CC BY
110
ТОМ 5
НОМЕР 4
201 2
КЛИНИЧЕСКАЯ
ОНКО ГЕМАТОЛОГИЯ
КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЛИМФОИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ
Факторы прогноза при фолликулярной лимфоме
Д.Н. Тупицына1, А.М. Ковригина2, Е.Н. Шолохова1, Е.Н. Сорокин1,
П.А. Зейналова1, Д.А. Быков3, О.А. Коломейцев1, Г.С.Тумян1, Е.А. Османов1
_____________________РЕФЕРАТ_________________________
Наиболее важными клиническими факторами прогноза при фолликулярной лимфоме (ФЛ) являются стадия заболевания, уровень гемоглобина, активность лактатдегидрогеназы, размер нодальных очагов поражения (менее и более 6 см). Увеличение индекса пролиферативной активности (Ki-67) опухолевых клеток более 20 % ведет к ухудшению прогноза ФЛ. При нарастании зон диффузного роста показатели общей выживаемости ухудшаются. Однако сохранение крупных зон фолликулярных дендритных клеток даже при диффузном характере роста ФЛ служит благоприятным прогностическим признаком, не ухудшающим отдаленные результаты лечения. Из числа лимфоидных клеток реактивного неопухолевого микроокружения CD4-позитивные Т-лимфоциты любого из микроанатомических отделов пораженного ФЛ лимфоузла — важный фактор благоприятного прогноза заболевания. Нарастание уровня FOXP3+ Т-регуляторных клеток, а также PD1 + Т-клеток в опухоли (интрафолликулярно, парафолликулярно, в зонах диффузного роста) служит фактором благоприятного прогноза ФЛ. Увеличение степени макрофагальной инфильтрации ухудшало показатели общей выживаемости больных в эру до ритуксимаба. В условиях лечения по программам, включающим ритуксимаб с последующей поддерживающей терапией этим препаратом, прогностическое значение выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалось, Т-лимфоцитов CD4+ и Т-регуляторных клеток FOXP3+ — сохранялось, а маркера PD1 — даже возрастало.
Ключевые слова:
фолликулярная лимфома, факторы прогноза, микроокружение.
Follicular lymphoma prognostic factors
D. N. Tupitsyna1, A.M. Kovrigina2, E.N. Sholokhova1,
E. N. Sorokin1, P.A. Zeynalova1, D.A. Bykov3,
O.A. Kolomeytsev1, G.S. Tumyan1, E.A. Osmanov1
SUMMARY
The most important clinical prognostic signs of follicular lymphoma (FL) are stage of disease, levels of hemoglobin and LDH, nodal size (less and more than 6 cm). Proliferative index (Ki-67) more than 20 % worsens the prognosis of FL. Appearance of diffuse growth pattern of FL diminishes the duration of OS. Presence of zones of follicular dendritic cells even in diffuse growth pattern is a favorable prognostic sign in FL. The most important micro environmental lymphoid cells are CD4 lymphocytes. Increasing proportion of FOXP3-positive T-regulatory cells located intrafollicu-larly, parafollicularly and in diffuse zones as well as the high level of PD1+ cells are favorable prognostic signs in FL. Prominent macrophage infiltration decreased patient’s survival while treatment protocols w/o rituximab were used. Introduction of rituximab into induction and supportive programs of FL treatment made the macrophage infiltration not prognostically important, while CD4 and FOXP3 levels were of the same significance and the role of PD1 + cells in prognosis even increased.
Keywords: follicular lymphoma, prognosis, microenvironment.
1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
2 Hematological Research Center Russian Ministry of Health, Moscow
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, The State Edicational Institution of Higher Professional Training Ministry of Health of the Rissian Federation
Контакты: [email protected] Принято в печать: 20 декабря 2012 г.
ВВЕДЕНИЕ
Фолликулярные лимфомы (ФЛ) составляют 22 % всех неходжкинских лимфом взрослых. Это гетерогенная группа опухолей как по морфологическим характеристикам (выделяют три цитологических типа с нодулярным или диффузным характером роста), так и по клинической картине и прогнозу заболевания. Болезнь может протекать быстро и заканчиваться летальным исходом в течение первых 2 лет после диагностики или, напротив,
длиться более 10 лет. Причины крайних вариантов течения опухоли неясны. Существующие прогностические системы FLIPI [1] не охватывают всего многообразия болезни.
По этим причинам все большее число исследований направлено на изучение молекулярно-биологических особенностей ФЛ. Опухоль характеризуется как высокоорганизованная структура, представленная всеми клеточными элементами зародышевого центра фолликула и паракортикальной зоны. К ним относятся
1 ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
2 ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России, Москва
3 ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России, Москва 328
Прогноз при ФЛ
в первую очередь опухолевые В-клетки, для обозначения которых используются термины «центроцит» и «цен-тробласт», а также клетки так называемого реактивного неопухолевого микроокружения.
Взаимоотношения между опухолевыми клетками и элементами реактивного микроокружения — актуальная проблема клинической онкогематологии, и в последние годы она активно изучается.
В 2004 г. серьезный прорыв в понимании биологии ФЛ произошел благодаря работе S.S. Dave и соавт. [2]. Исследователи изучили профили генной экспрессии у больных ФЛ до лечения, выделили гены, ассоциированные с различной выживаемостью, и сгруппировали их в соответствии с различным прогнозом заболевания. Особенно важным и интересным оказалось то, что данные профилей генной экспрессии характеризовали не биологические особенности опухоли, а уровень инфильтрации ФЛ нормальными (неопухолевыми) иммунными клетками: Т-лимфоцитами и макрофагами. Профиль экспрессии «иммунный ответ 1» (Immune response 1, IR-1) характеризовался благоприятным прогнозом (медиана выживаемости 13,6 года), а «иммунный ответ 2» (IR-2) — напротив, неблагоприятным (медиана выживаемости 3,9 года). Это была первая публикация, в которой показана роль внутриопухолевой иммунной реакции при ФЛ и ее влияния на прогноз заболевания. Прогностическое значение профилей генной экспрессии оказалось статистически значимо выше, чем любого из клинических или морфологических факторов, характеризующих ФЛ.
Дальнейшее развитие концепция неопухолевого микроокружения получила при использовании иммуногистохимического метода [3]. P. Farinha и соавт. (2005) показали неблагоприятную роль выраженной макрофагальной реакции (CD68) при ФЛ. Однако впоследствии выяснилось, что прогностическую роль тумор-ассоцииро-ванных макрофагов необходимо рассматривать с учетом схемы лечения: при включении в программы лечения ритуксимаба макрофаги CD68+ играли благоприятную прогностическую роль [4, 5]. Эти данные позволили уточнить и конкретизировать некоторые клеточные компоненты, связанные с IR-2. Несколько неожиданной оказалась роль Т-клеток (IR-1), т. к. J. Carreras и соавт. [6] установили благоприятную роль FOXP3-позитивных туморинфильтрирующих Т-регуляторных лимфоцитов в прогнозе ФЛ.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено у 73 больных ФЛ. Среди них было 26 мужчин и 47 женщин в возрасте 25—91 год (медиана 58 лет). Все больные находились под наблюдением в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН с 1995 по 2009 г.
Больным было проведено стандартное общеклиническое обследование, включающее современные методы диагностики онкогематологических заболеваний. Диагноз во всех случаях был верифицирован иммуноморфологическими методами: иммуногистохимией по парафиновым блокам и иммунофенотипированием по криостатным срезам.
Для установления степени распространенности опухолевого процесса использовалась классификация, принятая в Ann Arbor (1971 г.) и дополненная в Cotswold
(1989 г.). Факторы прогноза устанавливались в соответствии с международными прогностическими индексами FLIPI и FLIPI2. Общее состояние пациентов оценивалось по критериям ECOG.
Иммунофенотипирование клеток материала биопсии в большинстве случаев проводилось путем иммунофлюоресцентного окрашивания свежезамороженных (криостатных) срезов. Панель моноклональных антител включала антитела к В-линейным антигенам (CD 19, CD20, CD21, CD23, CD37), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7), антигенам гистиоцитов и макрофагов (CD163), антигенам фолликулярных дендритных клеток (CD21, CD23), антигенам плазматических клеток
(CD38), нелинейным антигенам (CD 10, CD38, HLA-DR), общелейкоцитарному антигену CD45.
Проведено также иммуногистохимическое исследование материала парафиновых блоков у 66 больных с оценкой процента субпопуляций положительных Т-клеток (CD8, CD4, FOXP3, PD1) в каждом из микроанатомических отделов лимфоузла.
Анализ непосредственных и отдаленных результатов терапии проведен с учетом международных стандартизованных критериев ответа на лечение при неходжкинских лимфомах.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы SPSS на основе созданной базы данных. Оценка включала корреляционный анализ, сравнение средних величин, анализ по таблицам сопряженности признаков с применением критерия ^2, построение кривых выживаемости по методике Каплана— Мейера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клинические факторы прогноза при фолликулярной лимфоме
В настоящем исследовании связь с прогнозом ФЛ четко и достоверно прослеживается для стадий заболевания, уровня гемоглобина, активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и размера лимфоузлов (менее и более 6 см).
Стадии заболевания статистически значимо влияли на показатели общей выживаемости (р = 0,036): все 14 больных с ранними стадиями ФЛ оставались под наблюдением с максимальным сроком до 180 мес. Кривые выживаемости представлены на рис. 1.
Показатели общей выживаемости различались у пациентов с разным уровнем гемоглобина (р = 0,003). Кривые представлены на рис. 2.
Аналогичные закономерности получены при изучении влияния уровня гемоглобина на безрецидивную (р = 0,000), бессобытийную (р = 0,007) и выживаемость без прогрессирования (р = 0,003), а также выживаемость, зависящую от заболевания (р = 0,001).
Уровень гемоглобина был статистически значимо связан со стадией заболевания (р = 0,002). У больных с I—II стадией снижение гемоглобина не наблюдалось (п = 13), а при III и IV стадиях оно отмечено в 45,3 % случаев.
Установлена статистически значимая взаимосвязь снижения уровня гемоглобина с поражением костного мозга (р = 0,016). При отсутствии вовлечения костного мозга снижение гемоглобина отмечено только у 5 (19,2 %) из 26 больных, при вовлечении костного мозга — у 19 (48,7 %) из 39.
www.medprint.ru
329
Д.Н. Тупицына и др.
Рис. 1. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различными стадиями заболевания. Верхняя кривая (сплошная) — I-II стадия (п = 15); нижняя кривая (пунктирная линия) — III-IV стадия (п = 58)
Рис. 2. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем гемоглобина. Верхняя кривая (сплошная) — уровень гемоглобина 120 г/л и более (п = 43); нижняя кривая (пунктирная линия) — уровень гемоглобина менее 120 г/л (п = 25)
Продолжительность жизни, мес.
Продолжительность жизни, мес.
Рис. 3. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различной активностью ЛДГ. Верхняя кривая (сплошная) — ЛДГ < N (п = 35); нижняя кривая (пунктирная линия) — ЛДГ > N (п = 21)
Рис. 4. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с очагами нодальных поражений менее и более 6 см в диаметре. Верхняя кривая (сплошная) — нодальные очаги менее 6 см (п = 37); нижняя кривая (пунктирная линия) — нодальные очаги более 6 см (п = 28)
Общая выживаемость больных ФЛ коррелировала с активностью ЛДГ (р = 0,003) (рис. 3).
Отмечается значительное ухудшение показателей общей выживаемости в группе пациентов с очагами нодальных поражений более 6 см в диаметре (р = 0,035) (рис. 4).
Общая выживаемость больных в различных группах риска по FLIPI представлена на рис. 5.
В соответствии с критериями FLIPI2 установлено существенное ухудшение показателей общей выживаемости в группе высокого риска (п = 16) в сравнении с группой (п = 15) промежуточного (р = 0,05) (рис. 6).
Таким образом, в работе подтверждена прогностическая роль четырех факторов, включенных в прогностические индексы FLIPI (стадия по Анн-Арбор, уровень гемоглобина и ЛДГ, размер пораженных лимфоузлов менее и более 6 см), а также групп риска прогрессирования, выделяемых в соответствии с критериями FLIPI и FLIPI2.
Наиболее важным фактором прогноза (наибольший уровень значимости при сравнении кривых выживае-
мости) оказалось снижение уровня гемоглобина. Фактором благоприятного прогноза были начальные стадии заболевания: все больные ФЛ I и II стадий находятся под наблюдением (см. рис. 1). Возраст пациентов (моложе или старше 60 лет), а также количество зон нодального поражения не влияли на прогноз.
Морфологические параметры фолликулярной лимфомы и прогноз
Морфологические факторы не включены в прогностический индекс FLIPI. Однако, судя по данным литературы и классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008 г. [7], некоторые морфологические признаки все же могут иметь прогностическое значение при ФЛ. В числе этих признаков обсуждается цитологический тип ФЛ, характер роста опухоли, а также пролиферативный индекс Ki-67. Значение этих трех параметров было оценено у 63 больных ФЛ.
Цитологический тип не влиял на прогноз заболевания. Для оценки роли пролиферативного индекса использовался пороговый уровень 20 %. Количество
330
Клиническая онкогематология
Прогноз при ФЛ
50,00 100,00 150,00
Продолжительность жизни, мес.
Продолжительность жизни, мес.
Рис. 5. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в различных группах риска по FLIPI. Верхняя кривая (сплошная линия) — FLIPI 0-1 (п = 15); средняя кривая (пунктирная линия) — FLIPI 2 (п = 13); нижняя кривая (точечная линия) — FLIPI 3-5 (п = 30)
Рис. 6. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в различных группах риска по FLIPI2. Верхняя кривая (сплошная линия) — FLIPI2 1-2 (п = 15); нижняя кривая (пунктирная линия) — FLIPI2 3-5 (п = 16)
200,00
Рис. 7. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем пролиферативного индекса (Ki-67). Верхняя кривая (сплошная линия) — Ki-67 определяется менее чем в 20 % опухолевых клеток (п = 37); нижняя кривая (пунктирная линия) — Ki-67 определяется в 20 % и более опухолевых клеток (п = 28)
Рис. 8. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой при различном характере роста опухоли. Верхняя кривая (сплошная линия) — нодулярный тип роста фолликулярной лимфомы (п = 29); средняя кривая (пунктирная линия) — нодулярно-диффузный тип роста (п = 28); нижняя кривая (точечная линия) — диффузно-нодулярный и диффузный типы роста (п = 15)
Ki-67 + опухолевых клеток более 20 % статистически значимо коррелировало с ухудшением общей выживаемости (p = 0,044) (рис. 7).
Нарастание зон диффузного роста статистически значимо ухудшало показатели общей выживаемости (р = 0,012) (рис. 8).
Таким образом, из числа иммуноморфологических признаков влияние на прогноз оказывало нарастание Ki-67 > 20 % и наличие зон диффузного роста в опухолевой ткани.
Субпопуляционный состав клеток реактивного микроокружения и прогноз при фолликулярной лимфоме
Общий уровень инфильтрации ткани ФЛ Т-клетками и показатели выживаемости. Статистически значимой связи уровня инфильтрации лимфоцитами CD3+, CD5+, CD7+ с показателями общей выживаемости не установлено (p > 0,18). Следует отметить, что наихудшие показатели общей выживаемости
наблюдались у больных с единичными Т-лимфоцитами в срезах опухолевой ткани. Это относится ко всем трем маркерам, использованным в качестве пан-Т-клеточных: CD3, CD5, CD7.
Выраженность макрофагальной (CD163) реакции и показатели выживаемости. Наихудшие результаты лечения получены в группе больных с выраженной макрофагальной инфильтрацией (рис. 9).
С целью получить более достоверные данные по оценке прогностической роли макрофагальной реакции пациенты с низкой и умеренной макрофагальной инфильтрацией объединены в одну группу (n = 47). Эта объединенная группа сопоставлена с больными с выраженной макрофагальной реакцией (n = 17). Различия между группами оказались высоко статистически значимыми (p = 0,038). Кривые представлены на рис. 10.
Таким образом, полученные данные полностью подтверждают неблагоприятное прогностическое значение выраженной макрофагальной реакции при ФЛ. Следует
www.medprint.ru
331
Д.Н. Тупицына и др.
—і--------1-------1--------1-------1--------1-------1—
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00
Продолжительность жизни, мес.
Рис. 9. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой при различной выраженности макрофагальной реакции (CD163). Верхняя кривая (точечная линия) — низкая степень/отсутствие макрофагальной инфильтрации (п = 24); средняя кривая (пунктирная линия) — умеренно выраженная макрофагальная реакция (п = 23); нижняя кривая (сплошная линия) — выраженная макрофагальная инфильтрация (п = 17)
Рис. 10. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой при различной выраженности макрофагальной реакции (CD163). Верхняя кривая (пунктирная линия) — низкая/умеренная степень макрофагальной инфильтрации (п = 47); нижняя кривая (сплошная линия) — выраженная макрофагальная инфильтрация (п = 17)
Б
Рис. 11. Фолликулярные дендритные клетки (CD21+) в гистологических срезах фолликулярной лимфомы: А — иммуноферментное окрашивание, х400; Б — иммунофлюоресцентное окрашивание, х400
отметить, что для идентификации макрофагов использовался новый маркер CD163.
В условиях применения ритуксимаба (29 больных, из них 6 — с выраженной макрофагальной реакцией) степень макрофагальной инфильтрации не имела прогностического значения. Таким образом, в эру ритуксимаба отмечается нивелирование неблагоприятного прогностического значения выраженной макрофагальной инфильтрации.
ФДК-каркас (CD21+) и показатели выживаемости. Характер роста ФЛ определяется выраженностью клеток, образующих его остов, — фолликулярных дендритных клеток (ФДК), которые относятся к клеткам неопухолевого микроокружения. ФДК невозможно рассматривать в отрыве от характера роста ФЛ и ее цитологического типа. Даже при диффузном характере роста сохраняющиеся ФДК указывают на неполную утрату фолликулярности (рис. 11).
Выраженность ФДК в опухолевых срезах коррелировала с благоприятным прогнозом ФЛ. Это заключалось в том, что наблюдения с большим количеством ФДК характеризовались более благоприятным прогнозом, что подтверждается лучшими показателями общей выживаемости (рис. 12).
Полученные результаты позволили сделать вывод, что снижение числа ФДК любого уровня ухудшает прогноз.
При объединении групп больных с меньшим количеством ФДК и сравнение их показателей общей выживаемости с пациентами, у которых число ФДК было высоким, получены статистически значимые различия (р = 0,003) (рис. 13).
Таким образом, выраженное количество ФДК CD21 + в срезах ФЛ характерно для группы благоприятного прогноза и, напротив, снижение числа ФДК (вне зависимости от уровня этого снижения) статистически значимо ухудшает прогноз (показатели общей выживаемости).
Влияния уровня ФДК CD23+ на показатели выживаемости не выявлено.
Сохранность ФДК-каркаса (CD21+) наиболее полно отражает характер роста ФЛ — стирание фолликулов (нодулярных структур) и появление диффузного компонента. Полученные результаты о важном прогностическом значении снижения уровня ФДК CD21+ свидетельствуют о необходимости широкого использования этого маркера для установления характера роста ФЛ и определения группы больных с благоприятным прогнозом.
Т-лимфоциты CD4+ и CD8+ в различных микроанатомических областях лимфоузлов и показатели выживаемости. Высокий уровень (> 30 %) интерфолликулярных клеток CD4+ был характерен для прогностически благоприятной группы больных (р = 0,047) (рис. 14).
332
Клиническая онкогематология
Прогноз при ФЛ
Рис. 12. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах больных с различным количеством фолликулярных дендритных клеток. Верхняя кривая (сплошная линия) — множество ФДК (п = 35); средняя кривая (пунктирная линия) — сниженное число ФДК (п = 10); нижняя кривая (точечная линия) — единичные ФДК или их полное отсутствие (п = 12)
Рис. 13. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах больных с различным уровнем CD21+ фолликулярных дендритных клеток. Верхняя кривая (сплошная линия) — множество ФДК (п = 35); нижняя кривая (пунктирная линия) — сниженное число ФДК или их полное отсутствие (п = 22)
Рис. 14. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интерфолликулярной инфильтрации Т-лимфоцитами CD4+. Верхняя кривая (сплошная линия) — более 30 % Т-лимфоцитов CD4+ (п = 31); нижняя кривая (пунктирная линия) — 30 % и менее Т-лимфоцитов CD4+ (п = 16)
Рис. 15. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярной инфильтрации Т-лимфоцитами CD4+. Верхняя кривая (сплошная линия) — более 10 % интрафолликуляр-ных Т-лимфоцитов CD4+ (п = 50); нижняя кривая (пунктирная линия) — 10 % и менее интрафолликулярных Т-лимфоцитов CD4+ (п = 13)
Для анализа прогностической роли интрафолликулярных, парафолликулярных Т-клеток CD4+, а также Т-клеток CD4+ в зонах диффузного роста использовали пороговый уровень 10 %. При количестве интрафолликулярных Т-лимфоцитов CD4+ более 10 % показатели общей выживаемости были более высокими (p = 0,005) (рис. 15).
При оценке прогностического значения парафолликулярных Т-клеток CD4+ при ФЛ получены результаты, аналогичные таковым при интрафолликулярной инфильтрации Т-клетками CD4 + : показатели выживаемости лучше у больных с более выраженной инфильтрацией (р = 0,046).
Уровень Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+) различных отделов лимфоузлов (интрафолликулярных, парафолликулярных, интерфолликулярных, а также в зонах диффузного роста) не влиял на прогноз ФЛ.
Т-лимфоциты FOXP3+ и показатели выживаемости. Уровень интерфолликулярных клеток FOXP3 + не влиял на общую выживаемость больных ФЛ.
В то же время прослеживается отчетливая связь интрафолликулярных Т-клеток FOXP3+ с прогнозом ФЛ: высокое содержание этих клеток коррелировало с большей продолжительностью жизни (p = 0,013) (рис. 16).
Аналогичные данные получены при анализе парафолликулярного распределения Т-клеток FOXP3+ (p = 0,001) и в зонах диффузного роста (p = 0,018).
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что количество Т-клеток FOXP3+ имело прогностическое значение не только внутри фолликулов (интрафолликулярно), но и в парафолликулярных и диффузных участках опухолевого роста. Иными словами, прогностическую роль играли только Т-клетки FOXP3 + , расположенные в участках опухолевого роста, но не в межфолликулярных зонах лимфоузла, пораженного ФЛ.
Известно, что Т-регуляторные клетки FOXP3 + входят в подкласс Т-лимфоцитов CD4 + . Следует отме-
www.medprint.ru
333
Д.Н. Тупицына и др.
Рис. 16. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярных клеток FOXP3+. Верхняя кривая (сплошная) — более 10 % интрафолликулярных клеток FOXP3+ (п = 35); средняя кривая (пунктирная линия) — 5-10 % интрафолликулярных клеток FOXP3+ (п = 16); нижняя кривая (точечная линия) — содержание интрафолликулярных клеток FOXP3+ менее 5 % (п = 11)
тить, что интрафолликулярные Т-регуляторные клетки FOXP3+ и в целом популяция Т-клеток CD4+ имеют одинаковую направленность влияния на прогноз ФЛ. Интрафолликулярные Т-клетки CD4+ количественно преобладали над интрафолликулярными клетками FOXP3+ (n = 62): 21,6 + 1,3 и 10,5 + 0,9 % соответственно (p = 0,001). Наблюдалась высоко значимая корреляция между этими субпопуляциями (R = 0,45; р = 0,001). Возможно, именно большой долей Т-лимфоцитов FOXP3+ среди интрафолликулярных Т-клеток CD4+ определяется однонаправленное влияние двух субпопуляций на прогноз.
Т-лимфоциты PD1+ и показатели выживаемости. При анализе показателей общей выживаемости в зависимости от уровня Т-клеток PD1+, расположенных в интерфолликулярной зоне, взаимосвязи не выявлено.
Отмечена существенная связь общей выживаемости больных ФЛ с уровнем Т-клеток PD1+, расположенных интрафолликулярно. Низкое и умеренное число Т-клеток PD1 + установлено у 24 больных, высокое (> 10 %) — у 37. Эти группы различались по прогнозу (p = 0,05) (рис. 17).
Других взаимосвязей между уровнем Т-клеток PD1+, расположенных в различных микроанатомических областях лимфоузла, пораженного ФЛ, и показателями выживаемости не установлено.
Маркер PD1 характеризует популяцию фолликулярных Т-хелперов (CD4 + ). Интрафолликулярное число Т-клеток CD4+ и PD1+ было одинаковым (n = 63): 21,5 + 1,3 и 22,7 + 1,9 % соответственно (p = 0,45). Отмечен высокий уровень корреляции между этими клеточными типами (R = 0,52; p = 0,001). Полученные данные свидетельствуют о том, что маркер PD1 присутствует практически на всех интрафолликулярных Т-клетках CD4+ при ФЛ.
Прогностическое значение клеток реактивного микроокружения при использовании программ противоопухолевой терапии фолликулярных лимфом с включением ритуксимаба
В работе оценено влияние добавления ритуксимаба в схемы лечения на прогностическую роль маркеров неопухолевого микроокружения CD4, FOXP3 и PD1. В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль интрафолликулярных Т-лимфоцитов CD4+ сохранялась (p = 0,002).
Рис. 17. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярных Т-клеток PD1+. Верхняя кривая (сплошная линия) — уровень интрафолликулярных Т-клеток PD1 + более 10 % (п = 37); нижняя кривая (пунктирная линия) — содержание интрафолликулярных Т-клеток PD1+ 0-10 % (п = 24)
При добавлении в программы лечения ритуксимаба различия в выживаемости пациентов в зависимости от уровня интрафолликулярных Т-клеток FOXP3+ сохранялись и были статистически значимыми (рис. 18). Все пациенты с наличием Т-клеток FOXP3+ (> 10 %) ко времени окончания настоящего исследования были живы с максимальной длительностью наблюдения 10 лет.
Прогностическое значение Т-клеток PD1+ в условиях современного лечения с добавлением ритуксимаба возрастало и было статистически высокозначимым (p = 0,018) (рис. 19).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о важной роли клеток неопухолевого микроокружения в прогнозе ФЛ. Значение этих клеток зависит от применяемой программы лечения. В настоящей работе неблагоприятная роль выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалась в условиях лечения ритук-симабом. Это пример того, как применение современных иммунотерапевтических схем может воздействовать не только на собственно опухолевые клетки, но и на клетки неопухолевого микроокружения. Вместе с тем прогностическая роль Т-хелперов и субпопуляций Т-регуляторных клеток не изменялась и даже возрастала. Иными словами, благоприятная роль выраженной инфильтрации ткани ФЛ этими клетками в условиях проведения иммунохимиотерапии проявлялась наиболее отчетливо. Однако сохранялась неблагоприятная прогностическая роль слабой инфильтрации данными клеточными типами. По-видимому, дальнейшая стратегия иммунохимиотерапии ФЛ может быть направлена на клетки реактивного неопухолевого микроокружения. Перспективным представляется стимуляция пролиферации или повышения функциональной активности Т-лимфоцитов FOXP3+, PD1+ и CD4 + .
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам работы, связь с прогнозом прослеживается четко и статистически значимо для стадии заболевания, уровня гемоглобина, активности ЛДГ и размера лимфоузлов менее и более 6 см. Важно подчеркнуть, что стадия заболевания и уровень гемоглобина значимо коррелировали между собой: при I—II стадии снижения
334
Клиническая онкогематология
Прогноз при ФЛ
0,00 25,00 50,00 75,00 100,00 125,00
Продолжительность жизни, мес.
Рис. 18. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем интрафолликулярных Т-лимфоцитов FOXP3+ в условиях лечения с включением ритуксимаба. Верхняя кривая — количество Т-лимфоцитов FOXP3+ более 10 % (п = 16); нижняя кривая — количество Т-лимфоцитов FOXP3+ 0-10 % (п = 11)
Рис. 19. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем интрафолликулярных Т-лимфоцитов PD1+ в условиях лечения с добавлением ритуксимаба. Верхняя кривая (сплошная линия) — количество Т-лимфоцитов PD1+ более 10 % (п = 18); нижняя кривая (пунктирная линия) — количество Т-лимфоцитов PD1 + 0-10 % (п = 10)
гемоглобина не наблюдалось, в то время как при III—IV стадии пониженный уровень гемоглобина отмечен у 45 % больных. Выживаемость больных в различных группах риска по FLIPI, как и следовало ожидать, различалась. Наихудшие показатели общей выживаемости наблюдались в группах высокого риска раннего прогрессирования. Взаимосвязи прогностического значения параметров неопухолевого микроокружения и клинико-лабораторных признаков, обозначенных во FLIPI, в работе не установлено.
К клеткам микроокружения относятся ФДК, макрофаги и Т-лимфоциты. В настоящем исследовании выделение субпопуляций Т-лимфоцитов проведено на основании изучения четырех ключевых иммунологических маркеров: CD4, CD8, FOXP3 и PD1. Экспрессия транскрипционного фактора FOXP3 и белка PD1 характерна для популяции Т-лимфоцитов CD4 + , которая в целом чрезвычайно гетерогенна.
Молекула FOXP3 присуща Т-регуляторным клеткам, в срезах лимфоузлов экспрессируется только на этой популяции клеток и используется для их идентификации. В нормальном лимфоузле и лимфоузле, пораженном ФЛ, экспрессия PD1 в отличие от FOXP3 характерна для так называемых фолликулярных Т-хелперов, т. е. Т-лимфоцитов CD4 + , расположенных в зародышевых центрах фолликулов, а при ФЛ — интрафолликулярно. По результатам работы, количество интрафолликулярных Т-клеток CD4+ примерно вдвое превышает содержание интрафолликулярных Т-регуляторных клеток FOXP3+. Напротив, уровень интрафолликулярных Т-лимфоцитов PD1 + практически точно совпадает с количеством фолликулярных Т-клеток CD4 + . Отмечена выраженная корреляция между этими клеточными типами. Клетки ФЛ — это лимфоидные иммунные клетки, на которые распространяется супрессивное действие Т-регуляторных лимфоцитов, так же как и на нормальные клетки фолликулов лимфоузлов. В норме интрафолликулярные Т-регуляторные клетки подавляют пролиферацию клеток светлых центров фолликулов.
С точки зрения клинического значения при ФЛ две субпопуляции Т-лимфоцитов CD4+ — регуляторные
Т-клетки (FOXP3+) и Т-фолликулярные хелперы (PD1+) — представляют особый интерес. Большинство авторов сходятся на том, что именно эти субпопуляции, локализующиеся в зародышевых центрах, играют роль в прогнозе ФЛ. Однако, какова эта роль, все еще остается неясным. P. Farinha и соавт. предложили классификацию типов распределения FOXP3-клеток в лимфоузле при ФЛ [8]. Авторы показали, что фолликулярный тип распределения связан с менее благоприятным прогнозом. Сразу же следует отметить, что FOXP3-клетки, и это подтверждают наши исследования, присутствуют не только в опухолевых фолликулах, но и в парафолликулярной зоне, межфолликулярных областях и в участках диффузного роста ФЛ. «Чистый» фолликулярный тип распределения выделить практически не удается. Поэтому, на наш взгляд, целесообразна количественная оценка FOXP3-клеток в различных компартментах (микроанатомических зонах) пораженного ФЛ лимфоузла, как это было сделано в работе J. Carreras и соавт. [6].
Наши данные полностью подтвердили необходимость раздельного исследования субпопуляций Т-клеток в различных микроанатомических отделах лимфоузла. Наиболее важное значение в прогнозе имеют интра-фолликулярные клетки FOXP3+ и PD1+. Возрастание уровня Т-клеток FOXP3+ более 10 % характерно для прогностически благоприятной группы ФЛ. Эти наблюдения согласуются с данными J. Carreras и соавт. [6]. Вместе с тем полученные результаты значительно расширяют представления о роли Т-лимфоцитов FOXP3+, локализованных в различных микроанатомических отделах лимфоузла, пораженного ФЛ. Правильнее, по-видимому, говорить не об интрафолликулярных, а о внутриопухолевых Т-клетках FOXP3+. Действительно, не только Т-лимфоциты FOXP3+, локализованные в фолликулах, но и в парафолликулярной области и зонах диффузного опухолевого роста играют роль в прогнозе ФЛ. Увеличение количества этих клеток (> 10 % клеточного состава перечисленных микроанатомических зон) связано с более благоприятным прогнозом. Сходные результаты относительно прогностической роли получены и для маркера Т-фолликулярных хелперов PD1. На
www.medprint.ru
335
Д.Н. Тупицына и др.
рис. 20 продемонстрированы примеры распределения Т-лимфоцитов FOXP3+ и PD1+ в различных микроанатомических отделах лимфоузла, пораженного ФЛ.
Благоприятная прогностическая роль фолликулярных клеток PD1 показана в нескольких работах [9, 10]. J. Carreras и соавт., используя антитела к PD1, изучили образцы биопсий у 100 больных при диагностике ФЛ (53 мужчины и 47 женщин, медиана возраста 54 года) и 32 биопсий при первом рецидиве. Клетки были подсчитаны с помощью компьютера, дополнительный анализ включал двойное иммунофлюоресцентное окрашивание и проточную цитометрию. При диагностике медиана содержания клеток PD1+ была 14 % (диапазон 0,1—74 %). У пациентов с 3-м цитологическим типом ФЛ, плохим соматическим статусом и высокой активностью ЛДГ отмечено наиболее низкое число клеток PD1+. При наблюдении в течение 6,2 года пациенты с числом клеток PD1+ не более 5 % (п = 25), 6—33 % (п = 50) и более 33 % (п = 25) имели 5-летнюю выживаемость без прогрессирования 20, 46 и 48 % (р = 0,038) и общую выживаемость 50, 77 и 95 % соответственно (р = 0,004). При этом у них был наиболее высокий риск трансформации. При трансформации в диффузную
В-крупноклеточную лимфому процентное содержание клеток PD1+ было гораздо меньшим, чем при ФЛ. Таким образом, авторы установили, что высокое содержание клеток PD1+ у больных ФЛ служит предиктором благоприятного прогноза, в то время как снижение числа данных клеток говорит о высоком риске трансформации.
Как в случае с FOXP3, так и с PD1 исключением является интерфолликулярный отдел, который не относится к опухолевому компоненту и, по-видимому, представляет остаточные зоны нормального лимфоузла. Т-клетки FOXP3+ и PD1+ этого анатомического отдела не имеют прогностического значения при ФЛ.
Несомненно, интересен результат исследования относительно роли CD4-лимфоцитов. Прогностическая роль этих клеток в опухолевых зонах была даже более выраженной, чем роль регуляторных клеток и Т-фолликулярных хелперов. Данные свидетельствуют о накоплении Т-клеток CD4+ в участках опухолевого роста (фолликулах, парафолликулярно, в зонах диффузного роста), что ассоциируется с благоприятным прогнозом.
Результаты представляются особенно важными в свете полученных нами данных относительно роли мор-
Рис. 20. Расположение Т-лимфоцитов (А, Г) FOXP3+ и (Б, В) PD1+ в различных микроанатомических отделах лимфоузла. Иммунопероксидазное окрашивание, х 400:
А — интрафолликулярно; Б — интерфолликулярно; В — парафолликулярно; Г — в зонах диффузного роста
336
Клиническая онкогематология
Прогноз при ФЛ
фологически устанавливаемого характера опухолевого роста, неблагоприятного прогностического значения при повышении доли диффузного компонента. Нарастание числа Т-клеток FOXP3+ и PD1+ в опухолевых зонах, включая зоны диффузного роста, связано с более благоприятным прогнозом.
В этой связи особо стоит межфолликулярный отдел, где Т-лимфоциты CD4+ не коррелируют с Т-клетками FOXP3+ и PD1+. FOXP3+ и PD1+ Т-клетки, расположенные интерфолликулярно, не влияют на прогноз ФЛ. Вместе с тем высокое число (> 30 %) Т-лимфоцитов CD4+ в интерфолликулярных зонах служит фактором благоприятного прогноза. Здесь важно отметить принципиальную разницу в трактовке данных относительно количества Т-лимфоцитов CD4+ в межфолликулярной зоне (сохранная ткань лимфоузла) и в зонах опухолевого роста (фолликулы, парафолликулярно, зоны диффузного роста). В интерфолликулярных зонах в отличие от опухолевых количество Т-клеток CD4+ снижается (в норме они являются доминирующим классом клеток в данном отделе), и установленный пороговый уровень (30 %) позволяет разграничить две группы больных: с существенно редуцированным и менее редуцированным числом Т-лимфоцитов CD4+ в межфолликулярном отделе. Группа пациентов с сохранной пропорцией Т-клеток CD4+ характеризуется более благоприятным прогнозом.
Важный вывод данной работы — установление прогностически неблагоприятной роли макрофагальной инфильтрации ткани ФЛ. По данным P. Farinha [3], большинство случаев ФЛ с единичными макрофагами или без них принципиально отличается от реактивных лимфоузлов, в которых макрофаги всегда многочисленны. Возможно, при ФЛ с большим количеством макрофагов опухолевые В-клетки или Т-лимфоциты продуцируют цитокины, привлекающие или удерживающие преимущественно М2-макрофаги. В лимфоузле макрофаги могут способствовать выживаемости клеток ФЛ, ангиогенезу (за счет секреции ангиогенных факторов), изменять фенотип или функции антигенпрезентирующих дендритных клеток, а также увеличивать представительство T-регуляторных клеток, приводящее к иммуносупрессии внутриопухолевых T-лимфоцитов [11]. Дальнейшее понимание взаимосвязи между неопухолевыми макрофагами и В-клетками ФЛ сможет прояснить важные аспекты биологии ФЛ.
Таким образом, установленная в работе роль микроокружения в прогнозе ФЛ двоякая. Благоприятное значение имеет нарастание уровня Т-клеток FOXP3+ и PD1+, Т-лимфоцитов CD4+ в опухолевых зонах, неблагоприятное — выраженная макрофагальная инфильтрация опухоли. Эти данные свидетельствуют о том, что количественная оценка клеток иммунной системы в различных отделах лимфоузла может дать информацию, которая первоначально была получена при изучении профилей генной экспрессии в опухолевой ткани ФЛ, подтвердивших роль микроокружения в прогнозе заболевания. Проводя параллели, можно сказать, что уровень Т-лимфоцитов CD4 + , Т-клеток FOXP3+ и PD1+ более соответствуют
Т-клеточному прогностически благоприятному профилю генной экспрессии IR-1. Нарастание макрофагальной инфильтрации, напротив, соответствует прогностически неблагоприятному профилю генной экспрессии IR-2.
В работе проведен специальный анализ прогностического значения маркеров неопухолевого микроокружения в группе больных, получавших лечение в эру ритуксимаба. Поскольку хорошо известно, что какие бы ни разрабатывались прогностические системы, внедрение инновационных методов лечения, в т. ч. медикаментозных, может нивелировать прогностическое значение тех или иных маркеров. В связи с этим была поставлена задача понять, сохраняют ли свое прогностическое значение параметры микроокружения в эру ритуксимаба, т. е. когда во все программы лечения включались анти-CD20 моноклональные антитела.
Полученные в работе данные свидетельствуют о важной роли клеток неопухолевого микроокружения в прогнозе ФЛ. В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалась. Вместе с тем прогностическое значение Т-лимфоцитов CD4+ и регуляторных Т-клеток FOXP3+ сохранялось, а для маркера PD1 — даже возрастало.
Таким образом, не только клинические признаки и иммуноморфологические особенности ФЛ определяют прогноз заболевания. Важную роль играют клетки реактивного неопухолевого микроокружения: Т-лимфоциты, макрофаги, ФДК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Solal-Celigny P., Roy P., Colombat P. et al. Follicular lymphoma international prognostic index. Blood 2004; 104: 1258-65.
2. Dave S.S., Wright G., Tan B. et al. Prediction of survival in follicular lymphoma based on molecular features of tumor-infiltrating immune cells. N. Engl.
J. Med. 2004; 351: 2159-69.
3. Farinha P., Masoudi H., Skinnider B.F. et al. Analysis of multiple biomarkers shows that lymphoma-associated macrophage (LAM) content is an independent predictor of survival in follicular lymphoma (FL). Blood 2005; 106(6): 2169-74.
4. Taskinen M., Karjalainen-Lindsberg M.L., Nyman H. et al. A high tumor-associated macrophage content predicts favorable outcome in follicular lymphoma patients treated with rituximab and cyclophosphamide-doxorubicin/ vincristine-prednisone. Clin. Cancer Res. 2007; 13(19): 5784-9.
5. Canioni D., Salles G., Mounier N. et al. High numbers of tumor-associated macrophages have an adverse prognostic value that can be circumvented by rituximab in patients with follicular lymphoma enrolled onto the GELA-GOELAMS FL-2000 trial. J. Clin. Oncol. 2008; 26(3): 440-6.
6. Carreras J., Lopez-Guillermo A, Fox B.C. et al. High numbers of tumor-infiltrating FOXP3-positive regulatory T cells are associated with improved overall survival in follicular lymphoma. Blood 2006; 108(9): 2957-64.
7. Harris N.L., Swerdlow S.H., Jaffe E.S. et al. Follicular lymphoma. In: World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues. Ed. by S.H. Swerdlow et al. Lyon: IARC Press, 2008: 220-6.
8. Farinha P., Al-Tourah A, Gill K. et al. The architectural pattern of FOXP3-positive T cells in follicular lymphoma is an independent predictor of survival and histologic transformation. Blood 2010; 115: 289-95.
9. Carreras J., Lopez-Guillermo A, Roncador G. et al. High numbers of tumor-infiltrating programmed cell death 1-positive regulatory lymphocytes are associated with improved overall survival in follicular lymphoma. J. Clin. Oncol. 2009; 27: 1470-6.
10. Wahlin B.E., Aggarwal M., Montes-Monero S. et al. A unifying microenvironment model in follicular lymphoma: outcome is predicted by programmed death-1-positive, regulatory, cytotoxic, and helper T cells and macrophages. Clin. Cancer Res. 2010; 16: 637-50.
11. Dunn G.P., Old L.J., Schreiber R.D. The immunobiology of cancer im-munosurveillance and immunoediting. Immunity 2004; 21(2): 137-48.
www.medprint.ru
337
