CC BY
12
УДК 611.013.85:618.36:577.27.085.2 https://doi.org/10.20538/1682-0363-2020-4-158-166
Фактор роста плаценты модулирует ответ активированных in vitro T-клеток
Сметаненко Е.А.1, Леплина О.Ю.1, Тихонова М.А.1, Пасман Н.М.2, Останин А.А.1, Черных Е.Р.1
1 Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии (НИИФКИ) Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет (ННИГУ) Россия, 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2
РЕЗЮМЕ
Актуальность. Недавние исследования выявили иммуносупрессивные свойства фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A) и его ключевую роль в опухоль-индуцированной иммуносупрессии. Плацентарный фактор роста (PlGF) является еще одним представителем семейства VEGF, резкое возрастание которого ассоциировано с эффективной иммунной адаптацией при успешной беременности, тогда как низкие концентрации PlGF являются предиктором гестационных осложнений на фоне активации иммунной системы. Ранее нами показано, что активированные Т-клетки экспрессируют рецепторы VEGF 1-го типа (VEGFR-1) и PlGF через связывание с VEGFR-1 ингибирует пролиферацию Т-клеток.
Цель. Дальнейшее изучение влияния PlGF на T-клеточный ответ in vitro.
Материалы и методы. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови здоровых доноров стимулировали моноклональными анти-CD3-антителами (a-CD3) в отсутствие и присутствии рекомбинантного PlGF и оценивали продукцию интерлейкина-10 (IL-10), уровень апоптоза и экспрессию ингибиторных рецепторов (PD-1, CTLA-4, Tim-3) в субпопуляциях CD4+ и CD8+ T-клеток.
Результаты. Активация МНК a-CD3 в присутствии PlGF приводила к возрастанию относительного содержания CD4+ и CD8+ T-клеток, продуцирующих IL-10. Кроме того, PlGF усиливал апоптоз активированных CD8+ T-лимфоцитов, не влияя значимо на уровень программированной клеточной гибели CD4+ Т-клеток. Характерно, что активация Т-клеток a-CD3 в присутствии PlGF сопровождалась возрастанием PD-1 экс-прессирующих клеток в субпопуляции CD8+ Т-клеток и Tim-3-экспрессирующих клеток среди CD4+ и CD8+ Т-клеток, а также повышением уровня экспрессии PD-1 и Tim-3 на Т-клетках.
Заключение. PlGF способен ингибировать Т-клеточный ответ посредством усиления продукции IL-10 и активационно-индуцированного апоптоза CD8+ Т-клеток, а также экспрессии ингибиторных рецепторов. Учитывая повышенный уровень PlGF при физиологической беременности и его снижение при гестаци-онных осложнениях, полученные данные позволяют предполагать, что ингибиторный эффект PlGF на Т-клеточный ответ может являться еще одним механизмом, обеспечивающим защиту плода от иммунной системы матери.
Ключевые слова: PlGF, Т-клетки, апоптоз, IL-10, ингибиторные рецепторы, PD-1, CTLA-4, Tim-3.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Новосибирской области (проект № 18-44-540005р-а).
Соответствие принципам этики. Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИФКИ (протокол № 107 от 15.06.2018).
Н Черных Елена Рэмовна, e-mail: ct_lab@mail.ru.
Для цитирования: Сметаненко Е.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Пасман Н.М., Останин А.А., Черных Е.Р. Фактор роста плаценты модулирует ответ активированных in vitro T-клеток. Бюллетень сибирской медицины. 2020; 19 (4): 158-166. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2020-4-158-166.
Placental growth factor exerts modulatory effects on in vitro activated T cells
Smetanenko E.A.1, Leplina O.Yu.1, Tikhonova M.A.1, Pasman N.M.2, Ostanin A.A.1, Chernykh E.R.1
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology (RIFCI) 14, Yadrintsevskaya Str., Novosibirsk, 630099, Russian Federation
2 Institute of Medicine and Psychology, Novosibirsk National Research State University 2, Pirogova Str., Novosibirsk, 630090, Russian Federation
ABSTRACT
Background. Recent studies demonstrated immunosuppressive properties of vascular endothelial growth factor (VEGF-A) and identified VEGF-A as a key mediator of tumor-induced immunosuppression. Placental growth factor (PlGF) is another member of VEGF family in which dramatic elevation is associated with effective immune adaptation in successful pregnancy, whereas low concentrations are related to pregnancy complications resulting from the activation of immune system. Previously, we have shown that activated T cells express VEGF receptor type 1 (VEGFR-1), and PlGF inhibits T cell proliferation in VEGFR-1-dependent manner.
The aim of the present study was to further characterize PlGF effects on T cell responses in vitro.
Materials and methods. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors were stimulated with anti-CD3 monoclonal antibodies (a-CD3) in the absence or presence of PlGF and assessed for IL-10 production, programmed cell death and the expression of inhibitory receptors (PD-1, CTLA-4, Tim-3) in CD4+ and CD8+ T cell subsets.
Results. The addition of PlGF to PBMC cultures activated with a-CD3 resulted in increased percentages of IL-10-producing CD4+ and CD8+ T cells. Besides, PlGF promoted CD8+ T cells apoptosis while did not affect programmed cell death within CD4+ T cells. Notable, T cell activation with a-CD3 in the presence of PlGF was accompanied by the enhancement of PD-1-expressing cells in CD8+ T cell subset and Tim-3-expressing cells in both CD4+ and CD8+ T cells, and by the increased expression of PD-1 and Tim-3 on T cells.
Conclusion. Our in vitro findings indicate that PlGF can inhibit T cell responses due to the increasing interleukin-10 (IL-10) production, promoting CD8+ T cell apoptosis and enhancing the expression of PD-1 and Tim-3 inhibitory receptors. Given the elevated levels of PlGF in successful pregnancy and its decrease in gestation complications, the obtained data also suggest that PlGF-mediated suppression may be implicated into the governing immune evasion in pregnancy.
Key words: PlGF, T cells, apoptosis, IL-10, inhibitory receptors, PD-1, CTLA-4, Tim-3.
Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.
Source of financing. The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research and the government of Novosibirsk region (Project No. 18-44-540005r-a).
Conformity with the principles of ethics. The study was approved by the local ethics committee of RICFI (Protocol No. 107 of 15.06.2018).
For citation: Smetanenko E.A., Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Pasman N.M., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Placental growth factor exerts modulatory effects on in vitro activated T cells. Bulletin of Siberian Medicine. 2020; 19 (4): 158-166. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2020-4-158-166.
ВВЕДЕНИЕ
Белки семейства факторов роста эндотелия сосудов (VEGF) играют ключевую роль в формировании новых сосудов в норме и при патологии. Наиболее активным и изученным членом этого семейства является VEGF-A, который опосредует проангиоген-ную активность через активацию двух рецепторов с тирозин-киназной активностью - VEGFR-1 ^Ь-1) и VEGFR-2 (КБК^1к-1) [1]. Другим фактором с выраженной проангиогенной активностью является фактор роста плаценты (P1GF), который связывается исключительно с VEGFR-1 [2, 3].
Недавние исследования показали, что наряду с проангиогенными свойствами VEGF-A обладает им-муномодулирующим действием, индуцирует накопление регуляторных Т-клеток и миелоидных супрес-сорных клеток, ингибирует созревание дендритных клеток (ДК) и функции Т-клеток [4] и является ключевым фактором опухоль-индуцированной имуносу-прессии [5]. Иммуномодулирующие эффекты P1GF исследованы в значительно меньшей степени. Известно, что P1GF стимулирует поляризацию макрофагов в М2 направлении, подавляет созревание ДК, а также индуцирует регуляторные В-клетки [3, 6]. Однако влияние P1GF на функции Т-клеток остается неисследованным. Согласно данным литературы, эффект VEGF на Т-лимфоциты опосредуется через VEGFR-2 [7]. В то же время P1GF является селективным лиган-дом для VEGFR-1, роль которого в регуляции функциональной активности Т-клеток остается неясной.
Изучение иммуномодулирующих свойств P1GF мотивировано возможным участием фактора в ускользании опухоли от иммунного надзора, поскольку повышенный уровень P1GF при большинстве форм рака ассоциирован с дисфункциями иммунных клеток и коррелирует с опухолевой прогрессией [8, 9]. Еще больший интерес вызывает изучение имму-номодулирующей активности P1GF при беременности, которая сопровождается резким возрастанием уровня сывороточного P1GF при физиологическом течении и снижением концентрации P1GF при развитии гестационных осложнений [10].
При беременности иммунная система претерпевает существенную перестройку (так называемую иммунную адаптацию) [11], которая направлена на индукцию толерантности к аллоантигенам плода и предупреждение избыточных воспалительных реакций. Механизмы, лежащие в основе иммунной адаптации, включают деплецию аллоантиген-реактивных Т-клеток, переключение и индукцию регу-
ляторных Т-лимфоцитов [11]. Недавние исследования продемонстрировали также роль Т-клеточного истощения в подавлении цитотоксической активно-
сти материнских Т-лимфоцитов [12, 13]. С этой точки зрения иммуномодулирующая активность PlGF может представлять один из механизмов, посредством которого развивающийся плод избегает реакций отторжения со стороны иммунной системы матери.
Недавно нами показано, что активированные Т-лимфоциты экспрессируют VEGFR-1 и связывание PlGF с VEGFR-1 в культурах мононуклеарных клеток ингибирует пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток [14]. Целью настоящей работы стало дальнейшее изучение влияния PlGF на T-клеточный ответ in vitro, а именно на продукцию Т-клетками иммуносупрессорных цитокинов (интерлейкина-10, IL-10), апоптоз Т-лимфоцитов и экспрессию ингиби-торных рецепторов (PD-1, CTLA-4, Tim-3), опосредующих Т-клеточное истощение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 35 здоровых доноров крови обоего пола в возрасте 20-54 лет. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли центрифугированием гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (р = 1,078). МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в среде RPMI-1640, дополненной 10%-й инактивированной сывороткой доноров АВ (IV) группы, 2 мМ HEPES-буфера, 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы - производства Sigma-Aldrich, США) и гентамицином (100 мкг/мл) при температуре 37 °С и содержании СО2 на уровне 5%. Для стимуляции клеток использовали моноклональ-ные анти-CD3 антитела (a-CD3, IC0-90, Медбио-спектр, г. Москва, Россия) в концентрации 1 мкг/мл, PlGF в концентрации 0,1-100 нг/мл (R&D System, США). Интенсивность пролиферации оценивали на 5-е сут по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунка), вносимого за 18 ч до окончания культивирования с использованием жидкостного сцинтиляционного счетчика SL-30 (Intertechnic, Франция).
В отдельной серии экспериментов исследовали влияние нейтрализующих анти-VEGFR-! антител (а-VEGFR-!) на супрессорный эффект PlGF. Для этого в культуры МНК, стимулированные а-CD3, добавляли PlGF (5 нг/мл) и выращивали в отсутствие и присутствии нейтрализующих а-VEGFR-! или а-VEGFR^ антител (HumanVEGFR1/Flt-1; VEGFR2/ KDR/Flk-1 антитела 2,5 мкг/мл; R&D System, США), вносимых совместно с PlGF либо через 24 ч после начала культивирования.
Продукцию IL-10 оценивали по относительному содержанию IL-10-секретирующих клеток в гейтах CD4+ и CD8+ лимфоцитов методом проточной ци-тофлуориметрии (BD FACSCalibur) с использовани-
ем a-CD3(PE), CD8+(FITC), CD4(PerCP), IL-10(PE) антител (BD Biosciences, США) в 48-часовых культурах МНК, активированных a-CD3 в отсутствие и присутствии PlGF. Фиксацию и пермеабилизацию МНК для оценки внутриклеточной экспрессии IL-10 проводили после инкубации клеток с моноклональ-ными антителами против поверхностных антигенов с помощью набора растворов для фиксации/перме-абилизации Transcription Factor Buffer Set в соответствии с инструкцией (BD Biosciences, США). Анализ проводили в пробах после накопления не менее 30 тыс. событий в регионе Т-клеток.
Апоптоз активированных Т-клеток оценивали цитофлуориметрически. МНК, стимулированные a-CD3 (1 мкг/мл), культивировали в присутствии или отсутствие PlGF (5 нг/мл). Через 48 ч культивирования МНК метили анти-CD4(FITC) или ан-to-CD8(FITC) антителами (BD Biosciences, США) и затем Annexin V/7-ADD (PE-conjugated Annexin V/7-ADDkit) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. В каждом образце оценивали 10 тыс. событий. Процентное содержание CD4+ и CD8+ T-клеток, позитивных по аннексину V и (или) 7-ADD, измеряли, используя программное обеспечение CellQuest (BD Biosciences, США).
Экспрессию ингибиторных рецепторов (PD-1, CTLA-4, Tim-3) на Т-клетках оценивали цито-флуориметрически, используя анти-CD4(Pe), анти-CD8(FITC), анти-CTLA-4(PE-Cy5), анги-PD-1(APC), анти-TIM-3(PerCP/Cy5.5) и соответствующие контрольные изотип-специфические антитела (BD PharMingen, США). Относительное содержание и среднюю интенсивность флуоресценции (MIF) PD-1, CTLA-4, Tim-3 оценивали в гейтах СD4+ и СD8+ T-клеток. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США). Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Ме [Q—Q]. Статистическую значимость различий оценивали с помощью непараметрического Ж-критерия Вилкоксона для зависимых выборок с поправкой Бонферрони. Различия считали статистически значимыми при значениях p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ингибиторный эффект PlGF на a-CD3-активированные Т-клетки является VEGF-независимым. Ранее нами показано, что блокирование VEGFR-1 отменяет супрессорный эффект PlGF на пролиферацию Т-клеток в a-CD3-стимулированных культурах МНК [14]. Это позволило предположить, что PlGF оказывает прямой ингибирующий эффект на Т-клетки через связывание с VEGFR-1. В то же
время известно, что PlGF способен активировать МНК к продукции VEGF [15], который также может ингибировать пролиферацию Т-клеток [7]. Согласно данным литературы, супрессорный эффект VEGF проявляется с 7-х сут и требует концентраций VEGF [7], существенно превышающих уровень продукции VEGF в культурах МНК [15].
Для того чтобы полностью исключить участие VEGF в реализации ингибиторного эффекта PlGF, мы сравнили блокирующий эффект а-VEGFR-l и а-VEGFR^ на супрессорную активность PlGF. Учитывая низкий уровень экспрессии VEGFR на нестимулированных Т-клетках и существенное их возрастание в течение суток, блокирующие антитела добавляли в двух режимах: вместе с PlGF и через 24 ч после начала культивирования (рис. 1).
p = 0,013
p = 0,011
50 000
40 000 -
m
о 30 000 -
я
s
s Тз 20 000 -
s
я
10 000 -
0
X
5 6
+ +
+ +
а-СО3 + +
PIGF - +
aVEGFR-1 (0^ - -aVEGFR-1 (24^) - - - + + +
aVEGFR-2 (0^ - - - - + -
aVEGFR-2 (24^) - - - - - +
Рис. 1. Нейтрализующие а^ЕОРЯ-1 антитела отменяют игибиторный эффект РЮР на пролиферацию Т-клеток: МНК стимулировали а-СОЗ-антителами в отсутствие (1) и присутствии 5 нг/мл РЮР(2-6); нейтрализующие а^ЕОРЯ-1 (3, 4) или а^ЕОРЯ-2 (5, 6) антитела добавляли в дозе 2,5 мкг/мл одновременно с РЮР (3, 5) или через 24 ч от начала культивирования (4, 6), имп/мин,Ме Мт-Мах, п = 8
Как видно из рис. 1, в присутствии РЮБ уровень пролиферативного ответа Т-клеток на стимуляцию а-СОЗ-антителами снижался на 31% (26-38%; р = 0,013). Нейтрализующие а-VEGFR-1 антитела снижали супрессорный эффект РЮР до 9% (3-25%) при добавлении совместно с фактором и до 3% (0-16%) -при добавлении через 24 ч от начала культивирования. Более выраженное подавление супрессорной активности РЮР в данном случае было, по-видимому, связано с более высокой экспрессией VEGFR-1 на Т-клетках через 24 ч после анти-СО3-стимуляции. В то же время блокирование VEGFR-2 не отменяло супрессорный эффект РЮР.
Влияние PlGF на продукцию ^-10 а-СОЗ-акти-вированными CD4+ и CD8+ Т-клетками. Для оценки влияния PLGF на способность Т-клеток продуцировать ^-10, исследовали относительное содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток с внутриклеточным содержанием ^-10 в культурах, а-СОЭ-стимулирован-ных МНК в отсутствие и присутствии P1GF (рис. 2).
Активация МНК a-CD3 сопровождалась увеличением относительного содержания ^-10+ клеток в субпопуляции CD8+ Т-лимфоцитов (р = 0,028). Прирост количества ^-10-продуцирующих клеток среди CD4+ Т-лимфоцитов отмечался также у большей части обследованных доноров, хотя эти изменения не были статистически значимы (р = 0,06).
10
о4 «
H
4-
= 0,013
p = 0,06
«
20
15
£ К
g 10
о
Ч «
= 0,004
«
Vît
ГГ
—*-
0
a-CD3 a-CD3+PlGF
0
= 0,028
♦ ♦
-M-
• •
—(—
И*
b
0
a-CD3 a-CD3+PlGF
Рис. 2. P1GF повышает внутриклеточную 1Ь-10 экспрессию СБ4+ (а) и СБ8+ (Ь) Т-лимфоцитами: МНК культивировали в среде (0) или стимулировали а-СБ3 в отсутствие (а-СБ3) и присутствии 5 нг/мл P1GF (a-CD3+P1GF). Через 48 ч культивирования оценивали внутриклеточную экспрессию 1Ь-10 в субпопуляцих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии. Данные представлены в виде индивидуальных значений и Ме, п = 9-11
Добавление в культуры P1GF приводило к возрастанию доли 1Ь-10+ клеток как среди CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов по сравнению с МНК стимулированными a-CD3-антителами в отсутствие P1GF. При этом относительное количество CD8+IL-10+ Т-клеток в культурах МНК, содержащих P1GF, в 2,7 раза превышало количество CD4+IL-10+ Т-клеток (р = 0,018).
PlGFусиливает апоптоз а-СБЗ-активированных Т-клеток. Для оценки возможного участия P1GF в регуляции программированной клеточной гибели исследовали влияние фактора на уровень актива-ционно-индуцированного апоптоза CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Для идентификации апоптотических
и некротических клеток использовали трехцветную проточную цитофлуориметрию. Клетки в состоянии раннего апоптоза не включают ядерный краситель (7-ADD) и определяются как Ann+/7ADD-. Клетки в состоянии позднего апоптоза или некроза, включающие ядерный краситель, идентифицируются как Ann+/7-ADD+. В популяции свежевыделенных МНК большинство CD4+ и CD8+ Т-клеток были жизнеспособными ^п^^^ОО-) и содержали очень низкое количество апоптотических клеток. 48-часовая активация МНК a-CD3-антителами сопровождалась возрастанием уровня апоптоза в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-клеток (рис. 3).
х1
о4
20 15 10 5
0
Ann+7AAD-p = 0,006
tI
Ann+ p = 0,006
T
-I-1-1-
0 a-CD3 a-CD3+PlGF
25 40
20 30
o4
15 ¡V
j» H 20
10 u £ u s
5 10
0 0
Ann+7AAD-p = 0,007
Ann+ p = 0,02
p = 0,038
p = 0,038
0 a-CD3 a-CD3+PlGF
b
=F
0 a-CD3 a-CD3+PlGF
0 a-CD3 a-CD3+Pl
40 30 20 10
G0F
X1
o4
Рис. 3. P1GF усиливает апоптоз а-CD3-активированных CD8+ Т-клеток: представлены суммированные данные относительного содержания клеток в стадии раннего апоптоза (Ann+/7ADD-) и общего количества апоптотических клеток (AnnV+) в гейтах CD4+ (а) и CD8+ (Ь) Т-лимфоцитов. Данные четырех независимых экспериментов проанализированы с помощью
парного критерия Вилкоксона, п = 10
8
6
5
2
0
a
a
Таблица
Влияние PlGF на экспрессию чек-пойнт молекул на а-CD3-активированных CD4+ и CD8+ T-клетках, Ме [Q—Q3], n = 8
МНК CD4+ Т-клетки, % CD8+ Т-клетки, %
PD-1 CTLA-4 Tim-3 PD-1 CTLA-4 Tim-3
0 3,7 [2,2-4,3] 4,6 [2,1-7,1] 2,9 [2,0-3,6] 2,3 [1,6-2,8] 0,4 [0,1-0,8] 0,7 [0,1-1,6]
a-CD3 6,0* [3,0-8,5] 7,0* [2,4-10,2] 3,7* [2,7-5,3] 3,2* [2,4-4,2] 0,3 [0,1-0,7] 2,4* [1,6-3,2]
a-CD3+PlGF 5,5* [4,5-8,1] 7,3* [4,2-10,0] 5,0*# [3,3-6,6] 3,8 *# [2,9-4,5] 0,5 [0,3-0,7] 5,1*# [3,3-6,1]
Примечание. Относительное содержание РЭ-1, С^А-4 и Нш-3-позитивных клеток в гейтах СЭ4+ и СЭ8+ Т-лимфоцитов оценивали в 48-часовых культурах нестимулированных МНК (0) и МНК, активированных анти-СО3-антителами в отсутствие (а-СЭ3) и присутствии 5 нг/мл РЮР (а-СЭ3+РЮР).
* р <0,05 - по сравнению с нестимулированными МНК; # р < 0,05 - по сравнению с а-СО3-активированными МНК.
Добавление в культуры PlGF приводило к усилению апоптоза CD8+ Т-клеток (p <0,05), не влияя на уровень гибели CD4+ T-лим-фоцитов. Поскольку количество Ann+/7ADD- клеток отражает только проксимальные (ранние) события апоптотического процесса, дополнительно проанализировали общее количество Ann+ Т-клеток (An-n+/7ADD-/+). Относительное содержание Ann+CD8+ Т-лимфоцитов среди МНК, активированных a-CD3 в присутствии PlGF, было выше, чем в контрольных a-CD3-стимулированных культурах. В то же время различий в содержании AnnV+CD4+ Т-клеток в присутствии и отсутствие PlGF не наблюдалось.
PlGF повышает экспрессию ингибиторных рецепторов на активированных Т-клетках. Повышенная экспрессия ингибиторных рецепторов (также получивших название ингибиторных чек-пойнт молекул) рассматривается в качестве важного механизма ограничения Т-клеточного ответа вследствие Т-клеточного истощения [12]. Чтобы оценить влияние PlGF на экспрессию ингибиторных рецепторов, исследовали экспрессию PD-1, CTLA-4 и Tim-3 на CD4+ и CD8+ T-клетках в 48-часовых культурах МНК (таблица).
Стимуляция МНК a-CD3 приводила к возрастанию доли T-лимфоцитов, экспрессирующих чек-пойнт молекулы. Так, относительное количество CD4+PD-1+ и CD8+PD-1+ Т-клеток в ответ на aнти-CD3-стимуляцию статистически значимо превышало их содержание среди нестимулированных МНК. При этом добавление в культуру PlGF увеличивало число PD-1-позитивных CD8+ T-клеток (p <0,05), но не оказывало такого эффекта в отношении CD4+PD-1+ Т-лимфоцитов. Связывание T-кле-точных рецепторов с a-CD3-антителами приводило к возрастанию доли CD4+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих CTLA-4, однако PlGF не оказывал влияния на количество CTLA-4-экспрессирующих CD4+ или CD8+ T-клеток. Относительно экспрессии Tim-3, a-CD3-стимуляция также повышала долю Tim-3-по-зитивных клеток в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, при этом в присутствии PlGF количе-
ство как СО4+Т1ш3+, так и СО8+Т1ш3+ Т-лимфоци-тов статистически значимо увеличивалось (р <0,05).
Важно отметить, что РЮР не только повышал долю РБ-1- и Т1ш-3-позитивных Т-клеток, но и усиливал экспрессию указанных рецепторов на Т-клет-ках. Так, в присутствии РЮР средняя интенсивность флуоресценции РБ-1 на СБ4+ Т-клетках возрастала с (37,1 ± 3,5) до (47,8 ± 5,8), а в субпопуляции СБ8+ Т-клеток - с (38 ± 3,3) до (47,0 ± 4,1) (р <0,05). Средняя интенсивность флуорисценции Т1ш-3 под действием РЮР возрастала на СБ4+ Т-клетках с (41,0 ± 4,2) до (49,0 ± 4,9) и на СБ8+ Т-клетках - с (44,0 ± 4,5) до (49,0 ± 5,3) (р <0,05). Таким образом, присутствие в культуре РЮР приводило к умеренному, но статистически значимому возрастанию уровня экспрессии РБ-1 и Т1ш-3 на СБ4+ и СБ8+ Т-клетках.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные нами данные показали, что ингиби-рующий эффект PlGF на пролиферацию Т-клеток в а-СО3-стимулированных культурах МНК реализуется через VEGFR-1 и не связан с возможным усилением продукции VEGF активированными МНК [15], поскольку блокирование VEGFR-2 не отменяло супрессорный эффект РЮР. Установлено также, что РЮР повышает продукцию 1Ь-10 активированными СО4+ и СО8+ Т-клетками, усиливает апоптоз СО8+ Т-клеток и повышает экспрессию ингибиторных рецепторов РО-1 и Т1ш-3 на Т-клетках, что свидетельствует о важной роли PlGF/VEGFR-1 сигнального пути в модуляции Т-клеточных функций.
Согласно данным литературы, VEGFR-1 обладает низкой тирозинкиназной активностью, что долгое время позволяло рассматривать VEGFR-1 исключительно как рецептор-ловушку [2]. Однако позже выяснилось, что данный рецептор экспрессируется гемопоэтиче-скими предшественниками, моноцитами/макрофагами и ДК и VEGFR-1 сигнальный путь вовлечен в процессы мобилизации костномозговых предшественников, активации и миграции моноцитов, регуляцию созревания ДК и клеточной пролиферации [3, 16, 17]. Более того, недавние исследования показали, что сигналинг
через VEGFR-1 в гипоксических условиях активирует STAT3 [8], который играет важную роль в регуляции Т-клеточных функций, ингибируя пролиферацию Т-лимфоцитов и их способность продуцировать IL-2 [18]. Эти факты согласуются с нашими данными об ингибирующем эффекте PlGF на пролиферацию Т-клеток через связывание с VEGFR-1.
Одним из выявленных эффектов PlGF явилось стимулирующее действие данного фактора на продукцию IL-10 активированными T-клетками. Y.L. Lin и соавт. продемонстрировали способность PlGF модулировать цитокин-секреторную функцию Т-клеток опосредованно через ДК. Так, в смешанной культуре лейкоцитов PlGF-модифицированные ДК усиливали продукцию аллогенными Т-клетками IL-13 и IL-5, но при этом не влияли на секрецию IL-10 [6]. Эти данные подчеркивают различия между прямым и ДК-опосредованным действием PlGF.
J.Y. Shin и соавт. описали усиление продукции IL-10 при активации VEGFR-1 на T-клетках селезенки и линии CD4+ T-лимфоцитов в результате связывания с VEGF [19], что подтверждает способность VEGFR-1 опосредовать прямой эффект на Т-клетки. Однако авторы не выявили подавления пролиферации Т-клеток при активации VEGFR-1. По-видимому, этот факт объясняется тем, что PlGF и VEGF могут оказывать различные эффекты при связывании с VEGFR-1 в силу активации различных транскрипционных факторов [17].
Как известно, IL-10 является ключевым иммуно-супрессорным цитокином, участвующим в ограничении иммунного ответа и индукции толерантности при беременности [20]. Супрессорный эффект IL-10 реализуется через генерацию толерогенных ДК, индукцию регуляторных Т-клеток и активацию JAK1/ STAT3 сигнального пути в Т-лимфоцитах [21]. Ин-гибирующее действие IL-10 наиболее четко продемонстрировано в отношении CD4+ T-клеток, в которых эндогенная продукция данного цитокина является важным регуляторным механизмом ограничения функций CD4+ T-лимфоцитов [22].
Влияние IL-10 на функции CD8+ T-клеток не так однозначно. При опухолевом росте IL-10 может активировать и стимулировать экспансию цитоток-сических CD8+ T-клеток [23], тогда как при хронической инфекции описан прямой ингибирующий эффект IL-10 на CD8+ T-лимфоциты [24]. Полученные нами результаты свидетельствуют о способности PLGF усиливать продукцию IL-10 не только в популяции CD4+, но и CD8+ Т-клеток. Однако является ли повышенная продукция IL-10 причиной подавления пролиферации Т-клеток и, особенно, CD8+ T-клеток в присутствии PlGF, остается открытым и требует дальнейших исследований.
Другим важным результатом работы являются данные о способности P1GF усиливать апоптоз СБ8+ Т-клеток и экспрессию на Т-клетках ингибиторных рецепторов ^Б-1 и Тт-3). Способность P1GF модулировать уровень апоптоза была недавно продемонстрирована в модели эмфиземы легких [25]. Авторы показали, что P1GF повышает апоптоз легочного эпителия через активацию с^ипК-терминальной киназы и протеин киназы С. В нашем исследовании впервые показано, что P1GF усиливает апоптоз активированных СЭ8+ Т-клеток.
Поскольку P1GF также стимулировал возрастание доли PD-1+ клеток, причем только в субпопуляции СЭ8+, но не СБ4+ Т-лимфоцитов, мы предположили, что усиление апоптоза СЭ8+ Т клеток может быть связано с повышенной экспрессией PD-1. Роль ингибиторного рецептора PD-1 в подавлении функций цитотоксических Т-клеток убедительно продемонстрирована при раке [26], а недавно выявлена и при беременности [27]. Сигналинг через PD-1 оказывает ингибиторный эффект на Т-лимфоциты через различные механизмы, включая индукцию апоптоза [28]. Кроме того, повышенная экспрессия ингиби-торных чек-пойнт молекул может отражать состояние Т-клеточного истощения [12].
Нами показано также, что наряду с молекулой PD-1 P1GF стимулировал увеличение числа Тт-3-позитивных клеток, причем как в СБ8+, так и СБ4+ субпопуляциях Т-лимфоцитов. Тт-3 является еще одной чек-пойнт молекулой, которая вовлечена в Т-клеточное истощение и играет важную роль в ослаблении иммунного ответа матери на аллоантиге-ны плода при успешной беременности [29]. Т. Voron и соавт. впервые продемонстрировали способность VEGF-A усиливать через VEGFR-2 сигнальный путь экспрессию различных ингибиторных чек-пойнт молекул ^В-1, CTLA-4, Тт-3) на СБ8+ Т-клетках мышей-опухоленосителей [30]. Авторы также обнаружили одновременную экспрессию нескольких ин-гибиторных рецепторов на СБ8+ Т-клетках в присутствии высоких концентраций VEGF.
Полученные нами результаты показали стимулирующее действие ангиогенных факторов на экспрессию чек-пойнт молекул на Т-лимфоцитах человека и, в частности, способность P1GF усиливать экспрессию PD-1 и Тт-3 на Т-клетках. Причем если стимулирующий эффект P1GF в отношении PD-1 отмечался только в популяции СБ8+ Т-клеток, то эффект P1GF на экспрессию Тт-3 выявлялся в обеих (СБ4+ и СБ8+) субпопуляциях Т-клеток. К сожалению, нами не было проведено анализа ко-экспрессии ингибиторных рецепторов, что является ограничением исследования. Тем не менее увеличение доли СБ8+ Т-клеток, экс-
прессирующих как минимум два типа ингибиторных рецепторов (PD-1 и Tim-3), ассоциированное со снижением пролиферации CD8+ T клеток в присутствии PlGF, позволяет предполагать, что появление чек-пойнт молекул на поверхности Т-клеток может опосредовать ингибирующий эффект PlGF на Т-клетки.
Полученные данные позволяют рассматривать PlGF в качестве нового иммунного модулятора при беременности. Концентрация PlGF в сыворотке крови при нормальной беременности прогрессивно возрастает, в то время как снижение уровня PlGF при гипоксии плаценты является предиктором пре-эклампсии и задержки роста плода [10]. Несмотря на высокую прогностическую значимость уровня PlGF, патофизиологическое значение этого фактора до конца не осмыслено. Учитывая важную роль иммунной адаптации при успешной беременности и выраженные иммунные нарушения у женщин с преэклампсией [31, 32], разумно предположить, что PlGF причастен к иммунной модуляции при физиологической беременности, а снижение уровня этого фактора способствует активации иммунной системы и развитию гестационных осложнений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, PlGF повышает продукцию IL-10 активированными CD4+ и CD8+ T-клетками, усиливает апоптоз CD8+ T-лимфоцитов и повышает экспрессию ингибиторных рецепторов PD-1 и Tim-3 на Т-клетках, что свидетельствует о важной роли PlGF/ VEGFR-1 сигнального пути в модуляции Т-клеточ-ных функций. Учитывая повышенный уровень PlGF при физиологической беременности и его снижение при гестационных осложнениях, полученные данные позволяют предполагать, что ингибиторный эффект PlGF на Т-клеточный ответ может являться еще одним механизмом, обеспечивающим защиту плода от иммунной системы матери.
ЛИТЕРАТУРА
1. Stuttfeld E., Ballmer-Hofer K. Structure and function of VEGF receptors. IUBMB Life. 2009; 61 (9): 915-922. DOI: 10.1002/ iub.234.
2. De Falco S. The discovery of placenta growth factor and its biological activity. Exp. Mol. Med. 2012; 44 (1): 1-9. DOI: 10.3858/emm.2012.44.1.025.
3. Dewerchin M., Carmeliet P. PlGF: a multitasking cytokine with disease-restricted activity. Cold Spring Harb. Perspect Med. 2012; 2 (8): a011056. DOI: 10.1101/cshperspect.a011056.
4. Voron T., Marcheteau E., Pernot S., Colussi O., Tartour E., Taieb J., Terme M. Control of the immune response by pro-an-giogenic factors. Front Oncol. 2014; 4: 70. DOI: 10.3389/ fonc.2014.00070.
5. Lapeyre-Prost A., Terme M., Pernot S., Pointet A.L., Voron T., Tartour E., Taieb J. Immunomodulatory activity of VEGF
in cancer. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2017; 330: 295-342. DOI: 10.1016/bs.ircmb.2016.09.007.
6. Lin Y.L., Liang Y.C., Chiang B.L. Placental growth factor down-regulates type 1 T helper immune response by modulating the function of dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 2007; 82 (6): 1473-1480. DOI: 10.1189/jlb.0307164.
7. Ziogas A., Gavalas N., Tsiatas M., Tsitsilonis O., Politi E., Ter-pos E., Rodolakis A., Vlahos G., Thomakos N., Haidopoulos D., Antsaklis A., Dimopoulos M., Bamias A. VEGF directly suppresses activation of T cells from ovarian cancer patients and healthy individuals via VEGF receptor Type 2. Int. J. Cancer. 2012; 130 (4): 857-864. DOI: 10.1002/ijc.26094.
8. Albonici L., Giganti M., Modesti A., Manzari V., Bei R. Multi-faceted role of the placental growth factor (PlGF) in the antitumor immune response and cancer progression. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20 (12): е2970. DOI: 10.3390/ijms20122970.
9. Meng F.-J., Xiao S.-X., Zhang Y., Wang W., Wang B., Fan X.-Y. Prognostic significance of placenta growth factor expression in patients with multiple cancers: a meta-analysis. Int. J. Clin. Exp. Med. 2015; 8 (8): 12726-12735.
10. Lecarpentier E., Vieillefosse S., Haddad B., Fournier T., Le-guy M., Guibourdenche J., Tsatsaris V. Placental growth factor (PlGF) and sFlt-1 during pregnancy: physiology, assay and interest in preeclampsia. Ann. Biol. Clin. (Paris). 2016; 74 (3): 259-267. DOI: 10.1684/abc.2016.1158.
11. Morelli S., Mandal M., Goldsmith L.T., Kashani B.N., Pon-zio N.M. The maternal immune system during pregnancy and its influence on fetal development. Research and Reports in Biology. 2015; 6: 171-189. DOI: 10.2147/RRB.S80652.
12. Slutsky R., Romero R., Xu Y., Galaz J., Miller D., Done B., Tarca A.L., Gregor S., Hassan S.S., Leng Y., Gomez-Lopez N. Exhausted and senescent T cells at the maternal-fetal interface in preterm and term labor. J. Immunol. Res. 2019: 3128010. DOI: 10.1155/2019/3128010.
13. Xu Y., Wang S., Lin Y., Li D., Du M. Tim-3 and PD-1 regulate CD8+ T cell function to maintain early pregnancy in mice. J. Re-prod. Dev. 2017; 63 (3): 289-294. DOI: 10.1262/jrd.2016-177.
14. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Баторов Е.В., Останин А.А. Сигналинг через рецептор к фактору роста эндотелия сосудов 1-го типа как новый механизм подавления Т-клеток при опухолевом неоангиогенезе. Медицинская иммунология. 2019; 21 (4): 653-660. DOI: 10.15789/1563-0625-2019-4-653-660.
15. Bottomley M., Webb N., Watson C., Holt L., Bukhari M., Denton J., Freemont A., Brenchley P. Placenta growth factor (PlGF) induces vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion from mononuclear cells and is co-expressed with VEGF in synovial fluid. Clin. Exp. Immunol. 2000; 119 (1): 182-188. DOI: 10.1046/j.1365-2249.2000.01097.x.
16. Dikov M., Ohm J., Ray N., Tchekneva E.E., Burlison J., Moghanaki D., Nadaf S., Carbone D.P. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptors 1 and 2 in dendritic cell differentiation. J. Immunol. 2005; 174 (1): 215-222. DOI: 10.4049/jimmunol.174.1.215.
17. Koch S., Tugues S., Li X., Gualandi L., Claesson-Welsh L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Biochem. J. 2011; 437 (2): 169-183. DOI: 10.1042/ BJ20110301.
18. Oh H., Yu C.R., Golestaneh N., Amadi-Obi A., Lee Y.S., Es-eonu A., Mahdi R.M., Egwuagu C.E. STAT3 protein promotes T-cell survival and inhibits interleukin-2 production through up-regulation of Class O Forkhead transcription factors. J. Biol. Chem. 2011; 286 (35): 30888-30897. DOI: 10.1074/jbc. M111.253500.
19. Shin J.Y., Yoon I.H., Kim J.S., Kim B., Park C.G. Vascular endothelial growth factor-induced chemotaxis and IL-10 from T cells. Cell Immunol. 2009; 256 (1-2): 72-78. DOI: 10.1016/j.cellimm.2009.01.006.
20. Mobini M., Mortazavi M., Nadi S., Zare-Bidaki M., Pourtalebi S., Arababadi M.K. Significant roles played by interleukin-10 in outcome of pregnancy. Iran J. Basic Med. Sci. 2016; 19 (2): 119-124.
21. Sabat R., Grütz G., Warszawska K., Kirsch S., Witte E., Wolk K., Geginat J. Biology of interleukin-10. Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21 (5): 331-344. DOI: 10.1016/j. cytogfr.2010.09.002.
22. Jankovic D., Kugler D., Sher A. IL-10 production by CD4+ effector T cells: a mechanism for self-regulation. Mucosal. Immunol. 2010; 3 (3): 239-246. DOI: 10.1038/mi.2010.8.
23. Emmerich J., Mumm J.B., Chan I.H., LaFace D., Truong H., McClanahan T., Gorman D.M., Oft M. IL-10 directly activates and expands tumor-resident CD8(+) T cells without de novo infiltration from secondary lymphoid organs. Cancer Research. 2012; 72 (14): 3570-3581. DOI: 10.1158/0008-5472. CAN-12-0721.
24. Smith L.K., Boukhaled G.M., Condotta S.A., Mazouz S., Guthmiller J.J., Vijay R., Butler N.S., Bruneau J., Shoukry N.H., Krawczyk C.M, Richer M.J. Interleukin-10 directly inhibits CD8+ T cell function by enhancing N-glycan branching to decrease antigen sensitivity. Immunity. 2018; 48 (2): 299312: e5. DOI: 10.1016/j.immuni.2018.01.006.
25. Hou H., Cheng S., Chung K., Wei S., Tsao P., Lu H., Wang H., Yu C. PlGF mediates neutrophil elastase-induced airway epithelial cell apoptosis and emphysema. Respir. Res. 2014; 15 (1): 106. DOI: 10.1186/s12931-014-0106-1.
26. Chiu Y.M., Tsai C.L., Kao J.T., Hsieh C.T., Shieh D.C., Lee Y.J., Tsay G.J., Cheng K.S., Wu Y.Y. PD-1 and PD-L1 up-regulation promotes T-cell apoptosis in gastric adeno-carcinoma. Anticancer Res. 2018; 38 (4): 2069-2078. DOI: 10.21873/anticanres.12446.
27. Meggyes M., Miko E., Szigeti B., Farkas N., Szereday L. The importance of the PD-1/PD-L1 pathway at the maternal-fetal interface. BMC Pregnancy Childbirth. 2019; 19 (1): 74. DOI: 10.1186/s12884-019-2218-6.
28. Shi F., Shi M., Zeng Z., Qi R., Liu Z., Zhang J., Yang Y., Tien P., Wang F.S. PD-1 and PD-L1 up-regulation promotes CD8(+) T-cell apoptosis and postoperative recurrence in he-patocellular carcinoma patients. Int. J. Cancer. 2011; 128 (4): 887-896. DOI: 10.1002/ijc.25397.
29. Banerjee H., Kane L.P. Immune regulation by Tim-3. F1000Res. 2018; 7: 316. DOI: 10.12688/f1000research.13446.1.
30. Voron T., Colussi O., Marcheteau E., Pernot S., Nizard M., Pointet A., Latreche S., Bergaya S., Benhamouda N., Tanchot C., Stockmann C., Combe P., Berger A., Zinzindohoue F., Yagita H., Tartour E., Taieb J., Terme M. VEGF-A modulates expression of inhibitory checkpoints on CD8+ T cells in tumors. J. Exp. Med. 2015; 212 (2): 139-148. DOI: 10.1084/jem.20140559.
31. Laresgoiti-Servitje E. A leading role for the immune system in the pathophysiology of preeclampsia. J. Leukoc. Biol. 2013; 94 (2): 247-257. DOI: 10.1189/jlb.1112603.
32. Geldenhuys J., Rossouw T., Lombaard H., Ehlers M., Kock M. Disruption in the regulation of immune responses in the placental subtype of preeclampsia. Front Immunol. 2018; 9: 1659. DOI: 10.3389/fimmu.2018.01659.
Вклад авторов
Черных Е.Р., Останин А.А. - разработка концепции и дизайна. Сметаненко Е.А., Леплина О.Ю. - культуральные работы. Тихонова М.А. - пробоподготовка для цитометрического анализа, цитометрический анализ проб. Леплина О.Ю., Пасман Н.М., Черных Е.Р. - анализ и интерпретация данных. Останин А.А., Черных Е.Р., - подготовка текста статьи. Черных Е.Р. - окончательное утверждение для публикации рукописи.
Сведения об авторах
Сметаненко Екатерина Александровна, аспирант, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск.
Леплина Ольга Юрьевна, д-р мед. наук, вед. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID 0000-0003-3169-8643.
Тихонова Марина Александровна, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID 0000-0002-2366-1667.
Пасман Наталья Михайловна, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии, Институт медицины и психологии, ННИГУ, г. Новосибирск.
Останин Александр Анатольевич, д-р мед. наук, профессор, гл. науч. сотрудник, лаборатория клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID 0000-0001-6895-938X.
Черных Елена Рэмовна, д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАН, зав. лабораторией клеточной иммунотерапии, НИИФКИ, г. Новосибирск. ORCID 0000-0003-2346-6279.
(*) Черных Елена Рэмовна, e-mail: ct_lab@mail.ru.
Поступила в редакцию 11.12.2019 Подписана в печать 30.04.2020
