р < 0,010; **** — Р < 0,005; ***** — Р < 0,001; ЕД — единичны.
Таблица 6. Данные морфометрического изучения эпителиальных клеток отдаленной части поджелудочной железы крыс после частичной панкреатэктомии (среднее значение площади
в мкм2 ± стандартная ошибка)
Срок (сутки) ОТДЕЛ ЖЕЛЕЗЫ
ЭКЗОКРИННАЯ ЧАСТЬ
Околоостровковые ацинусы Ацинусы, удаленные от островков
клетка ядро ядрышко клетка ядро ядрышко
3 122,39±3,15* 20,57±0,53 5,43±0,31* 86,19±2,07 20,14±0,63 4,45±0,12*
10 119,54±3,51* 22,64±0,82 5,51±0,13* 94,28±2,18* 20,06±0,59 4,54±0,18*
30 117,28±2,72* 21,48±0,61 6,15±0,14* 89,53±1,56 20,03±0,45 5,37±0,10*
ЭНДОКРИННАЯ ЧАСТЬ Панкреатические островки ТУ-ТХ классов
А В
клетка ядро клетка ядро
3 47,11±1,09* 17,58±0,65 96,02±1,08 21,48±0,31
10 38,61±0,46* 15,26±0,30* 85,28±1,30* 19,59±0,39*
30 40,49±0,66* 16,46±0,45* 86,85±1,48* 19,92±0,44*
Примечание: звездочкой отмечены значения, достоверно отличные от контроля (Р < 0,050).
Таблица 7. Абсолютные значения площадей (мм2), относительные объемы островковых компонентов (проценты) и В/А клеточные объемные отношения в панкреатических островках различных размеров в группе частично панкреатэктомированных крыс (среднее значение ±
стандартная ошибка)
Классы островков Размерность А В К А+В+К
П-ГУ мм2 13,76±0,88 77,44±1,20 9,28±0,28 100,48±1,20
%% 13,24±0,69 77,507±1,19 9,24±0,28 100,00±1,19
В/А 5,63±0,34
У-ХГ мм2 71,55±2,56 376,27±10,62 63,17±2,44 510,99±11,73
%% 14,00±0,50 73,64±2,08 12,36±0,48 100,00±2,32
В/А 5,26±0,28
ХГГ-ХГУ мм2 297,32±35,49 153,5±137,44 270,33±23,97 2102,97±167,76
%% 14,14±1,68 73,01±6,54 12,85±1,14 100,00±7,98
В/А 5,16±0,47
Примечания: классы островков по Те)ш^ (1947). А — А-клетки; В — В-клетки; К — структуры иные, чем А- и В-клетки (капилляры и соединительная ткань).
После резекции в «области резекции» развивается местный типовой патологический процесс — воспаление: некроз, дистрофия, гиперемия, отек, лейкоцитарная инфильтрация типичны для ранних сроков наблюдения (1-3 сут). В пограничной месту резекции области в клетках концевых отделов исчезают гранулы зимогена, расширяются просветы ацинусов, уплощается эпителий (рис. 3, 4). Резко уменьшается реакция на РНК и белки (рис. 5). В это же время пролиферация эпителия выводных протоков, концевых отделов (рис. 6) и клеток соединительной ткани возрастает. Анализ ультаструктурных изменений в клетках формирующихся эпителиальных трубок (рис. 7-9) свидетельствует о потере клетками гранул зимогена, элементов гранулярной цитоплазматической сети (ГЦС) (столь характерных для ультраструктурной организации ацинарных панкреацитов), уменьшении величины митохондрий, относительном нарастании количества свободных рибосом и полисом, диффузно располагающихся по всей цитоплазме. Пластинчатый комплекс (ПК) занимает небольшую площадь над ядром. Клетка эпителиальной трубки бедна органоидами. Ядро имеет неправильный контур вследствие большого количества впячиваний, хроматин равномерно распределяется по кариоплазме. Ядерно-плазменное отношение увеличено. ГЦС представлена единичными канальцами и пузырьками. Преобладают свободные рибосомы, организованные в полисомы в форме «розеток», равномерно заполняющие цитоплазму, за исключением субмембранных областей, обращенных к просвету. Митохондрии немногочисленны, небольшого размера с просветленным матриксом и редко расположенными укороченными кри-стами. Контакты с соседними клетками трубок представлены 2оии1ае осс1иёеШе8, 2оии1ае аёЬегеШез, десмосомами — в апикальной части, и контактами типа «замков» («взаимопроникновений») — в базальной.
Рис. 3а. Общий вид последующих рисунков
Рис. 3. Область, соседняя с местом резекции, через 3 суток после частичной панкреат-эктомии.
Концевые отделы экзокринной части. Пространства между аци-нусами заметно расширены. Глута-ральдегид, осмий, эпон 812, толуи-диновый синий. Об. 20Х.
Рис. 4. Область, соседняя с местом резекции, через 3 суток после частичной панкреатэктомии.
Ацинус в процессе дедифференцировки: расширение просвета, уменьшение количества гранул зимогена. Глута-ральдегид, осмий, эпон 812, толуидиновый синий. Об. 60Х.
Рис. 5. Область, соседняя с местом резекции, через 3 суток после частичной панкреатэктомии.
Реакция панкреатического эпителия на «суммарные белки». Слева — экзокринные панкреациты, справа — формирующиеся эпителиальные трубки.
Реакция на «суммарные белки» в эпителии формирующихся трубок резко снижена. Карнуа, парафин, сулема-бромфеноловый синий (СБФ). Об. 20Х.
Рис. 6. Область, соседняя с местом резекции, через 3 суток после частичной панкреатэктомии.
Митоз в клетке формирующейся эпителиальной трубки. Глутаральдегид, осмий, эпон 812, толуидино-вый синий. Об. 60Х.
Рис. 7. Область, соседняя с местом резекции, через 3 суток после опыта.
Формирующаяся эпителиальная трубка, окруженная ацинусами в процессе дедифференцировки. Ув. 2040Х.
Рис. 8. Область, соседняя с местом резекции. 3 суток опыта.
Типичная клетка эпителиальной трубки. Контур ядра заметно изрезан. Хроматин диффузно рассеян по нуклеоплазме. Ядерно-плазменное отношение сдвинуто в сторону ядра. ПК редуцирован. Элементы ГЦС единичны. Свободные рибосомы формируют «розетки». Митохондрии немногочисленны, четко видимы разнообразные типы межклеточных контактов. Ув. 11900Х.
Через 3 суток опыта уровень включения 3Н-тимидина в ядра клеток эпителиальных трубок был максимален: +600% при сравнении со значениями, полученными для вставочных отделов протоков и центроацинарных клеток, и +6800% при сравнении со значениями, полученными для концевых отделов, удаленных от ПО.
Через 3 суток опыта заметно возрастает и уровень включения 3Н-тимидина в ядра клеток ПО, обнаруживаемых в области, соседней с местом повреждения («область резекции»): +280% при сравнении с включением изотопа в ПО животных контрольной группы (Р < 0,025).
Островковые В-клетки представлены «светлыми» клетками (рис. 10), которые и синтезируют (нижняя вставка), и выделяют секрет (верхняя вставка). На периферии островков (рис. 11) и в составе околоостровковых ацинусов встречаются «смешанные» клетки (СК), содержащие в цитоплазме и гранулы зимогена, и эндокринные гранулы.
В дальнейшие сроки наблюдения, через 7-15 суток после частичной резекции, образовавшийся в области резекции регенерат, обладающий высоким уровнем включения 3Н-тимидина и высокой митотической активностью, вступает в следующую стадию своего развития — вторичную дифференцировку. В составе эпителиальных трубок регенерата (рис. 12 А, Б), отдельные клетки которых продолжают пролиферировать, начинается дифференцировка секреторных клеток (рис. 12 В, Г, Д).
Ядра клеток формирующихся концевых отделов активно включают 3Н-тимидин: полученное значение индекса мечения в 14 раз превышало контрольные значения (Р < 0,001). При этом митоти-ческий индекс составлял 5,50±0,5 промилли, тогда как дегенерированные ядра в формирующихся концевых отделах отсутствовали.
Через 5-7 суток опыта в составе отдельных эпителиальных трубок происходит формирование островковых А- и В-клеток (рис. 12 Е, Ж, З, К). Иногда трубки полностью состоят из А-клеток (рис. 12 Е). Отдельные вторично дифференцирующиеся структуры могут иметь в своем составе и зимогенсодержащие, и эндокринные клетки (рис. 12 Д).
Рис. 9. Область, соседняя с местом резекции. 3 суток опыта.
Экзокринные панкреациты в ходе дедифференцировки. Изменение количества и формы гранул зимогена. Уменьшение пространств в цитоплазме, занятых мембранами ГЦС. Увеличено количество свободных рибосом и гладких мембран. ПК редуцирован и представлен немногочисленными расширенными пустыми цистернами. Хорошо видны разные типы межклеточных контактов: zonula occludentes, zonula adherents, десмосомы и контакты типа взаимопроникновений. Ув. 25900Х.
Рис. 10. «Светлая» В-клетка ПО из области, соседней с местом повреждения. 3 суток после частичной панкреат-эктомии. Ув. 10400Х.
На верхней вставке — момент выхода В-гранулы в перикапил-лярное пространство. Апикальная ПМ в этом месте отсутствует. Базальные мембраны разрыхлены. Ув. 82100Х. На нижней вставке — рибосомы на поверхности электронно плотного материала внутри цистерны ГЦС. Ув. 52300Х.
Рис. 11. Участок околоядерной цитоплазмы «смешанной» клетки на периферии ПО из области, соседней с местом повреждения. 3 суток после частичной панкреатэктомии.
Хорошо видны: гранула зимогена, «светлые» и типичные В-гранулы. Околоядерное пространство слегка расширено. Ув. 39160Х.
Рис. 12. Общий вид.
А — эпителиальная трубка регенерата. Об. 60Х; Б — митоз в клетке эпителиальной трубки. Об. 60Х; В — вторично дифференцирующийся концевой отдел: в клетках эпителиальных трубок появляются немногочисленные гранулы зимогена. Об. 60Х; Г — вторично дифференцированный концевой отдел. Апикальные части клеток содержат зимоген. Капилляры расширены, заполнены эритроцитами. Об. 60Х; Д — экзо- и эндокринные клетки в составе вторично дифференцированного концевого отела. Об. 60Х; Е — эпителиальная трубка, состоящая из А-клеток. Об. 60Х; Ж — В-клетки и эпителиальная трубка. Об. 60Х; З — мелкий островок из А- и В-клеток на месте бывшей эпителиальной трубки. Об. 20Х; И — единичные гранулы зимогена в цитоплазме островковых клеток. Об. 60Х; К — «отдаленная» часть ПЖ. В-клетки в составе концевого отдела. Об. 70Х; Техника: А, В, Г, Д, И — глутаральдегид, осмий, эпон 812, толуидиновый синий. Б, И, Ж, З — глутаральдегид, парафин, PAF и трехцветная смесь Гомори.
В цитоплазме клеток формирующихся ПО регенерата нередко видны гранулы зимогена (рис. 12 И).
Более крупные встречающиеся в регенерате ПО содержат все островковые ци-тотипы, однако генез их не ясен; являются ли они вновь образованными или представляют собою сохранившиеся в области, соседней с местом повреждения, ПО. ПО регенерата через 7 суток опыта имеют заметно расширенные капилляры с широкими перикапиллярными пространствами (рис. 13 а, б). Среди секреторных В-гранул часто встречаются светлые гранулы. Мелкие митохондрии могут образовывать небольшие скопления в капиллярном отделе цитоплазмы. ПК в В-клетках редуцирован. Плазматическая мембрана (ПМ) прикапиллярной цитоплазмы может местами отсутствовать, и тогда органоиды располагаются непосредственно под базальной мембраной.
Рис. 13 а. Участок ПО из области регенерата через 7 суток после частичной панкреат-эктомии.
Капилляры и перикапиллярные пространства заметно расширены. Ув. 3160Х.
Рис. 13 б. Прикапиллярная цитоплазма В-клетки и перикапиллярное пространство.
Плазматическая мембрана В-клетки на значительном протяжении отсутствует. Базальные мембраны клетки и капилляра разрыхлены. Фе-нестры капилляра закрыты. Ув. 66600Х.
В составе островков встречаются и «смешанные» клетки (рис. 14). Между соседними «смешанными» клетками (СК) не всегда четко видны клеточные мембраны, а потому они представляются как многоядерные. Клетка имеет ядра неправильной формы с периферическим скоплением хроматина и четко видимыми ядрышками. Характерны для таких клеток особенности ультраструктурной организации: свой-
ственная экзокринным панкреацитам в областях, содержащих гранулы зимогена, и свойственная эндокриноцитам ПО в областях, содержащих эндокринные секреторные гранулы (сг). Среди эндокринных сг по ультраструктурным признакам можно различить и А-, и В-, и D-гранулы, а также — светлые гранулы (содержат про-инсулин).
Ядра клеток ПО через 7 суток опыта активно включают 3Н-тимидин (+400%, Р < 0,001).
К 15-30 суткам опыта в «области резекции» имеется регенерат, представленный сформированными концевыми отделами, эпителиальными трубками и плотной соединительной тканью. Уровень включения 3Н-тимидина в ядра клеток вновь сформированных концевых отделов снижается, хотя и остается на уровне, достоверно превышающем контрольные значения (+560%, Р < 0,025).
Рис. 14. «Смешанная» В-, А-ацинарная клетка на периферии ПО из области регенерата через 7 суток после частичной панкреатэктомии.
Хорошо видны области цитоплазмы, характерные для экзокринных панкреацитов и для эндокриноцитов. Ув. 25200Х. На вставке — секреторные эндокринные гранулы в цитоплазме СК: А-гранулы, В-гранулы и светлые гранулы. Ув. 58850Х.
Вторично дифференцированные ацинусы (рис. 15) содержат «темные» и «светлые» панкреациты, в которых ядерно-плазменные отношения сдвинуты в сторону цитоплазмы. Ядро с хорошо выраженным ядрышком имеет по-преимуществу овальную форму. ГЦС в светлых клетках расширена при сравнении с ГЦС в темных панкреацитах. Гранулы зимогена имеют обычную форму и различные размеры (от мелких до крупных) и располагаются по преимуществу в апикальной части панкреа-цита. ПК представлен параллельными цистернами, вакуолями и пузырьками. В зоне ПК располагаются шероховатые вакуоли с нежно волокнистым содержимым и митохондрии.
Рис. 15. Вторично дифференцированный концевой отдел в регенерате через 20 суток после частичной пан-креатэктомии.
Хорошо видны «темные» и «светлые» панкреациты. Ув. 4600Х. На вставке — апикальная часть вторично дифференцированного ацинуса. Гранулы зимогена различных размеров. Митохондрии — типичные для экзокринных панкреацитов. Ув. 21150Х.
К концу срока наблюдения регенерат представляет собой скопление кисто-образно расширенных эпителиальных трубок, охваченных соединительной тканью, среди которых встречаются участки островковой ткани.
Через 60 суток опыта ядра клеток эпителиальных трубок по-прежнему включают 3Н-тимидин достоверно интенсивнее, чем в контроле (+110%, Р < 0,001). При этом митозов и дегенерированных ядер отметить не удается.
Отдаленная часть. Средний вес головки и тела ПЖ подопытных животных через 30 суток опыта составил 333,0±17,1 мг против 370,0±14,1 мг в группе контрольных животных. Эти цифры достоверно не различались (Р > 0,05).
Экзокринная часть. Данные, полученные при изучении включения 3Н-тимидина в эпителиальные структуры отдаленной от места резекции части ПЖ, представлены в таблице 5, а характер изменения индексов мечения на протяжении опыта отражен на рисунке 2.
Через 3 суток после частичной панкреатэктомии ядра клеток концевых отделов, прилежащих к регенерату, включали 3Н-тимидин заметно интенсивнее, чем в контроле (включение изотопа в ядра клеток околоостровковых ацинусов у животных контрольной группы): +220% (Р < 0,005). Возросло включение 3Н-тимидина и в ядра клеток ацинусов, удаленных от ПО: +150% (Р < 0,025).
Данные морфометрического изучения эпителиальных структур отдаленной части представлены в таблицах 6 и 7. Через 3 суток опыта достоверно возросла средняя площадь клетки и ядрышек околоостровковых ацинусов (+17% и +28% соответственно) и на 25,4% — средняя площадь ядрышек в концевых отделах, удаленных от ПО.
Через 5 суток опыта уровни включения 3Н-тимидина в ядра клеток околоостров-ковых ацинусов возрастали в еще большей степени, чем через 3 суток: полученные значения на 740% (Р < 0,001) превышали контрольные. Сходно с околоостровковыми ацинусами возрастало включение 3Н-тимидина в ядра клеток ацинусов, удаленных от островков: +800% (Р < 0,001). Активнее, чем в контроле, включали 3Н-тимидин ядра клеток эпителия протоков : +73% (Р < 0,001) — во вставочных отделах протоков и центроацинарных клетках и +40% (Р < 0,050) — во внутри- и междольковых протоках.
Через 7-10 суток опыта ядра клеток околоостровковых ацинусов включали 3Н-тимидин достоверно интенсивнее, чем в контроле (Р < 0,025). Через 10 суток опыта интенсивнее, чем в контроле, включали 3Н-тимидин и ядра клеток ацинусов, удаленных от ПО: +45% (Р < 0,025). По-прежнему интенсивнее, чем в контроле, включали 3Н-тимидин и ядра клеток панкреацитов, прилежащих к регенерату: +470% и +680% для 7 и 10 суток соответственно.
Через 20 суток опыта экзокринные панкреациты отдаленной части (рис. 16) представлены в значительной степени светлыми клетками, содержащими гранулы зимогена различных размеров, хорошо развитую ГЦС и большое количество свободных рибосом в цитоплазме. Пластинчатый комплекс (ПК) представлен параллельными мембранами, вакуолями и пузырьками. Цистерны ПК содержат нежный осмиофильный материал. Все выявленные изменения и описанные особенности свидетельствуют об активации синтетической деятельности в экзокринных панкре-ацитах.
И через 30 суток опыта ядра клеток ацинусов, пограничных регенерату, по-прежнему включают 3Н-тимидин активнее, чем в контроле: +170% (Р < 0,010).
Эндокринная часть. Через 3 суток опыта уровни включения 3Н-тимидина в ядра клеток мелких ПО были выше контрольных на 180% (Р < 0,005), а в ядра клеток средних размерных классов (основная масса ПО) — на 190% (Р < 0,025). Через 5 суток опыта ядра клеток мелких ПО имели индекс мечения, на 125% превышающий контрольные значения (Р < 0,005).
Рис. 16. Светлые и темные экзокринные панкреа-циты в ацинусах отдаленной части ПЖ через 20 суток после частичной панкреатэктомии. Ув. 2700Х.
На вставке — ПК в светлой клетке. Цистерны ПК заполнены нежным осмиофильным содержимым. Гранулы зимогена разных размеров и разной плотности. Ув. 42200Х.
Начиная с 7 суток опыта и до конца срока наблюдения уровни включения 3Н-тимидина в ядра клеток ПО отдаленной части не отличались от контрольных значений.
Общий вид на периферию ПО и околоостровковые ацинусы через 7 суток опыта можно увидеть на рисунках 17 и 17а и рисунке 18. Островковые В-клетки представлены, в основном, светлыми клетками, чьи мембраны ГЦС заметно расширены. На периферии ПО располагается группа «смешанных» клеток (СК). Клеточные мембраны между этими клетками не определяются. Структура представляет собою многоядерный симпласт, цитоплазма которого имеет выраженную зональность: там, где располагаются гранулы зимогена, ультраструктурная организация соответствует структурной организации экзокринных панкреацитов; там, где располагаются эндокринные гранулы, ультраструктурная организация соответствует структурной организации эндокриноцитов. К прикапиллярной цитоплазме в большом количестве примыкают нервные окончания (стрелки на рис. 17а). Заметные регионы ПО зани-
мают капилляры и перикапиллярные пространства. На рисунке 18 хорошо видны светлые В-клетки, составляющие основную массу островковых клеток. То, что эти клетки «светлые», обусловлено расширением мембран ГЦС и сниженным содержанием типичных В-гранул, имеющих плотную сердцевину и широкое «гало».
Рис. 17. Периферия ПО и околоостровковые ацинусы в отдаленной части ПЖ через 7 суток после частичной панкреатэктомии.
Основная масса В-клеток ПО — светлые В-клетки. В верхней части электронограммы — участок ПО, занятый СК. Заметные области ПО заняты капиллярами и перикапиллярными пространствами. Ув. 2200Х.
Рис. 17а. Деталь рис. 17. «Смешанные» клетки на периферии ПО.
Клеточные мембраны не определяются. Структура представляет собою многоядерный симпласт, цитоплазма которого имеет выраженную зональность: там, где располагаются гранулы зимогена, ультраструктурная организация соответствует структурной организации экзокринных панкреацитов. Там, где располагаются эндокринные гранулы, ультраструктурная организация соответствует структурной организации эндокриноци-тов. К прикапиллярной цитоплазме примыкают нервные окончания (стрелки). Ув. 5700Х. На вставке — секреторные гранулы смешанной В-, Б-ацинарной клетки. Ув. 30800Х.
Рис. 18. Периферическая часть ПО через 7 суток опыта.
«Светлые» В-клетки с расширенными мембранами ГЦС и участки цитоплазмы D-клеток. Ув. 5700Х. На верхней вставке — секреторные гранулы D-клетки. Ув. 79200Х. На нижней вставке — секреторная гранула В-клетки с сердцевиной кристаллоидной формы. Ув. 79200Х.
Рис. 19. А-, В- и Б-клетки в ПО «отдаленной» части через 20 суток после частичной панкреа-тэктомии. Ув. 5070Х.
На верхней вставке — ПК А-клетки. Характерные А- и «светлые» гранулы, типичные митохондрии в околоядерной цитоплазме. Ув. 23600Х. На нижней вставке — секреторные гранулы Б-клетки. Ув. 53800Х.
Через 20 суток опыта ПО удаленной части содержат как эндокринные А-, В-и Б-клетки, так и «смешанные» А-, В- и В-, А-ацинарные клетки (рис. 19, 20). Смешанные клетки на периферии островков зачастую не обнаруживают межклеточных мембран и представляются многоядерным симпластом (рис. 20). При этом заметно возрастают картины микроапокринового типа секреции эндокринных гранул, при котором секреторная гранула целиком выделяется в перикапиллярное пространство.
Рис. 20. «Смешанные» А-, В-ацинарные клетки на периферии ПО «отдаленной» части через 20 суток после частичной панкреатэктомии.
Цитоплазма клеток содержит как эндокринные А-и В-гранулы, так и гранулы зимогена. Базальные мембраны и клетки, и капилляра разрыхлены. Клеточная мембрана на стороне, обращенной к капилляру (внизу слева), отсутствует; и А-, и В-секреторные гранулы свободно располагаются в перикапиллярном пространстве (микроапокриновый тип секреции). Ув. 11200Х.
Заключая изложенное, следует отметить, что в ответ на частичную резекцию селезеночного отдела поджелудочной железы репаративные процессы в поджелудочной железе у подопытных животных развиваются во всех ее отделах: как в месте резекции, так и вдали от нее. Общий характер ответа на повреждение на месте резекции в целом сходен с описанным ранее рядом авторов [5, 20].
На основании анализа включения 3Н-тимидина, митотического коэффициента и индекса дегенерированных ядер следует прийти к заключению, что эпителий протоков, наряду с эпителием концевых отделов, вносит весьма заметный вклад в формирование эпителиальных трубок, часть которых вторично дифференцируется в типичные концевые отделы и типичные островковые клетки.
В отдаленной от места резекции части ПЖ в ранние сроки после повреждения имеет место возрастание числа ДНК-синтезирующих клеток и в экзокринном, и в эндокринном эпителии.
Ультраструктурные характеристики экзокринного и эндокринного эпителия свидетельствуют об усилении синтетических процессов в эпителиальных структурах ПЖ.
Возрастание общего объема островковой ткани у экспериментальных животных к 30 суткам опыта свидетельствует в пользу компенсации утраченной при резекции эндокринной компоненты панкреатического эпителия. При этом компенсация связана не только с возрастанием пролиферативной активности островковых клеток в ранние сроки после резекции, но в значительной степени происходит за счет процесса ацино-инсулярной трансформации, о чем свидетельствуют многочисленные находки «смешанных» клеток на периферии ПО и в околоостровковых ацинусах.
Литература
1. Keith Al-Hasani, Anja Pfeifer, Monica Courtney et al. Adult Duct-Lining Cells Can Reprogram into p-like Cells Able to Counter Repeated Cycles of Toxin-Induced Diabetes // Developmental Cell. June. 2013.Vol. 26, Issue 1. P. 86-100.
2. Courtney M., Pfeifer A., Al-Hasani K. et al. In vivo conversion of adult a-cells into p-like cells: a new research avenue in the context of type 1 diabetes // Diabetes Obesity and Metabolism. 2011/10. Vol. 13. Suppl 1. Р. 47-52.
3. Collombat P., Xu X., Heimberg H., Mansouri A. Pancreatic beta-cells: from generation to regeneration // Seminars in Cell and Developmental Biology 2010/10; Vol. 21(8). Р. 838-844.
4. Ben-Othman N., Courtney M., Vieira A. et al. From pancreatic islet formation to beta cell regeneration // Diabetes Research and Clinical Practice . 2013/02 (article in press).
5. Герловин Е. Ш. Некоторые закономерности дифференцировки секреторных клеток поджелудочной железы позвоночных в процессе гистогенеза, регенерации и трансплантации // Развитие, регенерация и трансплантация пищеварительных желез. Л., 1972. С. 5-28.
6. Пузырев А. А. Влияние мужских половых гормонов на регенерацию поджелудочной железы: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Л., 1971. 20 с.
7. Шапкина А. В. Регенерация поджелудочной железы белой крысы в различные возрастные периоды: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Л., 1969. 21 с.
8. Рейсканен А. В. Ультраструктурный анализ реактивных изменений экзокринного эпителия поджелудочной железы некоторых позвоночных при регенерации и трансплантации: автореф. дис. . канд. мед. наук. Л., 1973. 25 с.
9a. Утехин В. И. Строение и реактивность поджелудочной железы при нарушении баланса гормонов щитовидной железы: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1978. 23 с.
9б. Утехин В. И. Некоторые данные морфометрии регенерирующей поджелудочной железы крысы при нарушении баланса гормонов щитовидной железы // Факторы внешней среды и человек. Л.: ЛСГМИ, 1977. С. 71-72.
9в. Утехин В. И. Ультраструктурная характеристика «светлых» и «темных» В-клеток в панкреатических островках крыс // Цитология. 1979. Т. XXI, №1. С. 21-24.
10. Gomori G. One-step trichrome stain // Am. J. Clin. Pathol. 1950a. Vol. 20, N 7. P. 661-664.
11. Макаров П. В. Цитохимия нуклеиновых кислот. Л., 1959. 350 с.
12. Gomori G. Aldehyde-fuchsun: a new stain for elastic tissue // Am. J. Clin. Pathol. 1950b. Vol. 20, N 7. Р. 665.
13. Gomori G. Observations with differential stains on human islets of Langerhans // Am. J. Path. 1941. Vol. 17. Р. 395-398.
14a. Hellman B. The total volume of the pancreatic islet tissue at different ages of the rat // Acta Pathol. et Microbiol. Scand. 1959. Vol. 47, N 1. Р. 35-50.
14b. Hellman B. The volumetric distribution of the pancreatic islet tissue in young and old rats // Acta Endocrinol. (Kbh.) 1959b. Vol. 31. Р. 91-106.
14c. Hellman B. A method for rapid estimation of the islet volume in the rat pancreas based on counting instead of measuring the islet section surfaces // Acta Pathol. et Microbiol. Scand. 1959. Vol. 47, N 1. Р. 21-33.
15. Tejning S. Dietary factors and quantitative morphology ofthe islets of Langerhans // Acta med. Scand. 1947. Vol. 128, suppl. 198.
16. Chalkley H. Method for Quantitative Morphologic Analysis of Tissues // J. Nat. Cancer Inst. 1943. Vol. 4. Р. 47-53.
17. Катинас Г. С. Определение стандартной ошибки среднего при пуассоновском типе распределения признака в пределах организма и нормальном — в популяции // Архив анат. 1972. Т. 62, № 4. С. 101-105.
18. Снедекор Д. У. Статистические методы в применении к исследованиям в сельском хозяйстве и биологии. М.: Сельхозиздат, 1961. 503 с.
19. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1975. 325 с.
20. Герловин Е. Ш. Гистогенез и дифференцировка пищеварительных желез. М.: Медицина, 1978. 263 с.
Статья поступила в редакцию 15 августа 2013 г.
