CC BY
159
УДК 582.998 + 581.19
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИСТЬЕВ КАКАЛИИ КОПЬЕВИДНОЙ (CACALIA HASTATA L.)
© Д.Н. Оленников , О.Г. Потанина, Л.М. Танхаева, Г.Г. Николаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ (Россия), e-mail: [email protected]
Проведен фармакогностический анализ листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata), в ходе которого выявлены диагностические признаки сырья. Установлено, что в состав листьев Cacalia hastata входят различные группы БАВ: органические кислоты (до 13%), каротиноиды (до 314 мг%), хлорофиллы, углеводы, фенолокислоты, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, алкалоиды, тритерпены, витамины. Для стандартизации листьев Cacalia hastata определены действующие вещества, для которых разработаны методики качественного и количественного определения (органические кислоты и каротиноиды). В ходе товароведческого анализа разработаны числовые показатели сырья.
Введение
Род Какалия Cacalia L. семейство Астровые Asteraceae Dumort. включает около 50 видов [1]. В России и странах СНГ этот род представлен тремя рядами и объединяет шесть видов [2]. Название «Cacalia» взято у Диоскорида; тривиальное название недоспелка, гусиная лапка, тибетское - «ю-гу-шинг», японское -«yobusumaso» или «inudona», китайское - «shanjianzi», немецкое - «kakalia», английское - «cacalia», финское - «keihйsnauhus», мексиканское - «matarique» или «maturing».
Cacalia hastata (какалия копьевидная) - многолетнее корневищное травянистое растение высотой до 190 см, широко распространена в России; за рубежом встречается на севере Монголии, северо-востоке Китая, Корее, Японии, Северной Америке. C. hastata встречается в разреженных хвойных или мелколиственных лесах, изредка в борах; по опушкам смешанных лесов, в каменноберезниках и зарослях ольховника и кедрового стланика; на Дальнем Востоке - также в дубовых лесах, в кустарниковых зарослях, на лесных и приречных лугах, в горах, по речным долинам в лесном поясе, местами поднимается но нижней части альпийского пояса [3, 4].
В корнях C. hastata обнаружены алкалоиды (хастацин) [5, б]; сесквитерпены: какалохастин, дегидрокакалохастин, какалол, какалола ацетат, какалола сенециоилат, какалонол, б-метоксикакалонол, пероксикакалонол, какалолид, матуринон, тетрагидроматуринон, О-метилкакалоен, бр-пропионилокси-
1,10-фураноэремофилон, фукинон, дегидрофукинон, баккенолид А [7-11]; кофейная кислота, этилкофеат, кофеил-1-Р^-глюкопиранозид [10]. Химический состав листьев исследован недостаточно. В них обнаружены флавоноиды [12], дубильные вещества [13], аскорбиновая кислота, каротин, винная кислота и тартрат кальция [14].
На основании анализа данных литературы можно заключить, что для листьев Cacalia hastata отсутствуют сведения об углубленных исследованиях биологически активных веществ и существует необходимость в проведении расширенного химического изучения этого растения.
В практике тибетской медицины в Забайкалье при гнойных ранах, язвах в качестве ранозаживляющего, антиэкссудативного, гемостатического средства, а также при бронхитах применялись только листья
* Автор, с которым следует вести переписку.
С. hastata, известные под названием «ю-гу-шинг» [15-17], поэтому в задачи наших исследований входило изучение только этой части растения.
В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) разработан способ получения сухого экстракта из листьев какалии копьевидной, для которого установлена выраженная кардиопротекторная активность [18].
Согласно требованиям нормативной документации на лекарственное сырье - источника получения сухого экстракта, в данной работе приведены результаты определения числовых показателей товароведческого анализа, морфолого-анатомических признаков, качественного и количественного состава биологически активных веществ (БАВ) листьев.
Экспериментальная часть
Общие экспериментальные условия. Для проведения товароведческого анализа использовали сырье -листья С. hastata, собранные в трех районах республики Бурятия (Прибайкальский, Мухоршибирский, Заиграевский) в период с 1998 по 2002 г. Анализ проводился в 5 параллельных опытах для цельного, измельченного и порошкованного видов сырья. Отбор проб и проведение анализа производили в соответствии с требованиями ГФ XI [19]. Масса средней пробы составляла 400 г.
Внешние отличительные признаки устанавливались для цельного, измельченного и порошкованного сырья - листьев С. hastata. Анализ образцов проводили путем визуального осмотра, с помощью лупы и бинокуляра.
Анализируя цельное растительное сырье, готовили микропрепараты листа и черешка с поверхности, поперечные срезы листа и черешка, используя аналитическую пробу для определения подлинности, измельченности и содержания примесей. Микропрепараты готовили по стандартным методикам [19, 20]. Для анализа растительного сырья выбирали из аналитической пробы для определения подлинности, измельченности и содержания примесей крупные кусочки листа и черешка. Готовили микропрепараты аналогично микропрепаратам из цельного сырья. Из оставшейся части взятой на анализ пробы отсеивали фракцию крупного порошка через сито с отверстиями диаметром 2 мм. Готовили микропрепараты по методике приготовления микропрепаратов порошка [19, 20]. Готовые препараты изучали под микроскопом МБИ-3 (увеличения 7x1,5x10; 7x1,5x20; 15x1,5x10; 15x1,5x20). Результаты документировали
микрофотографиями с помощью фотоаппарата «Зенит» и микрофотонасадки МФН-12.
Качественный анализ проводили с использованием общепринятых методик [21, 22].
Количественный анализ проводили с применением следующих методик: хлорофиллы -
спектрофометрическая [22], углеводы - гравиметрическая [23], фенолокислоты - хроматоспектрофотометрическая [24, 25]; дубильные вещества - трилонометрическая [26], алкалоиды -гравиметрическая [6], тритерпеновые соединения - спектрофотометрическая [27], витамины В - хроматоспектрофотометрическая [6], кремний - спектрофотометрическая [28].
Для органических кислот, каротиноидов и аскорбиновой кислоты разработаны методики количественного определения.
Методика определения суммарного содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 5,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 100 мл воды очищенной, нагревают содержимое колбы на водяной бане до 70 °С и поддерживают эту температуру в течение часа. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл (У{) через бумажный фильтр, который промывают 10 мл воды очищенной и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А).
10 мл (У2) раствора А пропускают через ионообменную колонку, которую промывают 50 мл воды. Элюат и промывные воды переносят в стаканчик для потенциометрического титрования. Титрование проводят 0,1 н раствором №ОН до значения pH 7,0. Титр раствора №ОН устанавливают по гидрофталату калия.
Содержание суммы органических кислот (Х) в процентах в пересчете на яблочную кислоту и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
х _ Ушон • К • V • 0.0067 -100 -100 V • т • (100 - Ж) ,
где УтОН - объем 0,1 н №ОН, пошедшего на доведение pH исследуемого раствора до значения 7,0, мл; ¥\ -объем извлечения, мл (200 мл); V2 - объем пробы, пропущенной через ионообменную колонку, мл (10 мл); К - поправка на титр 0,01 н №ОН; 0,0067 - кислотный коэффициент - количество яблочной кислоты в г, соответствующее точно 1 мл 0,1 н №ОН; т - масса сырья, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Методика определения суммарного содержания каротиноидов в пересчете на Р-каротин. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 30 мл гексана, тщательно перемешивают на встряхивателе в течение 30 мин. После этого извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл (V) через бумажный фильтр, который промывают 10 мл гексана. Экстракцию повторяют дважды. Извлечения объединяют и доводят объем раствора в мерной колбе до метки гексаном.
Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют гексан.
Содержание суммы каротиноидов (Х) в мг% в пересчете на Р-каротин и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
х _ Б • V-100 • 100
X _--------------------,
2592 • т • (100 - Ж)
где Б - оптическая плотность исследуемого раствора; V- объем раствора, мл (100 мл); т - масса сырья, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %; 2592 - удельный показатель поглощения Е^%М Р-каротина
при длине волны 450 нм в гексане.
Методика определения аскорбиновой кислоты. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 5,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в фарфоровую ступку, где тщательно растирают с 5 г отмытого кварцевого песка, постепенно добавляя 200 мл воды, настаивают 10 мин. Затем смесь размешивают и фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Объем содержимого доводят до метки дистиллированной водой (VI) (раствор А).
0,5 мл раствора А (У2) наносят полосой на пластину 8Ии/о1 иУ254. Хроматографируют в системе растворителей этанол - уксусная кислота - вода (90 : 9 : 1) в темной камере. После того как фронт достигнет 15 см, пластину вынимают, высушивают при комнатной температуре. Хроматограмму обрабатывают 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 96% этаноле. После проявления зону снимают и элюируют 5 мл 70% этанола при комнатной температуре. Фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 мл. Элюирование повторяют дважды. Элюаты объединяют и доводят общий объем до метки 70% этанолом (У3).
Параллельно проводят опыт со стандартным раствором аскорбиновой кислоты (0,004% водный раствор) и контрольным образцом (пустой участок с хроматограммы). Измеряют оптическую плотность растворов при 720 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см.
Содержание аскорбиновой кислоты (Х) в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:
Б1 • 0,00004 • V У 100 100
X _----------------------------
Б0 • т •V2 • (100 - Ж)
где Бь Б0 - оптическая плотность исследуемого и стандартного растворов; 0,00004 - содержание аскорбиновой кислоты в стандартном растворе, г/мл; VI, V2, V3 - объемы растворов, мл; т - масса сырья, г; Ж - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Обсуждение результатов
Внешние признаки листьев Cacalia hastate.
Цельное сырье. Смесь цельных или частично измельченных листьев. Листья ширококопьевидные или широколанцетовидные, по краю равномерно мелкозубчатые или выемчато-зубчатые, с верхней стороны -голые, с нижней - голые или слабо волосисто-опушенные (бархатистые); черешки цилиндрические. В месте обрыва черешка видны остатки светлых жилок. Длина листа с черешком 20-2б см, ширина - 19-28 см. Цвет зеленый. Запах характерный слабый. Вкус горько-кислый, терпкий.
Измельченное сырье. Кусочки листьев различной формы, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм. Цвет зеленый. Запах характерный слабый. Вкус водного извлечения горько-кислый, терпкий.
Порошкованное сырье. Растертое сырье, проходящее сквозь сито с диаметром отверстий 2,0 мм. Цвет зеленый. Запах характерный слабый. Вкус водного извлечения горько-кислый, терпкий.
Микроскопическое исследование листьев Cacalia hastate.
Цельное сырье. При рассмотрении листа какалии копьевидной с поверхности обнаруживаются клетки эпидермиса с верхней стороны листа со стенками от слабоизвилистых (у основания листа и вблизи жилок) до сильноизвилистых (длиной 83-175 мкм, шириной 25-125 мкм); с нижней стороны клетки с сильно извилистыми стенками (длиной 50-150 мкм, шириной 17-117 мкм). Устьица окружены 4-8 околоустьичными клетками (аномоцитного типа), овальные, выступающие над поверхностью листа (длиной 42-58 мкм, шириной 33-42 мкм), встречаются с нижней стороны листа с частотой встречаемости 43-87 на 1 мм2 (с верхней стороны отсутствуют). Над жилками клетки эпидермиса вытянутые прямоугольноверетеновидной формы с прямыми и слабоизвилистыми стенками. Кутикула на протяжении всей пластинки листа ровная, по краю листа и вдоль жилок - продольно-морщинистая. С нижней стороны листа могут наблюдаться простые многоклеточные (содержащие до 12 клеток) тупоконусовидные тонкостенные волоски с гладкой поверхностью, с узкой конечной клеткой (длиной от 100 и свыше 1000 мкм), нередко стенки клеток волосков спадаются (рис.1 А, 1Б). Наиболее часто волоски встречаются вдоль жилок. Частота встречаемости описываемых волосков в различных анализируемых образцах листьев разная - некоторые из них имеют голую поверхность, некоторые слабо-опушенную, другие - более выраженную опушенность (с частотой встречаемости от 35 до 157 волосков на 1 мм2). По краю листа и жилкам с верхней и нижней стороны листа наблюдаются простые многоклеточные толстостенные тупоконусовидные волоски (рис. 1В), некоторые из них с многоклеточными основаниями. У основания волоска и на протяжении 1-2 нижних его клеток кутикула продольно-морщинистая. Толстостенные волоски имеют более короткие клетки, чем тонкостенные. Толстостенные волоски наблюдаются во всех образцах, даже в тех, в которых отсутствуют тонкостенные волоски. У основания некоторых волосков клетки эпидермиса образуют розетки. Волоски нередко обламываются, оставляя места своего прикрепления с начальной клеткой волоска, имеющей продольно-морщинистую кутикулу. По краю листа могут встречаться сосочковидные невысокие плоские выросты с морщинистой кутикулой (рис. б). Вдоль жилок обнаруживаются небольшие тяжи с секретом (рис. 1), не окрашивающимся суданом III (отсутствуют жирное, эфирное масло) и метиленовым синим (отсутствуют слизи), кроме того, сквозь эпидермис в мезофилле обильно просвечивают небольшие капельки секреторного характера (рис.1Г), также не реагирующие на указанные реактивы. Лист дорсовентрального строения (рис.1Г). Мезофилл состоит из одного - двух рядов палисадной паренхимы и трех-семи рядов губчатой паренхимы, состоящей из клеток округлой и округло-лопастной формы, образующих аэренхиму, характерно просвечивающую сквозь эпидермис, при рассмотрении листа с поверхности. Жилка представлена одним или несколькими закрытыми коллатеральными пучками; со стороны флоэмы и ксилемы располагается уголковая колленхима. Под эпидермисом в области жилки с верхней и нижней стороны листа наблюдается уголковая колленхима (в зависимости от толщины жилки: 1-4 ряда - с верхней стороны; 0-2 ряда - с нижней).
Эпидермис черешка представлен вытянутыми клетками (длиной 58-192 мкм, шириной 12-30 мкм) почти прямоугольной и прямоугольно-веретеновидной формы с ровными стенками. Кутикула продольноморщинистая. Устьица такие же, как на поверхности листа (длиной 45-б7 мкм, шириной 29-37 мкм), встречаются с частотой 0-87 на 1 мм2. Редко наблюдаются простые тупоконусовидные многоклеточные толстостенные волоски. На протяжении 1-2 нижних клеток волоска кутикула продольно-морщинистая. Волоски нередко обламываются, оставляя места своего прикрепления с начальной клеткой волоска. Структура прилегающих с обеих сторон черешка узких полос листовой пластинки аналогична структуре листа. На поперечном срезе
черешка видны несколько проводящих пучков - более десяти. Проводящие пучки различного строения: коллатеральные закрытые, открытые и с частично выраженным камбием; а также концентрические с флоэмой в центре пучка (амфивазальные) (рис. 1Д). Некоторые пучки объединяются в группы, образуя цепочки пучков. В коллатеральных пучках со стороны флоэмы и ксилемы располагается уголковая колленхима, в некоторых пучках колленхима отсутствует. Под эпидермисом по всей окружности черешка расположены 1-4 ряда уголковой колленхимы.
Измельченное сырье. Наблюдаемые анатомические признаки аналогичны признакам цельного сырья.
Рис. 1. Фрагменты анатомического строения листа какали копьевидной. А, Б - простые многоклеточные тонкостенные волоски на нижней эпидерме листа (ув. x100); В - простые многоклеточные толстостенные волоски по краю листа (ув. x200); Г - фрагмент поперечного среза листа (ув. x250); Д - фрагмент поперечного среза черешка (ув. x200).
Порошкованное сырье. Микропрепараты порошкованного лекарственного сырья под микроскопом представляют собой смесь обрывков эпидермиса листа со стенками клеток эпидермиса от слабоизвилистых до сильноизвилистых, с устьицами аномоцитного типа (4-8 околоустьичных клеток) и без них; обрывков листа с простыми многоклеточными тупоконусовидными тонкостенными волосками с гладкой поверхностью, с узкой конечной клеткой, нередко со спадшимися стенками клеток; обрывков листа с простыми многоклеточными толстостенными тупоконусовидными волосками с многоклеточными основаниями и без них, с продольноморщинистой кутикулой на протяжении 1-2 нижних клеток, с розетками из клеток эпидермиса у основания и без них; обрывков листа с обломанными волосками и вместо них местами прикрепления волосков и начальной клеткой волоска, имеющей продольно-морщинистую кутикулу; обрывков края листа с сосочковидными невысокими плоскими выростами с морщинистой кутикулой (редко); обрывков листа с небольшими тяжами с секретом вдоль жилок и обильно просвечивающими небольшими капельками секрета в мезофилле, не окрашивающимися суданом III и метиленовым синим; обрывков черешка и жилки с клетками эпидермиса почти прямоугольной и прямоугольно-веретеновидной формы с ровными стенками, продольно-морщинистой кутикулой, устьицами аномоцитного типа и без них, редко с простыми многоклеточными тупоконусовидными толстостенными волосками.
Товароведческий анализ листьев Cacalia hastate. На основании проведенного анализа рекомендуем установить следующие показатели качества. В таблице 1 приведены результаты анализа для измельченного сырья.
Цельное сырье. Органических кислот в пересчете на яблочную кислоту не менее 8%; каротиноидов в пересчете на Р-каротин не менее 200 мг%; влажность не более 10%; золы общей не более 10%; золы, нерастворимой в 10% соляной кислоте, не более 5%; листьев побуревших и почерневших не более 5%; листьев с черешками длиннее 5 см не более 8%; отдельных черешков не более 3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, не более 7%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 0,5%.
Измельченное сырье. Органических кислот в пересчете на яблочную кислоту не менее 8%; каротиноидов в пересчете на Р-каротин не менее 200 мг%; влажность не более 10%; золы общей не более 10%; золы, нерастворимой в 10% соляной кислоте, не более 5%; листьев побуревших и почерневших не более 5%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, не более 5%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 0,5%.
Порошкованное сырье. Органических кислот в пересчете на яблочную кислоту не менее 8%; каротиноидов в пересчете на Р-каротин не менее 200 мг%; влажность не более 10%; золы общей не более 10%; золы, нерастворимой в 10% соляной кислоте, не более 5%; листьев побуревших и почерневших не более 5%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 0,5%.
БАВ листьев Cacalia hastate. Результаты качественного и количественного анализа листьев C. hastata приведены в таблице 2.
Таблица 1. Результаты товароведческого анализа листьев Cacalia hastata (измельченное сырье)
Район и год сбора Содержание суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, % Содержание каротиноидов в пересчете на Р-каротин, мг% Влажность, % Зола общая, % Зола, нерастворимая в 10 % HCl, % Листьев побуревших и почерневших, % Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, % Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, % % % А с е име & 1 с е га р О % % А с е ме и р п S н ь ра jD
Прибайкальский, 1998 10,24 300,63 6,26 7,71 3,28 3,12 8,45 2,12 0,45 0,15
Прибайкальский, 1999 11,56 254,16 7,23 7,75 3,09 1,21 3,12 3,11 0,62 0,12
Мухоршибирский, 2000 10,02 312,47 6,00 7,35 2,97 0,34 7,16 2,59 0,89 0,22
Прибайкальский, 2000 13,30 314,74 8,10 8,23 3,68 3,88 5,86 2,88 0,88 0,19
Мухоршибирский, 2001 9,06 286,01 7,37 7,01 3,48 3,21 6,45 2,36 0,53 0,31
Прибайкальский, 2001 12,57 257,64 6,80 8,23 3,54 2,01 5,70 1,91 0,52 0,28
Заиграевский, 2002 8,24 300,58 5,97 7,28 2,79 0,87 8,89 3,97 0,41 0,19
Мухоршибирский, 2002 10,98 306,12 6,37 8,89 3,16 0,94 8,03 3,44 0,64 0,23
Таблица 2. БАВ листьев Cacalia hastata
Группа БАВ Компоненты Содержание, % абс.-сухое сырье
Органические кислоты винная, лимонная, фумаровая, 8,24-13,30
щавелевая, яблочная, янтарная
Углеводы свободные сахара (фруктоза, глюкоза, 2,55-2,62
галактоза)
водорастворимые полисахариды 6,02-6,10
пектиновые вещества 10,10-10,25
гемицеллюлозы А 8,94-9,10
Б 4,68-4,79
Каротиноиды а-каротин, Р-каротин, лютеин, зеаксантин, виолаксантин, неоксантин 254,16-314,74 мг%
Хлорофиллы хлорофилл а, хлорофилл Ь,
феофитин а, феофитин Ь, феофорбид а, феофорбид Ь 1,06-1,42
Фенолокислоты хлорогеновая кислота 0,84-1,05
кофейная кислота 0,34-0,38
галловая кислота 0,30-0,33
Флавоноиды кверцетин, кемпферол 0,28-0,30
Кумарины умбеллиферон, скополетин, эскулетин пе определялось
Дубильные вещества 6,20-8,52
Алкалоиды хастацин 0,20-0,27
Тритерпеновые соединения олеаноловая кислота 0,70-0,92
Витамины аскорбиновая кислота 0,74-1,24
тиамин 2,20-2,48 мг%
рибофлавин 2,99-3,39 мг%
Кремний 2,04-3,56
Аминокислоты присутствуют
Антраценпроизводные, иридоиды, сердечные гликозиды пе обнаружены
Фитохимический анализ показал, что C. hastata является накопителем органических кислот, каротиноидов, полисахаридов и солей кремния. При фармакологическом скрининге извлечений установлено, что водная (ВФ) и гексановая фракции (ГФ) листьев обладают кардиопротекторной активностью, равно как и сухой экстракт.
Доминирующими компонентами ВФ являются органические кислоты, а ГВ - каротиноиды. Фармакологическое исследование суммы органических кислот (СОК) листьев C. hastata, выделенной из ВФ, также показало ее выраженную кардиопротекторную активность [29]. Установлено, что при введении СОК животным отмечается снижение степени повреждающего эффекта катехоламинов, что характеризовалось меньшей активностью кардиоселективных ферментов в сыворотке крови по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. По данным ЭКГ в опытных группах уменьшалось число экстрасистол в 3 и 4 раза, были менее выраженными признаки ишемии миокарда по сравнению с контролем. Также наблюдается гипокоагуляция, вследствие возможного полного дефицита факторов XII, XI, IX, VIII, а также X, V, II или избытка быстродействующих антикоагулянтов. Ранее было установлено ингибирующее влияние каротиноидов на процессы свободнорадикального окисления, одним из последствий которого является патология сердечно-сосудистой системы [30]. Поэтому в качестве действующих веществ при стандартизации листьев C. hastata нами были выбраны органические кислоты и каротиноиды.
Стандартизация листьев Cacalia hastate. Согласно требованиям по составлению нормативной документации на растительное сырье любая фармакопейная статья должна предлагать методики качественного обнаружения и количественного определения БАВ.
Для определения подлинности листьев C. hastata предложено хроматографическое определение органических кислот (ТСХ, Silufol UV254, 96% этанол - концентрированный раствор аммиака - вода (60:10:3) - на хроматограмме должно быть не менее четырех пятен коричневого цвета) и каротиноидов (ТСХ, Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ, хлороформ - этиловый спирт (19 : 1) - на хроматограмме должно быть не менее 3 пятен синего цвета на желто-зеленом фоне), а также реакция Карра-Прайтса на каротины
гексанового извлечения с хлоридом сурьмы, основанная на образовании окрашенного в синий цвет комплексного соединения.
Для количественного определения органических кислот разработан потенциотитриметрический метод, основанный на реакции нейтрализации органических кислот раствором гидроксида натрия с потенциометрическим способом установления точки эквивалентности. Известные методики, в том числе и фармакопейная, для установления количественного содержания кислот используют метод титрования водного экстракта раствором щелочи, применяя в качестве аналитического сигнала смену окраски индикатора. При кажущейся простоте и воспроизводимости этих методик следует помнить, что на полученные результаты оказывает влияние так называемая индикаторная ошибка титрования -погрешность, обусловленная несовпадением показателя титрования индикатора с величиной pH в точке эквивалентности [31], которую авторы ряда методик не учитывают. Кроме того, во время титрования бесцветных растворов цвет индикаторов совпадает с реальным, но при исследовании окрашенных растворов, какими являются растительные экстракты, окраска индикаторов изменяется, иногда настолько, что трудно установить, достигнута ли точка эквивалентности. Поэтому визуальное установление точки эквивалентности не может быть объективным. Потенциометрическое титрование позволяет адекватно устанавливать положение точки эквивалентности (pH 7,0), к тому же устраняется возможность возникновения индикаторной ошибки титрования. Проведенные нами исследования по изучению химического состава листьев С. кси1а1а показали, что титрование, используемое в фармакопейной методике определения органических кислот, имеет высокий процент ошибки. В качестве стандартного вещества была выбрана яблочная кислота, так как она является преобладающей в листьях какалии копьевидной.
При разработке методики количественного определения органических кислот было исследовано влияние различных параметров на выход суммы органических кислот. В результате проведенных исследований установлены оптимальные параметры экстракции: экстрагент - вода, температура - 100 °С, степень измельчения сырья - 0,5 мм, соотношение сырье: экстрагент - 1 : 20, кратность - однократная.
Отсутствие систематической ошибки методики доказано серией опытов с добавками яблочной кислоты. Относительная ошибка единичного определения не превышает случайной ошибки методики (табл. 3). Метрологические характеристики метода представлены в таблице 4.
Для количественного определения суммы каротиноидов разработана спектрофотометрическая методика, включающая трехкратную экстракцию сырья гексаном с последующим
спектрофотометрированием гексанового извлечения. Спектр поглощения гексанового извлечения представлен на рисунке 2. В качестве стандартного вещества был выбран Р-каротин, так как максимум оптической плотности извлечения близок к максимуму Р-каротина.
Оптимальными условиями для методики количественного определения каротиноидов были выбраны следующие: экстрагент гексан, температура экстракции - 20-22 °С, степень измельчения - 0,5-1,0 мм, соотношение сырье : экстрагент - 1 : 30, время экстракции - 30 мин, кратность экстракции - трехкратная.
Отсутствие систематической ошибки методики доказано серией опытов с добавками Р-каротина. Относительная ошибка единичного определения не превышает случайной ошибки методики (табл. 5). Метрологические характеристики метода представлены в таблице 6.
Таблица 3. Результаты определения органических кислот в листьях Cacalia hastate с добавками яблочной кислоты
№ пробы Содержание суммы органических кислот в аликвоте, мг яблочной кислоты Добавлено яблочной кислоты, мг Теоретическое содержание суммы органических кислот, мг яблочной кислоты Найдено органических кислот, мг яблочной кислоты Относительная ошибка, %
1 22,5 73,0 95,5 94,5 -1,05
2 14,2 138,0 152,2 153,б +0,92
3 20,2 103,0 123,2 121,7 -1,22
Таблица 4. Метрологические характеристики методики количественного определения суммы органических кислот в листьях Сасаііа каііаїа
f x S2 Sx P t(p,f) ±Д x E
б 7,15 1,510-2 0,бб10-2 95% 2,57 1,б910-2 0,43
Рис. 2. Спектры поглощения гексанового извлечения из листьев Сасаііа каііаїа и Р-каротина
\Чауе1е1дЫ, пт
Таблица 5. Результаты определения суммы каротиноидов в листьях Сасаііа hastata с добавками р-каротина
№ пробы Содержание суммы каротиноидов в аликвоте, мг Р-каротина Добавлено Р-каротина, мг Теоретическое содержание суммы каротиноидов, мг Р-каротина Найдено каротиноидов, мг Р-каротина Относительная ошибка, %
1 16,12 8,00 24,12 24,36 +1,00
2 27,98 12,00 39,98 38,56 -3,55
3 34,03 15,00 49,03 47,73 -2,65
Таблица 6. Метрологические характеристики методики количественного определения суммы каротиноидов в листьях Сасаііа hastata
Д X Б2 Бх Р ФД) ±Д X Е
6 254.56 5.19 2.12 95 % 2.57 5.45 2.14
Полученные результаты использованы для разработки и составления нормативной документации на листья какалии копьевидной (Фармакопейная статья предприятия «Листья какалии копьевидной», Инструкция по сбору и сушке листьев какалии копьевидной).
Выводы
Проведен фармакогностический анализ листьев какалии копьевидной (СасаНа hastata), в ходе которого выявлены диагностические признаки, включающие характер клеток эпидермиса, устьица аномоцитного типа с нижней стороны листа, простые многоклеточные волоски с гладкой поверхностью, с узкой конечной клеткой, а также простые многоклеточные толстостенные тупоконусовидные волоски, сосочковидные невысокие плоские выросты с морщинистой кутикулой по краю листа, небольшие тяжи с секретом вдоль жилок и обилие капелек секреторного характера в мезофилле, не реагирующие на судан III и метиленовый синий и др.
Установлено, что в состав листьев СасаНа hastata входят различные группы БАВ: органические кислоты (до 13%), каротиноиды (до 314 мг%), хлорофиллы, углеводы, фенолокислоты, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, алкалоиды, тритерпены, витамины.
Для стандартизации сырья определены действующие вещества, для которых разработаны методики качественного и количественного определения (органические кислоты и каротиноиды).
В ходе товароведческого анализа разработаны числовые показатели сырья.
Список литературы
1. Недоснелка - Cacalia L. / Сосудистые растения Советского Дальнего Востока. Т. б: Астровые (Сложноцветные). СПб., 1992. С. 208-214.
2. Бойко Э.В. К систематике дальневосточных видов рода Cacalia L. (Asteraceae) // Ботанический журнал. 1978. Т. б3. №10. С. 1513-1515.
3. Верещагин В.И. Полезные растения Западной Сибири / В.И. Верещагин, К.А.Соболевская, А.И. Якубова. М., Л., 1959. 217 с.
4. Флора Центральной Сибири. Т. II:. Розоцветные - Астровые / Ред. Л.И. Малышева, Г. А. Пешкова. Новосибирск, 1979. 314 с.
5. Орехов А.П. Итоги ориентировочного обследования растений СССР на содержание алкалоидов. Сообщение 1 // Химико-фармацевтическая промышленность. 1934. №б. С. 3-10.
6. Коновалов В.С., Меньшиков Г.П. Исследование алкалоидов Cacalia hastata // Журнал общей химии. 1945. Т. XV. Вып. 4-5. С. 328-331.
7. Hayashi K., Nakamura H., Mitsuhashi H. Sesquiterpenes from Cacalia hastata // Phytochemistry. 1973. V. 12. P. 2931-2933.
8. Naya K., Miyoshi Y., Mori H., Takai K., Nakanishi M. Sesquiterpenes of Cacalia species // Chemistry Letters. 197б. P. 73-7б.
9. Romo J., Joseph-Nathan P. The Constituents of Cacalia decomposita A. Grey. Structures of Cacalol and Cacalone // Tetrahedron. 19б4. V. 20. P. 2331-2337.
10. Красовская Н.П., Кулеш Н.И., Денисенко В.А. Природные антиоксиданты. Фураноэремофиланы из корней Cacalia // Химия природных соединений. 1989. №5. C. б43-б4б.
11. Naya K., Takagi I., Kawagushi Y., Asada Y., Hirose Y., Shinoda N. The Structure of Fukinone, a Constituent of Petatesites japonicus Maxim // Tetrahedron. 19б8. V. 24. P. 5871-5879.
12. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск, 1978. 310 с.
13. Шретер А.И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока / А.И. Шретер. М., 1975. 342 с.
14. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae / Ред. П.Д. Соколов. СПб., 1993. 25б с.
15. Асеева Т. А. Теоретические и методические аспекты использования ЭВМ в изучении лекарствоведения тибетской медицины: Дис. ... докт. фарм. наук. М., 1992.
16. Дэсрид Санжай Чжамсо. Вайдурья-онбо: Ксилограф на тиб. языке. Агинский дацан. Т. 2. С. 1б88-1б89. 312 л.
17. Гаммерман А.Ф., Семичов Б.В. Словарь тибетско-латино-русских названий лекарственного сырья, применяемого в тибетской медицине. Улан-Удэ, 19б3. 210 с.
18. Заявка на патент России №2003114548/14 (015239). Способ получения средства, обладающего кардиопротекторной активностью / Д.Н. Оленников, С.М. Николаев, А.В. Цыренжапов, Г.Г. Николаева и др. (Заявл. 15.05.2003).
19. Государственная фармакопея СССРМ., 1990. . Вып.1, 2.
20. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Практикум но фармакогнозии. М., 19бб. 312 с.
21. Методы биохимического анализа растений / Под ред. В.В. Полевого, Г.Б. Максимова. Л., 1978. 401 с.
22. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Л., 1987. 355 с.
23. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Цыренжапов А.В. и др. Биологически активные вещества листьев Cacalia hastata L. Сообщение 1. Углеводы листьев Cacalia hastata L. и их гипогликемическая активность // Химия природных соединений. 2004. №1. С. 4-9.
24. Занрометов М.Н. Применение реактива Фолина для количественного определения фенольных соединений методом хроматографии на бумаге // Физиология растений. 19б2. Т. 9. Вып. 3. С. 389-392.
25. Мжаванадзе В.В., Таргамадзе И.Л., Драник Л.И. Количественное определение хлорогеновой кислоты в листьях черники кавказской // Сообщения АН Грузинской ССР. 1971. Т. б3. №1. С. 205-207.
26. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевича, Л.Н. Сафронича. М., 1983. 221 с.
27. Генкина Г.Л., Мжельская Л.Г., Шакиров Т.Т., Абубакиров Н.К. Спектрофотометрия гликозидов олеаноловой кислоты и хедерагенина в концентрированной серной кислоте // Химия природных соединений. 1977. №2. С. 220-227.
28. Колесников М.П., Абатуров Б.Д. Формы кремния в растительном материале и их количественное определение // Успехи современной биологии. 1997. Т. 117. Вып. 5. С. 534-547.
29. Оленников Д.Н., Цыренжапов А.В., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г. и др. Кардиопротекторное действие органических кислот листьев Cacalia hastata L. / Здоровье и образование в XXI веке: Мат. IV Междунар. науч.-практ. конф. М., 2003. С. 4б7-4б8.
30. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л., 1985. 230 с.
31. Основы аналитической химии / Под ред. Ю.А. Золотова М., 2002. Т. 1. 351 с.
Поступило в редакцию 8 февраля 2004 г. После переработки J5 августа 2004 г.
