CC BY
38
УДК 579.26
Л.С. Пан, О.А. Широкова, Г.А. Козлова
Пермский государственный технический университет
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АККУМУЛИРУЮЩУЮ СПОСОБНОСТЬ ЦЕЗИЯ ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Выделена культура почвенных микроорганизмов, по морфологическим признакам близкая к бактериям рода Яко^соссш и обладающая аккумулирующей способностью по отношению к ионам цезия. Определены оптимальные условия для извлечения цезия из растворов.
Интенсивное развитие таких отраслей ядерной промышленности, как добыча и переработка ядерного топлива, атомная энергетика и реак-торостроение, захоронение радиоактивных отходов, а также проведение взрывов мирного и военного характера привели к крупномасштабному выбросу долгоживущих радиоизотопов цезия в экосистемы. Наиболее опасным в биологическом аспекте загрязнителем является изотоп цезия-137, который относят к «глобальным» радионуклидам, т.е. радионуклидам, довольно быстро распространяющимся в биосфере.
Цезий-137 - долгоживущий радионуклид, период его полураспада составляет 30 лет. Цезий-137 является вторым после стронция-90 по опасности для человека. Длительный период полураспада цезия, высокая растворимость в воде его солей, сходство с физико-химическими свойствами калия обусловливают высокую биодоступность цезия в течение многих десятилетий после выброса в природную среду. Он активно накапливается растениями, попадает в пищевые продукты и быстро всасывается в стенки желудочно-кишечного тракта.
Новый всплеск интереса к судьбе данного радионуклида произошел после аварии на Чернобыльской АЭС, в результате которой значительная часть территории Белоруссии была загрязнена радионуклидами, в том числе и водосборы рек. Значительный урон был нанесен хозяйству многих европейских государств: Австрии, Германии, Италии, Польше, России, Украине, Финляндии, Швеции.
На сегодняшний день на предприятии «Маяк» в Челябинской области существует проблема утилизации низкоконцентрированных радиоактивных отходов.
При выделении изотопов цезия из высококонцентрированных стоков, содержащих также высокие концентрации близких по свойствам ионов натрия и калия, применяют селективные ферроцианидные сорбенты. Однако они являются достаточно дорогостоящими и применение их для очистки низкоконцентрированных сточных вод экономически нецелесообразно. В связи с этим целесообразно совершенствование традиционных физико-химических методов извлечения радиоактивных элементов, а также поиск альтернативных технологий, в том числе основанных на использовании микроорганизмов [1].
Химическое сходство с ионами калия и некоторыми другими моновалентными катионами является ключевым фактором, определяющим высокую мобильность и доступность цезия в биологических системах. Атомные и ионные радиусы калия, аммония и цезия достаточно схожи, чтобы расположенные на клеточных мембранах микроорганизмов менее селективные системы транспорта могли разграничивать однозарядные ионы друг от друга.
Было обнаружено, что аккумуляция цезия, как правило, сопровождается стехиометрическим выходом ионов калия из клетки. По предположению S.V. Avery [2], в этом есть некая уникальность свойств цезия, проявляющаяся в его способности накапливаться внутри клетки в обмен на моновалентный катион калия.
Имеются данные о поглощении цезия грибами, дрожжами. В большинстве известных работ, касающихся экологических аспектов взаимодействия микроорганизмов и цезия, в основном, изучается возможность использования неживых клеток в качестве перспективных сорбентов для извлечения Cs [1, 3] и достаточно мало данных об активной аккумуляции цезия бактериями.
На основе анализа литературных данных нами сделан вывод об актуальности исследований с целью выделения культуры бактерий, способной извлекать цезий из растворов и определения оптимальных условий для аккумуляции цезия.
В настоящее время все большую экологическую значимость приобретают актинобактерии рода Rhodococcus sensu stricto, обладающие большим функциональным разнообразием, комплексом метаболических возможностей для выживания и занимающие нередко доминирующее положение в экстремальных местообитаниях [4].
Екойососст sen.su stricto относятся к нефтеокисляющим микроорганизмам. Поэтому выделение бактерий, способных к извлечению и аккумуляции цезия, проводили из почвы, отобранной около автостоянки (предполагалось наличие в ней нефтепродуктов), на среде М9, элективной для бактерий рода Якоёососст [8].
Для изучения способности выделенных культур поглощать и извлекать цезий из растворов в колбу с питательной средой вносили биомассу, добавляли раствор хлорида цезия и устанавливали колбу на орбитальные шейкеры при скорости 140 об/мин и температуре 28 °С.
Определение цезия в культуральной жидкости проводили с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра типа ААБ-ЭО. Степень извлечения цезия рассчитывали по формуле
а = -
- С
С
•100 %,
где Снач - исходная концентрация; Скон - конечная концентрация ионов цезия в среде культивирования.
В результате проведенных экспериментов по получению накопительной и чистой культуры удалось выделить Э вида колоний, отличающихся морфологическими признаками. Все виды бактерий были исследованы на способность извлекать цезий из растворов. Результаты эксперимента приведены на рис. 1. Оказалось, что только одна из культур способна извлекать цезий из растворов, в то время как две другие не проявили данной активности.
Рис. 1. Степень извлечения цезия различными группами микроорганизмов
Для дальнейших экспериментов были выбраны колонии красного цвета, округлой формы, с гладкой блестящей поверхностью, ровным гладким краем, однородной консистенции, профиль колоний выпуклый. Бактерии относятся к аэробам, коккам, граммположительным, спорообразующим. По морфологическим признакам близки к бактериям рода Вкойососсж.
Клетки микроорганизмов в каждой фазе роста могут обладать различной поглотительной способностью по отношению к цезию. Поэтому в первую очередь построили кривую роста и при наращивании биомассы для проведения дальнейших экспериментов по полученному графику определяли фазу роста культуры. Изменение оптической плотности (П) от времени наращивания биомассы приведено на рис. 2.
Рис. 2. Кривая роста выделенной культуры
Наиболее оптимальное время наращивания биомассы в лабораторных условиях - 24 ч. По кривой роста определили, что через данный промежуток времени клетки находятся в стационарной фазе роста, характеризующейся наибольшей их устойчивостью к действию неблагоприятных внешних факторов. В дальнейших экспериментах биомассу наращивали в течение данного времени.
Итак, нам удалось выделить культуру почвенных бактерий, способных аккумулировать цезий. Целью дальнейших исследований являлось определение оптимальных условий для извлечения цезия выделенными микроорганизмами.
На степень извлечения цезия бактериями влияет температура, pH среды, вид источника углерода в среде, концентрация ионов цезия и соотношение концентраций ионов калия и цезия в растворе.
Изучение влияния температуры культивирования на эффективность процесса аккумуляции цезия клетками выделенной культуры показало, что в условиях проведенного эксперимента максимальное извлечение цезия наблюдается при температуре 28 °С, что совпадает с температурным оптимумом для роста культуры (рис. 3, а), так как большинство почвенных бактерий мезофильны.
Одним из важных условий для проявления жизнедеятельности микроорганизмов является активная кислотность среды, которую выражают величиной рН. Проведенные исследования показали, что процесс поглощения Сб+ протекает в широком диапазоне кислотности среды. Как видно на рис. 3, б, поглощающая способность выделенной культуры увеличивается с ростом pH. Наибольшая степень поглощения наблюдается в диапазоне значений рН 7,0-8,0.
Рис. 3. Влияние температуры (а) и рН (б) на аккумулирующую способность клеток
В литературе имеются данные о том, что наибольшей поглотительной способностью по отношению к цезию обладают клетки бактерий Rhodococcus.ruЪer, выращенные на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода н-гексадекан [5]. Представляло интерес изучить влияние источника углерода в среде на аккумулирующую способность выделенной культуры.
Для этого провели 2 параллельных эксперимента - в первом случае в качестве источника углерода использовали ацетат натрия (среда М9), во втором случае - н-гексадекан, из расчета 1,0 % по объему.
Для проведения эксперимента с н-гексадеканом культуру предварительно адаптировали - выращивали на твердой среде, содержащей данный источник углерода. Результаты эксперимента приведены на рис. 4.
к 80
I 70 « 60 х 50
а>
5 40
I 30 к -а К И и о н
и
20
10
0
г
— — -
Г н
□ 1 □ 2
23 24 25 44
Время, ч
Рис. 4. Сравнение аккумулирующей способности клеток бактерий, выращенных на средах с разными источниками углерода:
1 - ацетат натрия; 2 - н-гексадекан
Как видно по диаграмме, клетки, выращенные на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода ацетат натрия, обладают наилучшей поглотительной способностью по отношению к цезию и способны удерживать его в течение более длительного времени. Для дальнейших экспериментов использовали ацетат натрия.
Влияние концентрации цезия в среде на скорость роста биомассы и его аккумулирующую способность рассматривали в интервале концентраций СбС1 0,5-1,5 мМ.
Результаты эксперимента по определению наиболее оптимальной концентрации цезия в среде приведены на рис. 5, 6.
Рис. 5. Зависимость прироста биомассы от концентрации цезия в среде: 1 - 0,5 мМ; 2 - 1,0 мМ; 3 - 1,5 мМ
о4
к
К
со
о
а
к
я
я
<и
№
о
ч
«
со
Я
Л
я
о
я
<и
н
О
80
70
60
50
40
30
20
10
0
п
п —1_
ш ш ““ II
4 23
Время, ч
24 25
26
□ 3
Рис. 6. Зависимость аккумулирующей способности клеток от концентрации цезия в среде: 1 - 0,5 мМ; 2 - 1,0 мМ; 3 - 1,5 мМ
Максимальная степень поглощения цезия наблюдается при концентрации ионов цезия 0,5—1,0 мМ в среде. Более высокие концентрации цезия ингибируют рост микроорганизмов и процесс поглощения цезия.
Высокое поглощение радионуклидов бактериями и водорослями достигается лишь при контроле состава ионов в растворе. Оказалось [6], что ионы калия и рубидия влияют на поглощение Сб-137 клетками СЫоге11а и степень извлечения радиоактивного цезия из жидких отходов будет зависеть от концентрации калия в воде.
Калий - метаболит для микроорганизмов и водорослей. Они могут потреблять большое количество цезия, но он не способен заменить в метаболизме его на калий. Если в среде присутствует только цезий и нет калия, то будет наблюдаться маленький рост микроорганизмов и водорослей [7]. Поэтому нами выполнено исследование влияния концентрации ионов калия в среде на степень извлечения цезия выделенными микроорганизмами. По результатам исследования выявлено, что наибольшее поглощение цезия происходит при эквивалентном содержании данных ионов в растворе (рис. 7, 8). Если концентрация калия в среде выше, то клетки преимущественно поглощают его как жизненно важный элемент. Концентрации цезия, более высокие по сравнению с калием, однако, не приводят к повышению степени извлечения цезия и, судя по всему, оказываются токсичными.
Рис. 7. Кривые роста выделенной культуры при различном соотношении концентраций ионов калия и цезия в среде: 1 - 2:1; 2 - 1:1; 3 - 1:2
Рис. 8. Зависимость степени извлечения цезия от соотношения концентраций ионов калия и цезия в среде: 1 - 1:1; 2 - 1:2; 3 - 2:1
Таким образом, из почвы выделена культура бактерий, способная извлекать цезий из растворов. По морфологическим признакам она близка к бактериям рода Rhodococcus. По результатам сравнительного анализа опытов, проведенных еще с двумя почвенными культурами, установлено, что клетки выделенной культуры могут не только служить сорбентом для цезия, но и способны к активной аккумуляции, в то время как клетки других культур не обладают аккумулирующей способностью. Определены оптимальные условия для аккумуляции цезия: pH 7, Т = 28 °С, скорость обращения орбитальных шейкеров 130-140 об/мин, источник углерода в среде - ацетат натрия, эквивалентное содержание ионов калия и цезия в среде в диапазоне 0,5-1,0 мМ.
Список литературы
1. Tomioka N., Uchiyama H., Yagi O. Isolation and characterization of Cesium - Accumulating Bacteria//Environmental Microbiology. May 1992. Р. 1019-1023.
2. Avery S.V. Cesinm accumulation by microorganisms: uptake mechanisms, cation competition, compartmentalization and toxicity//J.Ind. Microbiol. 1995. V.14. P. 76-84.
3. Хворычев М.П., Мареев И.Ю., Помыткин В.Ф. Изучение сорбирующей способности биомассы микроорганизмов по отношению к некоторым радионуклидам // Микробиология. 1994. Т. 63, вып. 1. С. 145-151.
4. Ившина И.Б., Пешкур Т.А. Эффективное извлечение цезия клетками бактерий рода Rhodococcus // Микробиология. 2002. Т.71, №3. С. 418-423.
5. Ившина И.Б., Пешкур Т.А. Особенности аккумуляции цезия бактериальными клетками Rhodococcus Ruber при росте на н-гексадекане // Экология. 2003. №1. С. 69-71.
6. Gadd G.M. Accumulation of metals by microorganisms and algae // Biotechnology a comprehensive treatise Special Microbial Processes / Ed Rehm H. - J. Weinheim VCK Verlagsgesellschaft, 1988. V. 6 b. P.401-433.
7. Morgan L.O. Biological accumulation of inorganic materials by algae. N.Y., 1993.
8. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1978. 350 с.
Получено 17.06.2009
