CC BY
150УДК 615.282
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ МИШЕНИ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВОГРИБКОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ПРАКТИКА СОЗДАНИЯ НОВЫХ АНТИМИКОТИКОВ (ОБЗОР)
1,2 Еремина Н.В. (руководитель проекта)*, 2Дурнев А.Д. (директор института), 3 Васильева
H.В. (директор института, зав. кафедрой), 3 Богомолова Т.С. (зав. лаб.)
1 ООО «Панацела Лабс», Москва; 2 НИИ фармакологии имени В.В. Закусова, Москва; 3 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2018
Существует большая потребность в новых противогрибковых лекарственных средствах с уникальными селективными механизмами действия, что обусловлено, с одной стороны, ростом заболеваемости инвазивными и поверхностными микозами, с другой - ограничениями в использовании имеющихся в клинической практике антимикотиков.
Настоящий обзор посвящен описанию известных и открытых в последнее время фармакологических мишеней возбудителей грибковых инфекций, которые могут быть использованы для создания противогрибковых препаратов. Также описаны основные принципы успешной доклинической разработки антимикотиков.
Ключевые слова: противогрибковые соединения, противогрибковые мишени, разработка антимикотиков, доклинические исследования
PHARMACOLOGICAL TARGETS OF THE ANTIFUNGAL DRUG COMPOUNDS ACTION AND PRACTICE OF THE NEW ANTIFUNGALS CREATION (REVIEW)
I,2 Eremina N.V. (project manager), 2 Durnev A.D. (director of the institute), 3 Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), 3 Bogomolova T.S. (head of the laboratory)
1 Panacela Labs LLC, Moscow; 2 V.V. Zakusov Institute of Pharmacology, Moscow; 3 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2018
There is a great need for new antifungal medicines with unique selective mechanisms of action, which is due, on the one hand, with the increase of the invasive and superficial mycoses incidence, on the other - with limits in the use of the antifungals in clinical practice.
The present review is devoted to the description in recent years of known and discovered pharmacological targets of fungal infections pathogens, which can be used for creation of antifungal drugs. The basic principles of successful preclinical development of antifungals are also described.
Key words: antifungal compounds, antifungal targets, development of antifungals, preclinical studies
Контактное лицо: Еремина Наталья Вахитовна, e-mail: neremina@panacelalabs.com
ВВЕДЕНИЕ
Заболевания, обусловленные микроскопическими грибами (микозы), являются актуальной медицинской проблемой, их число прогрессивно растет в связи с увеличением количества иммунокомпрометирован-ных больных, расширением терапии иммуносупрес-сорами и распространением ВИЧ-инфекции. По оценкам экспертов Фонда глобальных действий по борьбе с микозами, ежегодно в мире заболевают инвазивным аспергиллезом более 200 тысяч человек (летальность - 30-95%), инвазивным кандидозом - более 400 тысяч (летальность - 46-75%), криптококкозом - более 1 млн. (летальность - 20-70%), мукормикозом - более 10 тысяч (летальность - 30-90%), пневмоцистозом -более 400 тысяч (летальность - 20-80%) [1-3].
В последние десятилетия отмечают рост резистентности к антимикотическим препаратам среди возбудителей микозов, включая Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp. [4]. Особую тревогу вызывает появление мультирезистентных (резистентных к двум и более классам антифунгальных препаратов) штаммов микромицетов (Candida auris, C. glabrata и др.). При исследовании 1380 штаммов C. glabrata, проведенном в США в период 2008-2013 гг., установлено, что 50% азоло-резистентных штаммов были резистентными и к каспофунгину [5]. Мультирезистентность к азолам и эхинокандинам или к азолам и амфотерицину В проявляют 41% изолятов C. auris [6].
Арсенал противогрибковых препаратов крайне ограничен, что особенно примечательно в сравнении с количеством средств для лечения бактериальных и вирусных инфекций [7, 8]. В настоящее время доступны антимикотики шести основных химических групп: полиены, азолы, эхинокандины, фторпиримидины, алли-ламины и гризаны, из которых только четыре первых используют в терапии инвазивных микозов [9-11]. Отметим, что азолы и полиены были включены в медицинскую практику достаточно давно (до 1980-х годов), а для открытия и внедрения нового класса противогрибковых препаратов - эхинокандинов потребовалось почти 30 лет [12, 13].
Применение вышеперечисленных препаратов часто не позволяет обеспечивать благоприятный клинический исход течения микозов. В связи с этим существует необходимость поиска ранее неизвестных мишеней и разработки новых классов противогрибковых лекарственных средств с новыми уникальными механизмами направленного селективного действия.
Цель обзора - рассмотрение наиболее перспективных изучаемых в настоящее время фармакологических мишеней для разработки новых групп антимикотиков, а также описание стратегии разработки новых противогрибковых препаратов.
Фармакологические мишени действия антимикотиков.
Патогенные грибы представляют особую проблему в свете разработки противоинфекционной терапии, так как, во-первых, несмотря на различие в строении клеточной мембраны и наличие клеточной стенки в силу своей эукариотической природы, они имеют тесную эволюционную связь с человеком-хозяином во многих метаболических клеточных процессах, сводя к минимуму число лекарственных препаратов, которые могут быть использованы для селективного унич-
тожения патогенов [14, 15]. Примечательно, что три наиболее широко применяющихся класса системных антимикотиков (полиены, азолы, эхинокандины) реализуют механизм действия через взаимодействие с уникальными для грибов мишенями. Во-вторых, недостаточно хорошо исследованы пространственные структуры мишеней антимикотиков, что ограничивает рациональный дизайн молекул-кандидатов и снижает темпы разработки новых противогрибковых соединений [13, 16].
Согласно современным представлениям, противогрибковые фармакологические мишени классифицируют на 4 типа [13, 17-20]:
- мишени клеточной стенки гриба;
- мишени клеточной мембраны гриба;
- мишени, участвующие в синтезе ДНК и белков;
- мишени сигнальной трансдукции (табл. 1).
Мишени клеточной стенки гриба.
Клеточная стенка гриба состоит из 6-1,3-глюкана, 6-1,6-глюкана, хитина и маннопротеинов. Влияние на биосинтез этих компонентов широко исследуют с целью поиска новых потенциальных антимикотиков.
6-глюканы являются необходимым компонентом клеточной стенки гриба, нарушение его синтеза приводит к невозможности построения новых клеток. Новые ингибиторы 6-1,3-Б-глюкан синтазы разрабатывают на основе класса соединений, получаемых из природных источников - терпеноидов (еп^шайд^т, ascosteroside, агишМи^т, е^окошп А) и гликоли-пидов, выделенных из культуры Coryneum modonium (papulacandin, согупеса^т) [21]. Однако, поскольку пространственная структура и механизм ингибиро-вания остаются неизвестными, рациональный дизайн молекул представляет определенные сложности, оставляя исследователям только высокопроизводительный скрининг химических библиотек соединений [7, 22, 23]. Мишень для поиска ингибиторов синтеза 6-1,6-глюкана (пиридобензимидазолов) была выявлена с помощью скрининга штаммов Saccharomyces cerevisiae с УФ-индуцированой мутацией в гене KRE6, участвующем в синтезе данного глюкана [24].
Гликозилфосфатидилинозитол (ОР1)-модифици-рован ные белки необходимы для построения клеточной стенки и надлежащего мембранного гомеостаза грибов, кроме того, они являются адгезинами, обеспечивающими вирулентность патогена посредством связывания со слизистыми или эпителиальными поверхностями перед образованием колонии и репликацией [25]. Способность ингибировать биосинтез ОР1 посредством взаимодействия с ацилтрансферазой ОздИ обнаружено для 1-[4-бутилбензил]изохинолона и фе-ноксиацетанилида и их аналогов [26].
Хитин представляет собой 6-(1^4)-полимер
Некоторые мишени действия
N-ацетилглюкозамина - важнейший компонент клеточной стенки гриба. Полиоксины и никкомицины являются классическими примерами ингибиторов хитинсинтазы, участвующей в биосинтезе хитина, однако их клиническая разработка была остановлена вследствие ограниченной эффективности, а наиболее перспективные молекулы были взяты за основу для оптимизации и поиска новых пептидил-нуклеозидов с улучшенными фармакологическими свойствами [27]. Предпринимают попытки проведения скрининга библиотек соединений синтетического и природного происхождения, но отмечают, что использование ингибиторов хитинсинтазы в качестве монотерапии пока не представляется возможным вследствие их низкой эффективности in vivo [13]. Установление пространственной структуры мишени в будущем позволит вести более рациональные исследования в этом направлении.
Ещё одной мишенью данной локализации являются ферменты, катализирующие расщепление гликозид-ных связей в а-маннозидных гликанах и гликоконью-гатах, - а-маннозидазы и а-манноназы, участвующие в процессах формирования гликопротеинов и сборки клеточной стенки грибов [28, 29].
Мишени клеточной мембраны гриба. Непосредственное связывание с эргостерином, лежащее в основе фунгицидного механизма действия макролидных антибиотиков - полиенов (амфотери-цина В, нистатина и натамицина), приводит к нарушению целостности мембраны, в частности, к нарушению работы мембранных АТФаз [30], в результате чего клетка гибнет. В настоящее время разрабатывают новый антибиотик SPK-843, действующий по описанному механизму, который показывает более высокую, по сравнению с существующими полиенами, противогрибковую активность in vitro [31].
Фермент 14а-деметилаза контролирует превращение ланостерина в 4,14-диметилэргостатриенол на одной из стадий биосинтеза эргостерола - важнейшего компонента клеточной мембраны грибов, обеспечивающего барьерную функцию и деятельность ассоциированных с мембраной ферментов [13]. Осуществляют попытки создания новых ингибиторов CYP51, для чего исследуют его пространственную структуру из различных микромицетов и рационально оптимизируют существующие азолы с помощью фармакофорных моделей in silico [32], некоторые из которых проходят клинические испытания [33]. Помимо этого, проводят направленный поиск и исследования зависимости структуры от активности ряда неазольных соединений - ингибиторов CYP51, которые позволили бы избежать возникновения кросс-резистентности [34, 35]. Сквален монооксигеназа представляет собой фер-
Таблица 1.
противогрибковых препаратов
Клеточная стенка гриба Клеточная мембрана гриба Внутриклеточные процессы
Синтез ДНК и белков Сигнальная трансдукция
- В-1,3-0-глюкан синтаза (эхинокандины)* - В-1,6-глюкан - Гликозилфосфатидил-инозитол (вР1)-связанная ацетилтрансфе-раза Gwt1 - Хитин синтаза - а-Маннозидаза и а-Манноназа - Эргостерин (полиены) - Ланостерол 14а-деметилаза (CYP51), компонент биосинтеза эргостерина (азолы) - Сквален эпоксидаза, компонент биосинтеза эргостерина (аллиламины) - Инозитол-фосфоцерамидсинтаза (IPC) - N-миристоил-трансфераза - Аминоацил-тРНК синтетаза - Фактор элонгации - Секретируемая аспарагиновая про-теиназа - Топоизомераза - Поли(А)полимераза - Компонент коплекса FACT - Кальциневрин - Hsp90 - TOR-киназа -RAS - Транспорт электронов
" в скобкахуказаны группы используемых в клинической практике антимикотиков, действующих в отношении данных мишеней.
мент, который во время биосинтеза эргостерола катализирует превращение сквалена в скваленэпоксидазу, являющуюся прекурсором ланостерола [36]. Ингибиторы данного фермента, помимо существующих в клинике аллиламинов, тиокарбаматов, были обнаружены среди бензиламинов, гомопропаргиламинов, аналогов тербинафина [37], однако в публикациях последних лет информация о дальнейшей разработке данного класса антимикотиков отсутствует.
Специфичная для грибов синтаза инозитол-фос-фоцерамида (IPC) является ключевым ферментом биосинтеза сфинголипидов мембраны [38]. К соединениям, нарушающим синтез сфинголипидов мембраны путем ингибирования IPC, относятся циклический депсипептид ауреобазидин А, макролиды гальбоноли-ды (растмицин) и хафрефунгин [17, 39].
Мишени, вовлеченные в синтез ДНК и белков.
Цитозольный мономерный фермент N-миристоил-трансфераза (NMT) катализирует перенос миристо-иловой группы от миристоил-СоА к N-концевому глицину ряда эукариотических клеточных и вирусных белков и считается перспективной мишенью для разработки противогрибковых препаратов. Недавно открытые ингибиторы NMT из группы бензофуранов и бензотриазолов показали неплохую активность in vitro, однако исследователи отметили необходимость дальнейшей оптимизации молекул [40].
Аминоацил-тРНК синтетаза (AaRS) - необходимый для биосинтеза белка фермент, катализирующий присоединение нужной аминокислоты к соответствующей тРНК в процессе трансляции. Ингибирование данного фермента нарушает внутриклеточный метаболизм аминокислот и замедляет рост клетки. Строение AaRS установлено для многих бактериальных патогенов и всего для нескольких грибковых. Один из селективных ингибиторов AaRS - икофунгипен (производное циклической 6-аминокислоты циспентацина) в настоящее время проходит клинические испытания для лечения инфекций, вызываемых Candida spp. [41, 42].
Селективное ингибирование биосинтеза белка грибов представляет перспективную лекарственную мишень. В частности, фактор элонгации 2 (EF-2) катализирует реакцию транслокации. Несмотря на то, что гомологичность аминокислотной последовательности грибкового и человеческого EF-2 велика (85%), сорда-рин, содержащий тетрациклиновое дитерпеновое ядро и 6-деоксигликозидный остаток, и его производные способны селективно ингибировать грибковый EF-2 посредством стабилизации комплекса рибосома/ЕБ-2. Основные исследования в этой области сосредоточены на создании аналогов сордарина с целью повышения противогрибковой активности, расширении спектра активности и улучшении фармакокинетического профиля путем модификации гликозилового участка, замене гликоцила гетероциклическим заместителем и модификации дитерпенового скелета, сложного для химического синтеза [9].
Секретируемые аспарагиновые протеиназы (SAP) необходимы в процессе питания гриба, а также являются важным фактором вирулентности Candida spp., что обусловливает их привлекательность в качестве мишени для разработки антимикотиков. Ингибиторы SAP были обнаружены среди пептидных структур. Несколько низкомолекулярных пептидомиметиков
на основе 6,8-диокса-3-азабицикло[3,2,1]-октана показали активность in vivo на уровне терапевтической дозы флуконазола, в том числе на резистентных к нему штаммах. Исследования в области рационального поиска ингибиторов SAP продолжают, поскольку структура мишени практически установлена [27].
ДНК-топоизомеразы - класс ферментов, изменяющих топологическую структуру ДНК, являются мишенью многих терапевтических соединений, в том числе противобактериальных (хинолоны) и противораковых. Также было показано, что некоторые патогенные грибы имеют высокие уровни топоизомераз I и II, что обусловливает интерес к генам TOP 1-3, кодирующим топоизомеразы грибков, в качестве мишеней действия антимикотиков [43, 44]. Алкалоид Eupolauridine селективно ингибирует ДНК-релаксирующую активность грибковой топоизомеразы II, не оказывая при этом выраженного цитотоксического действия на клетки млекопитающих [45].
Полиаденозин-полимераза (поли(А)полимераза) -высококонсервативный компонент макромолекуляр-ного комплекса расщепления и полиаденилирования мРНК является мишенью действия парнафунгинов, изоксазолидинон-содержащих соединений, выделенных из Fusarium larvarum. Парнафунгины демонстрируют широкую противогрибковую активность, в том числе в отношении грибов родов Candida и Aspergillus.
Хроматин-реструктурирующий белковый комплекс FACT (Facilitates Chromatin Transcription) участвует в активации транскрипции и репликации хроматина, регулирует транскрипцию генов, контролирующих клеточный рост, и поддерживает стабильность генома у эукариот. Исследователи [46] выявили, что специфичная N-концевая аминокислотная последовательность компонента Pob3/SSRP1 комплекса FACT Aspergillus fumigatus не имеет гомологии ни с одним белком человека и может быть использована в качестве мишени для создания нового класса антимикоти-ков [47].
Мишени сигнальной трансдукции.
Кальциневрин представляет собой гетеродимер-ный белок, участвующий в различных кальций-зависимых регуляторных процессах в эукариотических клетках. Наряду с его модулятором, белком теплового шока Hsp90 и TOR-киназой, его центральная роль в регуляции роста клеток и реакции на стресс у грибов вызвали интерес к применению их ингибиторов, рапамицина (TOR), такролимуса и циклоспорина А (кальциневрин) и гелданамицина (Hsp90) в качестве противогрибковых препаратов [48-50]. На основе вышеупомянутых соединений разрабатывают новые аналоги с меньшей иммуносупрессивной активностью, которые в настоящее время проходят доклинические и клинические испытания [44, 51].
RAS-опосредованные мембранные сигнальные пути играют ключевую роль в регуляции клеточного ответа с помощью широкого спектра эффекторных белков и являются критическими факторами для роста и вирулентности патогенных грибов. Для правильной активации RAS-белки должны пройти ряд посттрансляционных модификаций, которые включают фарнезилирование, протеолитическое расщепление концевых аминокислот, карбоксиметилирование и пальмитоилирование. Ингибиторы данного сигналь-
ного пути RAS разрабатывают в качестве антимикоти-ков, в частности, в отношении Aspergillus [52].
Митохондрии грибка также признаны привлекательной мишенью противогрибковой терапии. Арила-мидиновое производное T-2307 способно селективно нарушать функцию митохондрий дрожжевых грибков, что приводит к потере мембранного потенциала и обусловливает широкий спектр противогрибковой активности [53].
Таким образом, спектр мишеней для действия антимикотиков и арсенал потенциальных противогрибковых средств постоянно пополняются [20, 54]. Для поиска новых мишеней применяют генетические и геномные технологии поиска мишеней, такие как полногеномный транскриптомный анализ (исследование экспрессии генов с использованием ДНК-микроматрицы) и протеомный анализ (изучение экспрессии белков с применением двумерного гель-электрофореза), серийные анализы экспрессии генов (SAGE), РНК-опосредованные нокаутные методы, позволяющие ингибировать гены на посттранскрипционном уровне, методы инсерционного мутагенеза [18, 55-57]. Значительные успехи достигнуты в геномике грибов - несколько сотен геномов микромицетов, в том числе A. fumigatus, C. albicans и T. rubrum, секвенировано полностью, и работы в этом направлении продолжаются [58-60]. Данная информация позволяет выявить уникальные функциональные белки и гены, необходимые для роста грибков-патогенов, разработки и валидации их в качестве мишеней с последующим скринингом библиотек потенциальных антимикотиков [44, 61, 62]. Основной проблемой данных разработок является отсутствие или недостаточность информации о пространственной структуре мишеней, что ограничивает возможности рационального дизайна молекул антимикотиков методами in silico, такими как молекулярный докинг, фармакофорное моделирование, виртуальный скрининг и направленный дизайн библиотек соединений.
Однако разработки фармакологических препаратов для реализации упомянутых механизмов противогрибкового действия, в основном, находятся на ранних этапах научно-исследовательских или доклинических разработок. В регистре clinicaltrials.gov представлены лишь несколько текущих клинических исследований начальных фаз инновационных антимикотиков с новым механизмом действия [25, 63, 64].
Практика создания новых противогрибковых препаратов.
Общая схема разработки нового лекарственного препарата представлена на рисунке [65].
Рис. 1. Общая схема разработки нового лекарственного препарата (на основании источников [68-71]).
В самом лучшем случае, проходит 8-10 лет с момента открытия соединения-кандидата до его одобрения регуляторными органами для использования в широкой клинической практике.
Первый этап заключается в поиске лекарственной мишени, установлении её структуры, разработке и валидации методов, которые впоследствии будут использованы для проверки фармакологической активности соединений [66]. На данном этапе также составляют библиотеку потенциально активных веществ, созданных либо с помощью направленного рационального дизайна с использованием пространственной структуры мишени, либо в результате оптимизации уже известного противогрибкового соединения, структуру которого используют в качестве «обучающей выборки». При этом для веществ, показавших на первом этапе высокопроизводительного скрининга фармакологическую активность выше выбранного порогового значения, далее чаще всего оценивают сразу несколько параметров в ходе фармакологических (метаболическая стабильность), физико-химических (растворимость, химическая стабильность, рН) и токсикологических (цитотоксичность на культуре клеток человека, генотоксикологический потенциал в бактериальном тесте Эймса, оценка кардиотоксичности в hERG-тесте, определение максимальных переносимых доз in vivo) исследований, а также оценку зависимости структуры от активности соединения (SAR). Наиболее перспективные соединения, отобранные по результатам описанных выше исследований, синтезируют в лабораторном или опытно-промышленном масштабе в количествах, необходимых для обеспечения дальнейших доклинических исследований, а также разрабатывают несколько формуляций для планируемых путей введения [67].
В соответствии с действующими методическими рекомендациями [68], современная программа докли-
нических исследований оригинальных лекарственных препаратов должна включать в себя эксперименты in vitro и in vivo с помощью релевантных тест-систем, целью которых является исследование фармакодина-мических свойств соединения в отношении выбранной терапевтической мишени, изучение фармакоки-нетических параметров (всасывания, распределения, метаболизма и экскреции препарата) и токсикологических свойств соединения в исследованиях острой (однократное введение), хронической (многократное повторное введение) и специфических видов токсичности (генотоксичность, иммунотоксичность, репродуктивная токсичность, аллергенность и др.) [67].
При этом в процессе проведения доклинических исследований существует несколько критических точек, когда разработчики принимают решение о целесообразности продолжения разработки препарата на основе протестированного соединения. В частности, недостаточная эффективность in vivo или выявленная в эукариотических тестах генотоксическая активность лекарственного кандидата могут служить достаточным обоснованием для возвращения разработки на этап оптимизации структуры молекулы или прекращения дальнейших исследований [72].
По данным проведенных доклинических исследований, в случае получения суммарных позитивных результатов формируется регистрационное досье на лекарственный препарат для получения разрешения на проведение клинических испытаний, которые состоят из трех последовательно проводимых стадий (фаз) с целью подтверждения терапевтической эффективности при лечении заболевания, выявления наличия, характера и обратимости побочных эффектов, а также сбора информации о фармакодинамике и фармакоки-нетике исследуемого средства. При положительном исходе таких испытаний лекарственное средство проходит официальную регистрацию в системе Министерства здравоохранения Российской Федерации и разрешается к коммерческой реализации.
Разработка противогрибкового лекарственного средства имеет несколько особенностей в силу природы грибковых патогенов и особенностей популяции целевой группы пациентов. Основные сложности в разработке противогрибковых средств заключаются в том, что грибы являются эукариотическими организмами, поэтому многие внутриклеточные механизмы и системы сходны с человеческими, что вызывает перекрестные эффекты и побочные токсические эффекты препаратов [73, 74]. Именно этим они отличаются, к примеру, от противобактериальных или противовирусных препаратов, спектр которых в клинической практике намного шире, как уже упоминалось выше [7, 8].
Наиболее частый подход к выявлению противогрибковых низкомолекулярных соединений заключается в скрининге больших библиотек синтетических малых молекул или соединений природного происхождения в отношении их способности ингибировать рост выбранного грибка. Наиболее широко использующимися методами обнаружения противогрибковых низкомолекулярных соединений являются традиционные методы разведений или микроразведений в жидких средах, основанные на оценке ингибирования роста посредством измерения оптической плотности
культуры [68]. С появлением высокопроизводительного скрининга как инструмента обнаружения лекарств и биологических исследований наблюдают появление огромного количества коммерчески доступных библиотек синтетических низкомолекулярных соединений. Подавляющее большинство молекул в пределах этих библиотек были разработаны с использованием анализа связи структура-эффект и других критериев «подобия лекарству».
Поскольку два из трех основных классов применяемых в настоящее время противогрибковых препаратов природного происхождения (полиены и эхиноканди-ны), то ведётся активный поиск антимикотиков среди соединений, выделяемых из бактерий и грибов, а также растений [12, 21, 75, 76]. Однако сложность структур таких соединений ограничивает создание их синтетических аналогов [13].
Кроме вышеперечисленного, известна концепция «перепрофилирования» («re-purposing»), когда открывается противогрибковая активность уже известного препарата, применяющегося в других нозологиях, и его терапевтический потенциал расширяется как в качестве монотерапии, так и в качестве ко-терапии в комбинации с другими противогрибковыми средствами [29, 77]. Первыми примерами такого подхода являются ингибиторы кальциневрина, TOR-киназы и Hsp90, которые способны значительно усиливать активность флуконазола in vitro и in vivo, а также энок-сацин, фторхинолоновый антибиотик, показавший активность на модели диссеминированного кандидоза у мышей [12]. Помимо этого, стоит отметить стимулирующую противогрибковую активность противоопухолевого препарата гентамицина [7].
Для подтверждения активности выявленных в процессе скрининга соединений применяют животные модели грибковых заболеваний. Морских свинок наиболее часто используют в качестве животной модели для оценки эффективности противогрибковых соединений в отношении дерматомицетов, в то время как мышей - преимущественно для создания иммуно-компрометированных моделей аспергиллёза лёгких и кандидозов [78, 79].
По своему механизму действия фунгицидные соединения более предпочтительны, по сравнению с фунгистатическими, поскольку большинство пациентов, страдающих инвазивными грибковыми инфекциями, иммунокомпрометированы и, таким образом, в большей степени зависят от того, чтобы противогрибковый препарат помог полностью избавиться от патогена и избежать рецидива заболевания. При применении большинства доступных антимикотиков с фунги-статическим механизмом действия часто происходит развитие устойчивости патогенных грибов к данным лекарствам и неблагоприятный исход лечения, что впоследствии приводит к появлению множественной лекарственной резистентности [20, 39]. Таким образом, в ходе доклинической оценки противогрибкового препарата необходимо на ранних этапах оценивать потенциальный механизм действия соединения, принципиальную возможность и скорость возникновения приобретенной устойчивости патогенных грибковых культур к лекарственному кандидату [80]. Чаще всего при этом применяют диско-диффузионный метод, метод серийных разведений и Е-тест [81].
Данные по острой токсичности помогают оценить способность соединения вызывать летальные эффекты, выяснить закономерности их проявления и степень выраженности. Они, в совокупности с результатами изучения специфической фармакологической активности, позволяют определить терапевтическую широту препарата и/или отсеять заведомо ядовитые соединения или соединения, непригодные по критерию «терапевтическая широта». Кроме того, в отсутствие сведений об острой токсичности существенно затруднено определение доз, превышающих эффективные, в дальнейших доклинических исследованиях по оценке хронической токсичности и специфических видов токсичности.
Сведения о мутагенных свойствах позволяют прогнозировать возможную канцерогенность и репродуктивную токсичность, а также формирование резистентных к антибиотику штаммов возбудителя. Стандартная батарея испытаний генотоксической активности лекарственных средств включает испытания in vivo и in vitro на культурах бактериальных и эукариотических клеток [68]. Хотя генотоксический (и даже канцерогенный) потенциал был обнаружен у ряда хорошо известных коммерческих противоинфек-ционных препаратов [82-85], современные нормативные руководства настоятельно рекомендуют избегать потенциально генотоксичных молекул для любых препаратов. Таким образом, доклинические исследования безопасности начинают с испытания острой токсичности и генотоксичности лекарства-кандидата [86, 87].
Помимо профиля фармакологической активности и безопасности, фармакокинетические свойства анти-микотика часто представляют наиболее важный вопрос при выборе терапии и, соответственно, требуют особого внимания на ранних этапах разработки анти-микотика. Это обусловлено тем, что, во-первых, ослабленная функция желудочно-кишечного тракта или сниженный печеночный или почечный клиренс могут серьезно влиять на эффективность и безопасность противогрибковой терапии. Во-вторых, грибковые ин-
фекции, поражающие центральную нервную систему, к которым относится, в частности аспергиллёз, поддаются лечению только при условии проникновения антимикотика через гемато-энцефалический барьер. Таким образом, соединения с высокой молекулярной массой или большим коэффициентом связывания с белками плазмы крови часто не способны достигать терапевтических концентраций [74, 88].
Кроме того, предсказуемый фармакокинетический профиль позволит оценить вероятность развития побочных токсических эффектов и подобрать соответствующую корригирующую терапию без проведения дорогостоящего лекарственного мониторинга.
Создание новых противогрибковых препаратов для системного применения чаще всего проводят сразу для нескольких предполагаемых клинических путей введения, для чего разрабатывают несколько видов лекарственных форм. Это связано с тем, что тяжесть течения системной инфекции и жизнеугрожающее состояние пациента могут определить выбор парентерального пути введения, который поможет быстро достичь терапевтической концентрации в пораженном органе. В то же время при хроническом течении инфекции и формах течения, не угрожающих жизни пациента, допустимы пероральные формы приема препарата [36].
Суммируя вышесказанное, отметим следующие условия, которым должен отвечать антимикотик, перспективный к практической разработке [7, 13, 36, 89]:
быть эффективным и высокоселективным в отношении специфичной для гриба-патогена мишени;
предпочтительнее по своему механизму действия должен обладать фунгицидным по сравнению с фунги-статическим воздействием;
быть хорошо растворимым и подходящим для создания на его основе формуляций для перорального и внутривенного (в случае системных микозов) или иных соответствующих путей введения;
обладать приемлемыми фармакокинетическими характеристиками.
ЛИТЕРАТУРА
1. Denning D.W. The ambitious '95-95 by 2025' road map for the diagnosis and management of fungal diseases. Thorax. 2015; 70: 613-614.
2. Global Action Fund for Fungal Infections. 95-95 by 2025. Improving outcomes for patients with fungal infections across the world: a roadmap for the next decade. May 2015. http://www.gaffi.org/road map/
3. Brown G.D., Denning D.W., Gow N.A.R., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Science Translational Medicine. 2012; 4 (165rv13).
4. Perlin D.S., Shor E., Zhao Y. Update on antifungal drug resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2015; 2: 84-95.
5. Pham C.D., Iqbal N., Bolden C.B., et al. Role of FKS mutations in Candida glabrata: MIC values, echinocandin resistance, and multidrug resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2014; 58: 4690-96.
6. Lockhart S.R., Etienne K.A., Vallabhaneni S., et al. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clinical Infectious Diseases. 2017; 64: 134-140.
7. Roemer T., Krysan D.J. Antifungal drug development: challenges, unmet clinical needs, and new approaches. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2014; 4.
8. Hughes D., Karlén A. Discovery and preclinical development of new antibiotics. Upsala Journal of Medical Sciences. 2014; 119: 162-169.
9. Климко Н.Н., Веселов А.В. Новые препараты для лечения инвазивных микозов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003; 5 (4): 342-353. [Klimko N.N., Veselov A.V Novyie preparatyi dlya lecheniya invazivnyih mikozov. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya himioterapiya. 2003; 5 (4): 342-353. (In Russ)].
10. Loo D.S. Systemic antifungal agents: an update of established and new therapies. Advances in Dermatology. 2006; 22: 101-124.
11. Nett J.E., Andes D.R. Antifungal agents: spectrum of activity, pharmacology, and clinical indications. Infectious Disease Clinics of North America. 2015; 30 (1): 51-83.
12. Butts A., Krysan D.J. Antifungal drug discovery: something old and something new. PLOS Pathogens. 2012; 8 (9).
13. Sheng C., Zhang W. New lead structures in antifungal drug discovery. Current Medicinal Chemistry. 2011; 18: 733-766.
14. Bordon-Pallier F., Jullian N., Haesslein J.L. The cell cycle of pathogenic fungi: target for drugs. Progress in Cell Cycle Research. 2003; 5: 81-90.
15. Kauffman C.A., Pappas P.G., Sobel J.D., Dismukes W.E. Essentials of Clinical Mycology. (Eds.). New York: Oxford University Press; 2011: 27-34.
16. Shapiro R., Robbins N., Cowen L. Regulatory circuitry governing fungal development, drug resistance, and disease. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2011;75 (2): 213-267.
17. Сергеев Ю.В., Шпигель Б.И., Сергеев А.Ю. Фармакотерапия микозов. М.: Медицина для всех, 2003: 200 с. [Sergeev Yu.V., Shpigel B.I., Sergeev A.Yu. Farmakoterapiya mikozov. M.: Meditsina dlya vseh, 2003: 200 s. (In Russ)].
18. BackerM.D., Van DijckP. Progress in functional genomics approaches to antifungal drug target discovery. Trends in Microbiology. 2003; 11 (10): 470-478.
19. Walsh T.J., Viviani M.A., Arathoon E., et al. New targets and delivery systems for antifungal therapy. Medical Mycoogy. 2000; 38 (1): 335-347.
20. Campoy S., Adrio J.L. Antifungals. Biochemical Pharmacology. 2016; 16: 30422-1.
21. Roemer T., Xu D., Singh S.B., et al. Confronting the challenges of natural product-based antifungal discovery. Chemistry & Biology. 2011; 18 (2): 148-160.
22. Heasley B.H., Pacofsky G.J., Mamai A., et al. Synthesis and biological evaluation of antifungal derivatives of enfumafungin as orally bioavailable inhibitors of p-1,3-glucan synthase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2012; 15 (22): 6811-6816.
23. Mulder M.P., Kruijtzer J.A., Breukink E.J., et al. Synthesis and evaluation of novel macrocyclic antifungal peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011; 1 (19): 6505 - 6517.
24. Kitamura A. Discovery and characterization of 6-1,6-glucan inhibitors. Expert Opinion on Drug Discovery. 2010; 5 (8): 739749.
25. Wiederhold N.P., Patterson T.F. What's new in antifungals: an update on the in-vitro activity and in-vivo efficacy of new and investigational antifungal agents. Current Opinion in Infectious Diseases. 2015; 28 (6): 539-545.
26. Watanabe N.A., Miyazaki M., Horii T., et al. E1210, a new broad-spectrum antifungal, suppresses Candida albicans hyphal growth through inhibition of glycosylphosphatidylinositol biosynthesis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012; 56 (2): 960-971.
27. Ciociola T., Giovati L., Conti S., et al. Natural and synthetic peptides with antifungal activity. Future Medicinal Chemistry. 2016; 8 (12): 1413-1433.
28. Thompson A.J., Speciale G., Iglesias-Fernández J., et al. Evidence for a boat conformation at the transition state of GH76 a-1,6-mannanases-key enzymes in bacterial and fungal mannoprotein metabolism. Angewandte Chemie International Edition in English. 2015; 54 (18): 5378-5382.
29. Liu N., Wang C., Su H., et al. Strategies in the discovery of novel antifungal scaffolds. Future Medicinal Chemistry. 2016; 8 (12): 1435-1454.
30. Zhang Y., Rao R. The V-ATPase as a target for antifungal drugs. Current Protein & Peptide Science. 2012; 13 (2): 134-140.
31. Kakeya H., Miyazaki Y., Senda H., et al. Efficacy of SPK-843, a novel polyene antifungal, in comparison with amphotericin B, liposomal amphotericin b, and micafungin against murine pulmonary aspergillosis. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2008; 52 (5): 1868-1870.
32. PengX.M.,. Cai G.X, Zhou C.H. Recent developments in azole compounds as antibacterial and antifungal agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2013;13 (16): 1963-2010.
33. Pasqualotto A.C., Denning D.W. New and emerging treatments for fungal infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2008; 61 (1): i19- i30.
34. Singh A., Paliwal S.K., Sharma M., et al. In silico and in vitro screening to identify structurally diverse non-azole CYP51 inhibitors as potent antifungal agent. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 2016; 63: 1-7.
35. Tani N., Rahnasto-Rilla M., Wittekindt C., et al. Antifungal activities of novel non-azole molecules against S. cerevisiae and C. albicans. European Journal of Medicinal Chemistry. 2012; 47 (1): 270-277.
36. Lewis R.E. Current concepts in antifungal pharmacology. Mayo Clinic Proceedings. 2011; 86 (8): 805-817.
37. Gokhale V.M., Kulkarni V.M. Comparative molecular field analysis of fungal squalene epoxidase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 1999; 42 (26): 5348-5358.
38. Thevissen K., Francois I.E., Aerts A.M., Cammue B.P. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Current Drug Targets. 2005; 6 (8): 923-928.
39. Prasad R., Shah A.H., Rawal M.K. Antifungals: mechanism of action and drug resistance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2016; 892: 327-349.
40. Ohtsuka T., Aoki Y. N-Myristoyltransferase inhibitors as potential antifungal drugs. Drugs of the Future. 2003: 28: 143-152.
41. Hurdle J.G., O'Neill A.J., Chopra I. Prospects for aminoacyl-tRNA synthetase inhibitors as new antimicrobial agents. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005; 49: 4821-4833.
42. Сергеев Ю.В., Сергеев А.Ю. Перспективные антимикотики ближайшего будущего. Успехи медицинской микологии. 2003; 1 (1): 112-113. [Sergeev Yu.V, Sergeev A.Yu. Perspektivnyie antimikotiki blizhayshego buduschego. Uspehi meditsinskoy mikologii. 2003; 1 (1): 112-113. (In Russ)].
43. Shen L.L., Baranowski J., Fostel J., et al. DNA topoisomerases from pathogenic fungi: targets for the discovery of antifungal drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1992; 36 (12): 2778-2784.
44. Odds F.C. Genomics, molecular targets and the discovery of antifungal drugs. Revista Iberoamericana de Micología. 2005; 22 (4): 229-237.
45. Khan S.I., Nimrod A.C., Mehrpooya M., et al. Antifungal activity of eupolauridine and its action on DNA topoisomerases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2002; 46 (6): 1785-1792.
46. Богданов К.В., Игнатьева С.М. Хроматин-ремоделирующий фактор FACT и его роль в регуляции клеточного роста Aspergillus spp. при аспергиллезе. Проблемы медицинской микологии. 2008; 10 (3): 3-8. [Bogdanov K.V., Ignateva S.M. Hromatin-remodeliruyuschiy faktor FACT i ego rol v regulyatsii kletochnogo rosta Aspergillus spp. pri aspergilleze. Problemyi
meditsinskoy mikologii. 2008; 10 (3): 3-8. (In Russ)].
47. SingerR.A., Johnston G.B. The FACT chromatin modulator: genetic and structure/function relationships. Biochemistry and Cell Biology. 2004; 82 (4): 419-427.
48. Lamoth F., Juvvadi P.R., Steinbach W.J. Heat shock protein 90 (Hsp90): A novel antifungal target against Aspergillus fumigatus. Critical Reviews in Microbiology. 2016; 42 (2): 310-321.
49. Bastidas R.J., Reedy J.L., Morales-Johansson H., et al. Signaling cascades as drug targets in model and pathogenic fungi. Current Opinion in Investigational Drugs. 2008; 9 (8): 856-864.
50. Yoo Y.J., Kim H., Park S.R., Yoon Y.J. An overview of rapamycin: from discovery to future perspectives. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2016.
51. Wirk B. Heat shock protein inhibitors for the treatment of fungal infections. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery. 2011; 6 (1): 38-44.
52. Abdallah Q.A., Fortwendel J.R. Exploration of Aspergillus fumigatus Ras pathways for novel antifungal drug targets. Fronties in Microbiology. 2015; 6 (128).
53. Shibata T., Takahashi T., Yamada E., et al. T-2307 causes collapse of mitochondrial membrane potential in yeast. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012; 56 (11): 5892-5897.
54. Poeta M.D. Special Issue: Novel Antifungal Drug Discovery. Journal of Fungi. 2016; 2 (4): 33-38.
55. Agarwal A.K., Xu T., Jacob M.R., et al. Genomic and genetic approaches for the identification of antifungal drug targets. Infectious Disorders - Drug Targets. 2008; 8 (1): 2-15.
56. Isaacson R.E. Genomics and the prospects for the discovery of new targets for antibacterial and antifungal agents. Current Pharmaceutical Design. 2002; 8 (13): 1091-1098.
57. Monk B.C., Cannon R.D. Genomic pathways to antifungal discovery. Current Drug Targets - Infectious Disorders. 2002; 2 (4): 309-329.
58. Denning D.W., Anderson M.J., Turner G., et al. Sequencing the Aspergillus fumigatus genome. The Lancet Infectious Diseases. 2002; 2 (4): 251-253.
59. Rivera Z.S., Losada L., Nierman W.C. Back to the future for dermatophyte genomics. MBio. 2012;30 (3): pii. e00381-12.
60. O'Meara T.R., Veri A.O., Ketela T., et al. Cowena Global analysis of fungal morphology exposes mechanisms of host cell escape. Nature Communications. 2015; 6 (6741).
61. Wojciechowski M., Milewski S., Mazerski J., Borowski E. Glucosamine-6-phosphate synthase, a novel target for antifungal agents. Molecular modelling studies in drug design. Acta Biochimica Polonica. 2005; 52 (3): 647-653.
62. Spry C., Kirk K., Saliba K.J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 2008; 32 (1): 56-106.
63. Osherov N., Kontoyiannis D.P. The anti-Aspergillus drug pipeline: Is the glass half full or empty? Medical Mycology. 2016: pii: myw060.
64. https://clinicaltrials.gov/.
65. Vid G. From a molecule to a medicine - chemical and pharmaceutical development. Lecture in the framework of the educational program Pharma's Cool. 2014.
66. Guideline on bioanalytical method validation (EMEA 2012). www.ema.europa.eu.
67. Васильев А.Н. Качественные доклинические исследования - необходимый этап разработки и внедрения в клиническую практику новых лекарственных препаратов. Антибиотики и химиотерапия. 2012; 57 (1-2): 41-49. [Vasil'ev A.N. Kachestvennye doklinicheskie issledovaniya - neobhodimyj ehtap razrabotki i vnedreniya v klinicheskuyu praktiku novyh lekarstvennyh preparatov. Antibiotiki i himioterapiya. 2012; 57 (1-2): 41-49 (In Russ)].
68. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012: 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. CHast' pervaya. M.: Grif i K, 2012: 944 s. (In Russ).
69. http://www.ich.org/products/guidelines.html.
70. http://www.ema.europa.eu/ema/index.jspicurl = p ages/regulation/ general/genera l_content_0 00397. jsp&mid=WC0b01ac058002956f.
71. http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/default.htm.
72. Ashby J., Waters M.D., Preston J., et al. IPCS harmonization of methods for the prediction and quantification of human carcinogenic/mutagenic hazard, and for indicating the probable mechanism of action of carcinogens. Mutation Research. 1996; 352 (67): 153-157.
73. Seneviratne C.J., Rosa E.A.R. Editorial: Antifungal Drug Discovery: New Theories and New Therapies. Fronties in Microbiology. 2016; 7 (728).
74. Lepak A.J., Andes D.R. Antifungal Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Cold Spring Harbor Perspectives of Medicine. 2014;10 (5): 5-28.
75. Корсун Е.В., Корсун В.Ф. Исторические сведения об антимикотических свойствах лекарственных растений. Успехи медицинской микологии. 2016; 16: 134-138. [Korsun E.V, Korsun V.F. Istoricheskie svedeniya ob antimikoticheskih svojstvah lekarstvennyh rastenij. Uspekhi medicinskoj mikologii. 2016; 16: 134-138 (In Russ)].
76. Silver L., Bostian K. Screening of natural products for antimicrobial agents. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 1990; 9 (7): 455-461.
77. Borowski E. Novel approaches in the rational design of antifungal agents of low toxicity. Il Farmaco. 2000; 55: 206-208.
78. Cambier L., Heinen M.P., Mignon B. Relevant Animal Models in Dermatophyte Research. Mycopathologia. 2016. [Epub ahead of print].
79. Kurup V.P., Grunig G. Animal models of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Mycopathologia. 2002; 153 (4): 165-177.
80. Ghannoum M.A., Rice L.B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clinical Medical Microbiology Reviews. 1999;12 (4): 501-517.
81. Иванова Л.В., Баранцевич Е.П., Шляхто Е.В. Резистентность грибов-патогенов к антимикотикам (обзор). Проблемы
медицинской микологии. 2011; 13 (1): 14-17. [Ivanova L.V., Barantsevich E.P., Shlyahto E.V. Rezistentnost gribov-patogenov k antimikotikam (obzor). Problemyi meditsinskoy mikologii. 2011; 13 (1): 14-17. (In Russ)].
82. Brambilla G., Mattioli F., Robbiano L., Martelli A. Studies on genotoxicity and carcinogenicity of antibacterial, antiviral, antimalarial and antifungal drugs. Mutagenesis. 2012; 27 (4): 387-413.
83. Brambilla G., Martelli A. Update on genotoxicity and carcinogenicity testing of 472 marketed pharmaceuticals. Mutation Research. 2008; 681 (2-3): 209-229.
84. Olshan A.F., Mattison D.R., Zwanenburg T.S. International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Cyclosporine A: review of genotoxicity and potential for adverse human reproductive and developmental effects. Report of a Working Group on the genotoxicity of cyclosporine A, August 18, 1993. Mutation Research. 1994; 317 (2): 163-173.
85. Snyder R.D., Green J.W. A review of the genotoxicity of marketed pharmaceuticals. Mutation Research. 2001; 488: 151-169.
86. Rothfuss A., Honma M., Czich A., et al. Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing. Mutation Research. 2011; 723 (2): 108-120.
87. Shayne Cox Gad (editor) Preclinical Development Handbook: Toxicology. Wiley-Interscience, 2008: 1059 p.
88. Мирошниченко И.И. Роль и место фармакокинетики при разработке новых лекарственных средств. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014; 7: 152-156. [Miroshnichenko I.I. Rol i mesto farmakokinetiki pri razrabotke novyih lekarstvennyih sredstv. Razrabotka i registratsiya lekarstvennyih sredstv. 2014; 7: 152-156. (In Russ)].
89. Hope W., Drusano G.L., Rex J.H. Pharmacodynamics for antifungal drug development: an approach for acceleration, risk minimization and demonstration of causality. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2016; 71 (11): 3008-3019.
Поступила в редакцию журнала 18.12.2017
Рецензент: Н.Н. Климко
