CC BY
249
УДК 615.43 + 582.949.25
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI)
*
© Н.К. Чирикова, Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru
Проведено фармакогностическое исследование надземной части шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi, сем. Lamiaceae). В ходе товароведческого анализа выявлены основные показатели качества S. baicalensis. Изучение химического состава показало присутствие органических кислот, свободных углеводов, полисахаридов, аминокислот, алкалоидов, флавоноидов, фенолокислот, антоцианов, дубильных веществ, фотосинтетических пигментов, липидов и тритерпеновых соединений. Выявлено наличие выраженной антирадикальной активности у этилацетатной и этаноль-ной фракций надземной части S. baicalensis.
Сокращения: БАС - биологически активное соединение, БХ - хроматография на бумаге, ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография, Д - детектор, ДФПГ - дифенилпикрилгидразил, ЦП - ценопопуляция; Gal - галактоза, Glc - глюкоза, Sac - сахароза; Tar - винная кислота, Cit - лимонная кислота, Mal - яблочная кислота, Fum - фумаровая кислота, Suc - янтарная кислота.
Ключевые слова: Scutellaria baicalensis Georgi, фармакогнозия, товароведческий анализ, антирадикальная активность. Введение
Scutellaria baicalensis Georgi - шлемник байкальский - многолетнее травянистое растение, относится к семейству Губоцветные (Lamiaceae). Род Scutellaria L. включает 360 видов мировой флоры, из них 148 видов произрастает на территории СНГ. S. baicalensis относится к подроду Euscutellaria Brig. секции Stachy-macris A. Hamit [1]. S. baicalensis имеет монголо-даурско-маньчжурский тип ареала. Распространение
S. baicalensis в России ограничено бассейном Амура и оз. Ханка. Протяженность его ареала с запада на восток превышает 1500 км, с севера на юг - 1000 км [2].
Корни S. baicalensis - ценное лекарственное сырье с ограниченной в пределах России сырьевой базой. При создании лекарственных средств следует учитывать то, что заготовка этого вида может привести к истощению природных популяций, поэтому большую роль приобретает изучение возможностей более полного использования данного вида.
Химический состав растений рода Scutellaria L. разнообразен и представлен фенолокислотами, иридои-дами, ди- и тритерпеновыми соединениями, карденолидами, кумаринами, дубильными веществами и флаво-ноидами [3]. Среди перечисленного разнообразия классов природных соединений особо следует выделить группу полифенолов из-за аномально высокого содержания и значительного их структурного разнообразия.
В надземной части S. baicalensis обнаружены производные хризина, апигенина, скутелляреина, изоску-телляреина и лютеолина [3, 4]. Помимо флавоноидов и родственных соединений в надземной части S. bai-calensis качественно обнаружено присутствие липидов, фотосинтетических пигментов, дитерпенов и минеральных веществ [5].
Корни S. baicalensis известны в китайской и тибетской медицине, а также в практике бурятских и монгольских лам под названием «хонг лен». И.И. Брехман и М.А. Гриневич установили, что данное лекарственное растение входит в «элитную» группу сырья, каковыми являются жень-шень, аралия, элеутерококк [6].
Автор, с которым следует вести переписку.
Информация о лечебных свойствах «хонг лен» приведена в основных учебниках тибетской медицины -«Чжуд-ши» (XI в.) [7], «Вайдурья-онбо» (XVII в.) [8], «Шелпхренге» (XVIII в.) [9], «Дзейцхар мигчжан» (Х1Х-ХХ вв.) [10] и современных публикациях тибетских авторов.
Анализ научной литературы показал, что достаточно обширный материал по фармакологическим исследованиям X baicalensis посвящен в основном изучению корней данного растения [5]. Относительно экспериментальной оценки лечебных свойств надземной части X baicalensis имеются сведения о гипотензивном действии настойки и водного извлечения [11]. Суммарный экстракт (и его гидрофильная фракция) из надземной части X baicalensis обладает психотропным действием [12]. При обучении животных (Т-образный лабиринт с питьевым подкреплением) на фоне введения алкоголя суммарный экстракт из надземной части превосходил по активности Скутекс (таблетированная форма сухого экстракта из корней X baicalensis) [13]. При изучении влияния экстракта из листьев X baicalensis на эффективность циклофосфана выявлено усиление противоопухолевого эффекта цитостатика и противометастатического действия [14]. Следует отметить, что фармакологическая активность извлечений из надземной части X baicalensis, с одной стороны, повторяет свойства экстракта из корней, с другой - проявляет и своеобразные действия.
Представленные данные свидетельствуют о том, что создание препаратов из надземной части X baicalen-
является перспективным направлением фитофармации.
Целью настоящей работы является определение внешних признаков надземной части X baicalensis, изучение анатомического строения с целью установления диагностических признаков сырья, а также проведение товароведческого и предварительного химического анализов.
Экспериментальные условия
Сырье X baicalensis (надземная часть) было собрано в 2005 г. в Читинской области с пяти ценопопуля-ций (ЦП) (табл. 1, 2).
Таблица 1. Характеристика исследованных ЦП
ЦП Расположение Обилие & Ьаіеаіетіз*
ББ-1 3 км на запад от станции Приисковая, экспозиция склона - юг ер
ББ-2 северо-запад от станции Приисковая, экспозиция склона - запад в0І-вр
ББ-3 2 км на юг от с. Савватеево, экспозиция склона - юг вр
ББ-4 3 км на юго-восток от с. Савватеево вверх по течению горного ручья, экспозиция склона - юго-запад вр
ББ-5 1,5 км на север от с. Умыкей, экспозиция склона - юго-запад вР
*Обилие вида определяли по шкале Друде [15].
Таблица 2. Запасы сырья & baicalensis в исследованных ЦП*
ЦП Площадь ЦП, м2 Запас, кг Объем ежегодных заготовок, кг
биологический эксплуатационный
ББ-1 1500 23,22 14,37 2,40
ББ-2 1500 17,93 11,02 1,84
ББ-3 7500 201,53 135,98 22,66
ББ-4 7500 159,45 118,50 19,75
ББ-5 500 6,98 2,200 0,36
* Оценка ресурсов сырья проводилась согласно общепринятой методике определения запасов лекарственных растений [16].
Товароведческий анализ проводился в 5 параллельных опытах для цельного сырья. Отбор проб и анализ осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XI [17]. Масса средней пробы составляла 400 г.
Спектральные измерения проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (ЖтайЬи). В работе использовали бумагу хроматографическую ¥N-12 (аминокислоты, алкалоиды, флавоноиды, антоцианы), ¥N-16 (органические кислоты), ВЭТСХ-пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер).
Качественный состав БАС устанавливали хроматографическими методами: органические кислоты - БХ (этилацетат - муравьиная кислота 4 : 1, бутиловый спирт - муравьиная кислота 3 : 1, Д: 0,08% бромкрезоло-вый зеленый), углеводы - ВЭТСХ [18], аминокислоты - БХ (бутиловый спирт - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2, Д: 5% нингидрин), алкалоиды - БХ (бутиловый спирт - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2, клиновид-
ный вариант, Д: 5% аммония рейнекат), флавоноиды - БХ (бутиловый спирт - уксусная кислота - вода 4 : 1 : 2, 15% уксусная кислота, Д: 5% AlCl3, УФ), фенолокислоты - ВЭТСХ (этилацетат - толуол -муравьиная кислота - вода 100 : 5 : 10 : 10, Д: NH3, 5% FeCl3, УФ), антоцианы - БХ (ацетон - HCl - вода 15 : 3 : 85, Д: NH3, УФ), каротиноиды, хлорофиллы - ВЭТСХ (гексан - диэтиловый эфир - ацетон 4 : 1 : 1, Д: 5% фосфорномолибденовая кислота).
Количественный анализ проводили с использованием следующих методик: органические кислоты [19], углеводы [20], аминокислоты [21], общее содержание фенолов [22], антоцианы [23], дубильные вещества, алкалоиды, липиды [24], каротиноиды [25], хлорофиллы [26], тритерпеновые соединения [27].
Для выделения антоцианов цветков S. baicalensis сырье (20 г) экстрагировали 1% HCl в 95% этиловом спирте (1 : 20), извлечения фильтровали и концентрировали в вакууме (40 °С). Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта метилового и осаждали диэтиловым эфиром (~ 1 : 30). Растворитель удаляли декантацией, а смолистый осадок растворяли в метиловом спирте и хроматографировали. Гидролиз фракции антоцианов проводили 5% HCl в 95% этиловом спирте при нагревании (100 °С, 30 мин), агликоны экстрагировали минимальным объемом амилового спирта и анализировали.
В качестве стандартных образцов веществ-свидетелей использовали кислоты винную, лимонную, яблочную, янтарную, фумаровую, кофейную, хлорогеновую, феруловую кислоты, лютеолин, апигенин (Fluka), глюкозу, галактозу, сахарозу, пролин, аспарагин, глицин, Р-каротин (Acros Organics), холин, р-ситостерин (Aldrich); стахидрин выделен из травы пустырника пятилопастного [28], скутеллярин - из цветков шлемника Литвинова [29], дельфинидин - из цветков пиона [30], а-каротин, хлорофиллы а и b - из листьев какалии копьевидной [31].
Фракционирование сырья проводили в аппарате Сокслета последовательностью растворителей (гексан, хлороформ, этилацетат, 95% этиловый спирт) и далее водой обычным способом. Водную фракцию концентрировали и осаждали водорастворимые полисахариды (ВРПС) 95% этиловым спиртом (1 : 4). Осадок ВРПС центрифугировали и высушивали сменой растворителей. Супернатант концентрировали и высушивали. Таким образом, получено 6 фракций - гексановая, хлороформная, этилацетатная, этанольная, водная и ВРПС.
Антирадикальную активность фракций надземной части S. baicalensis определяли с применением ДФПГ-метода (DPPH-assay) с использованием свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (MP Biomedicals Inc.) [32].
Результаты и их обсуждение
Товароведческий анализ. При исследовании соотношения органов в сырье установлено, что основную массу сырья составляют стебли (35-65%) и листья (28-58%), на долю цветков и плодов приходится 0-7% (табл. 3). Ситовой анализ показал, что при измельчении сырья основная масса сырья проходит через сита с диаметром отверстий 1-3 мм (табл. 4).
Результаты товароведческого анализа цельного сырья приведены в таблице 5.
Таблица 3. Соотношение органов в надземной части S. baicalensis, %
Сырье Часть растения
листья стебли цветки плоды
SB-1 58,0 35,0 7,0 -
SB-2 45,0 50,0 5,0 -
SB-3 57,0 40,5 2,5 -
SB-4 50,0 48,0 2,0 -
SB-5 28,0 65,0 - 7,0
Таблица 4. Результаты ситового анализа надземной части S. baicalensis, %
Сырье Степень измельчения сырья, мм
0,5 1 3 5 7
SB-1 8,56 39,67 36,59 1,66 1,48
SB-2 9,33 43,41 33,19 12,34 1,70
SB-3 9,13 42,95 36,20 9,18 2,33
SB-4 9,35 47,35 27,21 14,36 1,73
Таблица 5. Результаты товароведческого анализа надземной части S. baicalensis
Сырье Потеря в массе нри высушивании, % Зола общая, % Зола, не растворимая в 10% HCl, % Листья побуревшие и почерневшие, % Частицы, проходящие сквозь сито с 0 отверстий 1 мм, % Органические нри-меси, % Минеральные примеси, %
SB-1 S,2S 7,51 1,77 1,54 2,12 0,25 0,12
SB-2 S,57 7,74 1,70 1,бб 1,55 0,28 0,14
SB-3 S,S9 7,б1 1,6s 2,28 1,08 0,1б 0,22
SB-4 7,94 6,SS 1,S0 1,51 0,б4 0,б4 0,10
SB-5 7,22 7,05 1,34 0,54 1,07 0,71 0,09
В результате проведенных исследований установлены следующие товароведческие показатели качества сырья: потеря в массе при высушивании не более 10%; золы общей не более 10%; золы, не растворимой в 10% хлористоводородной кислоте не более 5%; листьев побуревших и почерневших не более 5%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, не более 5%; органической примеси не более 2%; минеральной примеси не более 0,5%.
Химический состав. Результаты определения качественного состава и количественного содержания БАС в надземной части S. baicalensis представлены в таблице б.
В надземной части S. baicalensis установлено присутствие органических кислот в свободной и связанной формах, причем последние составляют более 90% от общего содержания кислот (12,5S%). Хроматографический анализ показал наличие пяти соединений: винной, лимонной, яблочной, янтарной и фумаровой кислот.
На углеводные компоненты приходится около 30% от массы сырья. В свободном состоянии находятся глюкоза, галактоза и сахароза (10,79%); в составе полисахаридов доминируют гемицеллюлозные полимеры (5S% от суммы полисахаридов). Среди азотсодержащих соединений обнаружены аминокислоты и алкалоиды -
0,44 и 0,35% соответственно. Во фракции алкалоидов обнаружено два вещества, хроматографическое поведение которых совпадает с таковым холина и стахидрина; следует отметить, что оба вещества являются характерными для представителей семейства Lamiaceae [33], но ранее в S. baicalensis обнаружены не были. Фенольные соединения являются преобладающими в комплексе БАС надземной части S. baicalensis; их общее содержание, определенное по методу Фолина, составляет 3S-40%. Методом БХ обнаружены скутеллярин, лютео-лин, апигенин, кофейная, хлорогеновая и феруловая кислоты. Из цветков S. baicalensis выделена фракция ан-тоцианов, представленная тремя соединениями, агликоном которых является дельфинидин. Кроме того, в надземной части S. baicalensis обнаружены тритерпеновые соединения и фотосинтетические пигменты.
Таблица б. Качественный состав и количественное содержание БАС в надземной части S. baicalensis
Группа БАС Компоненты* Содержание, %
Органические свободные (Tar, Cit, Mal, Suc, Fum) 1,10±0,02
кислоты связанные (Tar, Cit, Mal, Suc, Fum) 11,48±0,28
общее содержание 12,58±0,29
Углеводы свободные (Glc, Gal, Sac) 10,79±0,З2
водорастворимые полисахариды 1,93±0,0б
пектиновые вещества 4,87±0,10
гемицеллюлозы А 4,б9±0,08
гемицеллюлозы Б 4,88±0,09
Аминокислоты свободные (Pro, Asn, Gly) 0,44±0,01
Алкалоиды холин, стахидрин 0,З5±0,02
Фенольные флавоноиды (скутеллярин, лютеолин, апигенин)
соединения фенолокислоты (кофейная, хлорогеновая, феруловая)
антоцианы (дельфинидин) 8,71±0,17 (в цветках)
дубильные вещества 2,25±0,0З
общее содержание З8,З4±1,01
Липиды каротиноиды (а-, Р-каротины) 0,91±0,0З
тритерпеновые соединения (Р-ситостерин) 0,42±0,01
общее содержание 1,92±0,07
Хлорофиллы формы а и b б,84±0,21
Антраценпроизводные, сердечные гликозиды не обнаружены
*Шрифтом выделены доминирующие компоненты.
Антирадикальная активность. Наличие антиоксидантной активности извлечений из растений сем. La-miaceae является известным фактом [34, 35]. S. baicalensis и его компоненты давно исследуется в связи с выраженностью антиоксидантой защиты в экспериментах in vitro и in vivo, обусловленной присутствием фенольных антиоксидантов, каковыми являются флавоноиды, широко представленные в S. baicalensis [3, 36]. ДФПГ-методом установлена высокая антирадикальная активность для этилацетатной и этанольной фракций, обусловленная присутствием веществ фенольной природы, содержание которых в указанных фракциях составляет 62,21 и 68,53% соответственно (метод Фолина) (табл. 7). Следует отметить наличие радикалулавливающей активности у фракции водорастворимых полисахаридов, а гексановая фракция обладает наименьшей активностью.
Таблица 7. Антирадикальная активность фракций из надземной части S. baicalensis
Фракция Выход, % от массы сырья IC50, мг/мл
Гексановая 2,3б 1,938
Хлороформная 1,81 0,330
Этилацетатная 4,75 0,039
Этанольная 28,81 0,017
Водная 8,83 0,811
ВРПС 4,84 0,213
Ионол - 0,007
Выводы
На основании проведенных исследований надземной части S. baicalensis можно сделать следующие выводы. Основными морфологическими группами надземной части S. baicalensis являются стебли и листья. В результате товароведческого анализа установлены показатели качества цельного сырья. Химический анализ показал присутствие в надземной части S. baicalensis различных групп БАС, причем доминирующими являются фенольные соединения (флавоноиды, фенолокислоты, антоцианы, дубильные вещества), составляющие до 40% экстрактивных веществ. Впервые установлен состав органических кислот (винная, лимонная, яблочная, янтарная и фумаровая кислоты), свободных углеводов (глюкоза, галактоза и сахароза) и алкалоидов (холин и стахидрин). С применением ДФПГ метода установлена высокая антирадикальная активность этилацетатной и этанольной фракций надземной части S. baicalensis, обусловленная наличием фенольных соединений.
Список литературы
1. Тахтаджян А. Система магнолиофитов. Л., 1987. 440 с.
2. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР. М., 197б. 331 с.
3. Маликов В.М., Юлдашев М.П. Фенольные соединения растений рода Scutellaria L. Распространение, строение и
свойства // Химия природных соединений. 2002. №4. С. 299-324; 2002. №5. С. 385-409.
4. Takido M., Aimi M., Yamanouchi S., Yasukawa K., Torii H., Takahashi S. Studies of constituents in the water extracts of
crude drugs. II. On the leaves of Scutellaria baicalensis Georgi // Yakugaku Zasshi. 197б. V. 9б. P. 381-383.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Литвиненко В.И., Понова Т.П., Суслов Н.И. Шлемник байкальский. Фитохимия и
фармакологические свойства. Томск, 1994. 222 с.
6. Гриневич М.А., Брехман И.И. Исследование сложных рецептов восточной медицины и их составляющих с помощью электронно-вычислительной машины. Сообщение 2. Три десятка наиболее часто используемых лекарственных растений традиционной медицины стран Юго-Восточной Азии // Растительные ресурсы. 1970. Т. б. Вып. 2. С. 153-157.
7. Чжуд-ши. Канон тибетской медицины. М., 2001. 7бб с.
8. Вайдурья-онбо. Дэсрид-Санчжай Чжамцо. Ксилограф на тиб. яз. XVIII в. Формат листа 10 х 54 см. т. 2, гл. 20.
9. Шелпхренг. Ксилограф на тиб. яз., 17бЗ. 233 л.
10. Дзейцхар Мигчжан. Ксилограф на тиб. яз.Улан-Удэ, 2000.
11. Вершинин Н.В., Яблоков Д.Д. Фармакология и клиника сибирских растений с седативным и гипотензивным действием // Новые лекарственные растения Сибири и их лечебные препараты. Томск, 194б. Вып. 2. С. 10-1б.
12. Першина О.В., Суслов Н.И., Пашина В.Г., Литвиненко В.И., Понова Т.П. Некоторые фармакологические свойства препаратов из надземной части Scutellaria baicalensis Georgi // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34. Вып. 3. С. 83-87.
13. Гольдберг А.А., Рыжаков В.М., Матяж М.Г., Стеновая Е.А. и др. Экстракт шлемника байкальского сухой в качестве гемостимулятора в условиях противоопухолевой химиотерапии больных раком легкого // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. б0. №3. С. 28-30.
14. Смольянинов Е., Гольдберг В.Е., Матяш М.Т., Рыжаков В.М. и др. Влияние экстракта шлемника байкальского на иммунологический статус больных раком легких в условиях противоопухолевой химиотерапии // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. 60. №6. С. 49-51.
15. Раменский Л.Г. Проблемы и методы изучения растительного покрова // Избранные труды. Л., 1971. 334 с.
16. Методика определения запасов лекарственных растений. М., 1986. 50 с.
17. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып.2. М., 1990. 398 с.
18. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Углеводы Lamiaceae. I. Mentha xpiperita L. // Химия природных соединений. 2007.
№5. С. 512-517.
19. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Маркарян А.А. Методика количественного определения суммарного содержания органических кислот в растительном сырье // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. Вып. 3. С. 112-116.
20. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов // Химия растительного сырья. 2006. №4. С. 29-33.
21. Пахомов В.П., Максимова Т.В., Никулина И.Н., Цыганков В.В., Хромова Л.В. Стандартизация рогов и пантов северного оленя. I. Количественное определение нингидринактивных веществ в порошке рогов северного оленя // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №4. С. 53-54.
22. Folin O., Ciocalteu V. On tyrosine and triptophane determination in proteins // Journal of Biological Chemistry. 1927. V. LXXIII. P. 627-650.
23. А.с. 1744647 СССР. Способ количественного определения суммы антоцианов / Рошаль А.Д., Циновый В.И., Орлов
B. Д. // БИ. 1992. №24. С. 251.
24. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 152 с.
25. Оленников Д.Н., Потанина О.Г., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г. Фармакогностическая характеристика листьев ка-калии копьевидной (Cacalia hastata L.) // Химия растительного сырья. 2004. №3. С. 43-52.
26. Vernon L.P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts // Analytical Chemistry. 1960. V. 32. №9. P. 1144-1150.
27. Попов Д.М., Дюкова В.В., Берашвили Д.Т. Определение флавоноидов и тритерпеноидов в жидком экстракте боярышника фотометрическими методами // Современные методы анализа фармацевтических препаратов. 1988. Т. 26.
C. 161-166.
28. Козлова Л.М. К фитохимии пустырника пятилопастного // Фармация. 1967. №6. С. 23-26.
29. Литвиненко В.И., Мещеряков А.А., Попова Т.П., Амосов А.С. Шлемник Литвинова - ценное флавоноидное сырье // Известия АН ТССР. 1971. №4. С. 40-45.
30. Geissman T.A. The chemistry of flavonoid compounds. Oxford - London - New York - Paris, 1962. 667 p.
31. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Николаев С.М. Биологически активные вещества листьев Cacalia hastata L. Сообщение 2. Каротиноиды и хлорофиллы // Химия природных соединений. 2004. №1. С. 83.
32. Seyoum A., Asres K., El-Fiky F.K. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids // Phytochemistry. 2006. V. 67. P. 2058-2070.
33. Пулатова Т.П. Содержание алкалоидов в некоторых растениях семейства Губоцветные // Химия природных соединений. 1968. №1. С. 62-63.
34. Katalinic V., Milos M., Kulisic T., Jukic M. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols // Food Chemistry. 2006. V. 94. P. 550-557.
35. Оленников Д.Н., Шишмарева Т.М., Танхаева Л.М. Антиоксидантная активность водных извлечений некоторых лекарственных растений. 1. Растения семейства Lamiaceae // Биоантиоксидант : материалы 7 Межд. конф. М., 2006. С. 206-208.
36. Andersen O.M., Markham K.R. Flavonids. Chemistry, biochemistry and application. Boca Raton - London - New York, 2006. 1197 p.
Поступило в редакцию 19 декабря 2007 г. После переработки 22 декабря 2008 г.
