CC BY
130
СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ
КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ИММУННОЙ СУПРЕССИИ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ
Жулай Г. А., Олейник Е. К., Островский К. А., Олейник В. М., Кравченко П. Н., Чуров А. В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск
ALTERATIONS OF LYMPHOCYTE SUBSETS AND INDICATORS OF IMMUNE SUPPRESSION IN PATIENTS WITH ACUTE PANCREATITIS
Zhulai G. A., Oleinik E. K., Ostrovskii K. A., Oleinik V. M., Kravchenko P. N., Churov A. B.
Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences, Petrozavodsk
Жулай Г. А., младший научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН Чуров А. В. научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН, к. б. н. Кравченко П. Н., аспирант ИБ КарНЦ РАН
Олейник Е. К., главный научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН, д. б. н., доц. Олейник В. М, ведущий научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН, д. б. н.
Островский К. А., врач ординатор НУЗ Отделенческой клинической больницы на ст. Петрозаводск, к. м. н. Zhulai G. A. Junior Research Associate IB KarRC RAS Churov A. B. Research Associate IB KarRC RAS, PhD Kravchenko P. N. PhD student IB KarRC RAS,
Oleinik E. K. Chief Research Associate IB KarRC RAS, PhD, Dr. of Biology, Assistant Professor Оleinik V. M. Leading Research Associate IB KarRC RAS, PhD, Dr. of Biology
Оstrovskii K. A. resident doctor of Department of clinical hospital at the station Petrozavodsk, Candidate of Medicine Sciences
Жулай Галина Анатольевна
Zhulai Galina A.
E-mail:
zhgali-111@rambler.ru
Резюме:
Цель исследования: оценка изменений состава субпопуляций лимфоцитов, а также некоторых показателей, отражающих развитие иммунной супрессии (содержание регуляторных Т-клеток (Treg), уровень экспрессии СТГА-4 (антиген цитотоксических Т-лимфоцитов — 4) и интерлейкина (Щ — 10) у больных острым панкреатитом (ОП).
Материалы и методы. Для анализа лимфоцитов была исследована периферическая кровь 21 больного ОП (в том числе 11 человек с острым деструктивным панкреатитом (ОДП)). В качестве контроля анализировали 11 образцов крови здоровых доноров. Оценка экспрессии молекул лимфоцитов проводилась методом проточной цитометрии.
Результаты. Достоверные отличия от контроля обнаружены для CD3+ Т-клеток и их субпопуляции CD4+Т-хелперов, количество которых у больных ОП было ниже, чем в контроле. У лиц с ОДП отмечены более значительные изменения: наряду с уменьшением числа Т-лимфоцитов было снижено количество CD19+ В-лимфоцитов и CD4+ CD25+ активированных Т-хелперов, а содержание CD8+ Т-клеток было выше. В группе больных ОП значение иммунорегуляторного индекса (соотношение CD4+/ CD8+, ИРИ) также было ниже, чем у здоровых доноров. В результате исследования показателей иммунной супрессии было выявлено, что у больных ОП содержание Т^-клеток (CD4+CD25hl и CD4+CD25+CD127lo) выше, чем в контроле. Уровень экспрессии ингибиторной молекулы CTLA-4 в популяции CD4+CD25hl Т^ клеток у больных ОП также был увеличен. Кроме того было отмечено, что у CD4+CD25+ Т-клетки больных острым панкреатитом продуцируют противовоспалительный цитокин ^-10 больше, чем CD4+CD25+ Т-клетки здоровых доноров.
Заключение. У больных ОП были выявлены изменения клеточного иммунитета (особенно у больных с ОДП), которые могут свидетельствовать о возможном развитии вторичного иммунодефицита. Вероятно, это связано с формированием иммунной супрессии, о чем свидетельствует увеличение содержания Т^-клеток, экспрессии CTLA-4 и ^-10 у больных ОП.
Ключевые слова: острый панкреатит, иммунная супрессия, регуляторные Т-клетки, CTLA-4, интерлейкин 10 Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 109 (9):21-25
Summary:
The aim of study: assessment of changes in lymphocyte number and some indicators of the immune suppression (frequency of regulatory T cells (Treg), the level of expression of CTLA-4 (cytolytic T lymphocyte-associated antigen 4) and interleukin (IL) — 10) in patients with acute pancreatitis (AP).
Materials and methods. Peripheral blood samples of 21 patients with AP (including 11 patients with pancreatic necrosis (PN)) were studied for analysis of lymphocyte subsets and 11 blood samples of healthy donors were estimated as control. Evaluation of the expression of molecules of lymphocytes was carried out by flow cytometry.
Results. It was found that percentage of CD3+ T cells and their subpopulation of CD4+ T-helper cells in patients with AP were decreased as compared to the control group. Substantial changes were observed in patients with PN: together with decrease in the number of T cells, CD19+ B cells and CD4+CD25+ activated T-helper cells were also reduced, and the percentage of CD8+ T cells was higher. The immunoregulatory index (CD4+/CD8+) was lower in the group of patients, than in control group. The frequency of Treg cells (CD4+ CD25hi and CD4+CD25+CD127lo) was higher in patients with AP than in the control. The expression level of the inhibitory molecule CTLA-4 in the subset of CD4+CD25hi Treg cells in patients with AP was also increased. Moreover, it was found that the expression level of anti-inflammatory cytokine IL-10 was higher in T-helper cells from patients with AP.
Conclusion. Changes in cellular immunity (especially patients with PN) were found in patients wish AP. These changes may indicate the possible development of secondary immunodeficiency. This is probably related to the generation of immune suppression, since the values of the investigated parameters (frequency of Treg cells, the expression of CTLA-4 and IL-10) in patients with AP were higher than in controls.
Keywords: acute pancreatitis, immune suppression, regulatory T-cells, CTLA-4, interleukin 10 Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 109 (9):21-25
Введение
В последние десятилетия, несмотря на появление новых методов лечения, частота тяжелых форм острого панкреатита не уменьшается, а смертность от этого заболевания остается высокой — более 10% [1, 2]. Острый панкреатит (ОП) является многофакторным заболеванием, и его развитие часто связывают с дисбалансом в функционировании иммунной системы [1, 2, 3, 4]. Предполагается, что при развитии ОП может формироваться системная иммунная супрессия. Действие супрессорных механизмов может снижать сопротивляемость организма к инфекциям и способствовать прогрессии заболевания. В связи с этим, одним из перспективных направлений в лечении больных ОП является применение иммуномоду-ляторов [1, 5, 6]. Однако для повышения эффективности иммунотерапии и поиска специфических мишеней необходимо понимание механизмов развития нарушений со стороны иммунной системы, приводящих к подавлению иммунного ответа.
Особый интерес в изучении феномена иммунной супрессии представляет популяция регуляторных Т-клеток (Тгед). Эта группа лимфоцитов участвует в поддержании иммунологической толерантности к аутоантигенам организма благодаря способности подавлять активацию, пролиферацию и эффектор-ные функции различных иммунокомпетентных клеток. Впервые Тгед-клетки были описаны как CD4+ Т-лимфоциты с высокой конститутивной экспрессией а-цепи рецептора к интерлейкину (1Ь) — 2 (CD25) [7]. Для идентификации Тгед-клеток также может
Материалы и методы.
В работе исследован 21 образец периферической крови больных ОП. Диагноз был поставлен на основе классификации, принятой на IX Всероссийском съезде хирургов в 2000 году. Среди обследованных
применяться мембранный маркер CD127 (IL-7Rа), экспрессия которого находится в обратной зависимости от экспрессии транскрипционного фактора БОХР3, необходимого для развития Тгед-клеток и их супрессорной функции [8]. В настоящее время описан широкий спектр возможных механизмов иммунной супрессии, опосредованной Тгед-клетками [7, 9]. Одним из наиболее важных способов имму-носупрессии является конститутивная экспрессия Тгед-клетками ингибиторной молекулы СТЬЛ-4. Связывание СТЬЛ-4 с молекулами семейства В7 на поверхности иммунокомпетентных клеток препятствует их активации и дальнейшему функционированию.
Развитие иммунной супрессии при ОП часто связывают с увеличением секреции цитокина 1Ь-10 [2, 4, 6]. В норме он играет важную роль в предупреждении воспаления и аутоиммунных процессов. Первоначально было показано, что 1Ь-10 секрети-руется Т-хелперами 2 типа (Й2). Однако сегодня известно, что экспрессия этого цитокина характерна для разных популяций клеток врожденного и адаптивного иммунитета [10].
В настоящее время значение этих иммуносупрес-сорных механизмов при развитии ОП изучено слабо, поэтому целью данной работы была оценка изменений клеточного иммунитета, а также уточнение роли некоторых показателей, отражающих развитие иммунной супрессии (содержание Тгед-клеток, уровень экспрессии СТЬЛ-4 и 1Ь-10) у больных ОП.
11 человек имели деструктивную форму ОП. Средний возраст больных составил 44,8±17,0 лет. Забор крови осуществляли на 1 - 10 сутки после поступления на лечение, до оперативного вмешательства.
В качестве контроля были проанализированы 13 образцов крови здоровых доноров, сопоставимых по возрасту (39,5±14 лет). Оценку содержания популяций лимфоцитов проводили методом многоцветной проточной цитометрии на приборе Cytomics FC500, с применением программного обеспечения CXP 2.0 («Beckman Coulter», США). Исследование выполнено с использование приборной базы центра коллективного пользования научным оборудованием ИБ КарНЦ РАН. Для окрашивания клеток применяли следующие моноклональные антитела: CD3, CD4, CD8, CD19, CD16, CTLA-4-PE, IL-10 меченные FITC и PE, а также соответствующие изотипические
контроли. Для определения Тгед-клеток были использованы моноклональные антитела: CD4-FITC, СЭ25-РС5, СЭ127-РС7. Внутриклеточное окрашивание для определения экспрессии С^А-4 и ^-10 выполняли с помощью реагента для пермеабилизации. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0, достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна-Уитни при уровне значимости р < 0,05, для выявления и оценки характера связи между признаками использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. В таблицах и на рисунках результаты представлены в виде M±SD.
Результаты
В работе оценивали относительное содержание CD3+ Т-лимфоцитов и их субпопуляций: Т-хелперов (СВ3+СБ4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ, CD3+CD8+). Также был проведен анализ числа В-клеток (CD19+CD3- ) и натуральных киллеров ^К, СП16+СЭ3 — ). Оказалось, что у больных ОП количество CD3+ Т-клеток снижено по сравнению с контролем (табл. 1). Достоверных различий в содержании В-клеток и NK-клеток не обнаружено.
Снижение уровня Т-клеток сопровождалось изменением в содержании Т-хелперов. Число Т-хелперов у больных ОП было меньше (р < 0,05), чем в контроле, тогда как значительных изменений количества ЦТЛ выявлено не было (табл. 3). Эти изменения повлияли на значение иммуннорегуляторного индекса (ИРИ), отражающего баланс Т-хелперов и ЦТЛ. У больных ИРИ был снижен (р < 0,05) по сравнению с контролем в 1,6 раза (табл. 2).
Для детального анализа изменений в клеточном иммунитете больные ОП были разделены на две группы: лица с острым деструктивным панкреатитом (ОДП) и больные ОП с отечной формой (ОФ). Как и предполагалось, для больных с ОФ и ОДП характерны те же изменения, как и для общей группы больных ОП: число Т-клеток, Т-хелперов и ИРИ
были снижены по сравнению с контролем (р < 0,05, табл. 1 и 2). При этом в группе больных с ОДП нами были отмечены более существенные изменения в клеточном составе. Например, снижение ИРИ у больных в этой группе было обусловлено не только уменьшением числа Т-хелперов, но и увеличением количества ЦТЛ (р < 0,05, табл. 2). Содержание В-клеток было почти вдвое меньше, чем в контроле (р < 0,05, табл. 1).
Для формирования адекватной иммунной реакции на антиген и его последующей элиминации из организма важна активация пула лимфоцитов, особенно популяции Т-хелперов. В работе мы оценили количество активированных Т-хелперов по экспрессии маркера CD25. Согласно полученным результатам, число CD4+CD25+ Т-клеток у больных с ОФ не отличалось от контроля, а в группе с ОДП число активированных Т-хелперов было снижено (р < 0,05, табл. 2). Полученные данные о состоянии клеточного иммунитета больных ОП могут свидетельствовать о возможном развитии у больных острым панкреатитом вторичного иммунодефицита. Причем более значительные изменения в содержании популяций лимфоцитов наблюдались у больных с панкреонекрозом.
Т-лимфоциты B-лимфоциты NK-клетки
(CD3+) (CD19+CD3 - ) (CD16+CD3 - )
Контроль 70,94±3,2 9,68±3,0 13,4±4,4
ОП, общая группа 63,87±7,1* 7,9±5,2 17,0±7,4
ОФ 63,61±7,7* 9,66±5,3 16,55±8,3
Таблица 1.
Относительное содержание популяций лимфоцитов у здоровых доноров и у больных ОП, % от общего числа лимфоцитов
ОДП
64,2±6,9*
5,64±2,6*
17,55±6,7
Примечание. ОП — острый панкреатит, ОФ — отечная форма острого панкреатита, ОДП — острый деструктивный панкреатит; * — разница достоверна по критерию Манна-Уитни по отношению к контролю, р < 0,05
Т-хелперы (CD3+CD4+) Активированные Т-хелперы (CD4+CD25+) Цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) ИРИ (CD4+/ CD8+)
Контроль 44,56±7,0 10,58±3,1 21,54±4,4 2,19±0,7
ОП, общая группа 34,46±9,0* 7,97±3,2 28,2±7,7 1,36±0,7*
ОФ 36,31±6,7* 9,71±2,4 25,35±5,6 1,49±0,4*
ОДП
32,08±11,61*
4,84±1,64*
31,85±8,8*
1,2±0,9*
Таблица 2.
Относительное содержание Т-хелперов и ЦТЛ у здоровых доноров и больных ОП, % от общего количества Т-лимфоцитов
Примечание. ОП — острый панкреатит, ОФ — отечная форма острого панкреатита, ОДП — острый деструктивный панкреатит; * — разница достоверна по критерию Манна-Уитни по отношению к контролю, р < 0,05
Анализ показателей иммунной супрессии проводили у 14 больных ОП, у 5 из которых была диагностирована деструктивная форма ОП. Для определения количества Тгед-клеток были использованы фенотипы CD4+CD25hi и CD4+CD25+CD127lo. У больных ОП содержание CD4+CD25hi Т-клеток было почти вдвое выше, а CD4+CD25+CD127lo Т-клеток в полтора раза выше по сравнению с контролем (р < 0,05, рис. 1). Кроме того, была выявлена обратная корреляция между содержанием в крови больных ОП Тгед-клеток как для фенотипа CD4+CD25hi, так и для фенотипа CD4+CD25+CD127lo и количеством CD3+ Т-лимфоцитов (г = -0,69, р < 0,05 и г = -0,68, р < 0,05, соответственно).
В результате анализа экспрессии негативной регу-ляторной молекулы СТГА^ было показано, что уровень экспрессии этой молекулы CD4+ Т-хелперами у больных ОП не отличался от контроля (рис. 2), тогда как количество CD4+CD25hi Тгед-клеток, экс-прессирующих СТГА^ было более чем вдвое выше
Обсуждение
Нарушение в работе иммунной системы является одним из возможных механизмов развития тяжелых форм ОП и высокой летальности при этом заболевании. В значительной степени это может быть связано с формированием иммунной супрессии у больных ОП. В связи с этим ряд авторов подчеркивает необходимость иммунотерапии больных ОП, и ведется поиск эффективных мишеней [1, 5, 6]. Литературные сведения [1, 4, 11, 12], а также полученные в результате нашего исследования данные указывают на снижение числа циркулирующих Т-лимфоцитов, особенно количества CD4+ Т-хелперов у больных ОП. Вследствие чего происходит нарушение баланса
Рисунок 1.
Содержание CD4+CD25Ы и CD4+CD25+CD127lo Ъ^-клеток в периферической крови больных ОП и в контроле, % от числа CD4+ Т-клеток.
Примечание. Данные представлены в виде M±SD; ОП — острый панкреатит; * — разница достоверна по критерию Манна-Уитни по отношению к контролю, р < 0,05
Рисунок 2.
Содержание CD4+ Т-клеток, экспрессирующих молекулу CTLA-4, в периферической крови больных ОП и в контроле, % от числа CD4+ Т-клеток.
Примечание. Данные представлены в виде M±SD; ОП — острый панкреатит; * — разница достоверна по критерию Манна-Уитни по отношению к контролю, р < 0,05
по сравнению с контролем (рис. 2, p < 0,05). Это может свидетельствовать об усилении функционирования Treg-клеток при развитии ОП.
Многие авторы отмечают, что наряду с увеличением уровня провоспалительных цитокинов у больных ОП повышается уровень IL-10 в сыворотке крови [2, 4, 6]. Однако продуцентами IL-10 являются различные популяции иммунных клеток, в том числе моноциты, тучные клетки и ряд других [10]. Чтобы оценить уровень продукции IL-10 Т-хелперами, нами была проведена оценка экспрессии внутриклеточного IL-10 в популяции CD4+ Т-клеток. Значительных различий в содержании CD4+CD25-IL-10+ Т-клеток у больных ОП и здоровых доноров выявлено не было, тогда как количество активированных CD4+ Т-хелперов, экспрессирующих IL-10, у больных ОП было выше, чем в контроле (0,37±0,3 и 0,15±0,06% от CD4+ Т-клеток, соответственно, p < 0,05).
CD4+/CD8+ Т-клеток в сторону снижения ИРИ. Это может быть признаками развития вторичного иммунодефицита, о чем свидетельствует также снижение числа В-клеток и активированных Т-хелперов у больных с тяжелой формой ОДП.
В литературе отмечается, что истощение пула периферических лимфоцитов, происходящее в сроки от 1 до 7 - 14 дней после поступления больного ОП, связано с увеличением уровня апоптоза этих клеток [3, 4, 11]. Так, уже на 1 - 4-е сутки это особенно было выражено для CD4+ Т-хелперов, но не CD8+ ЦТЛ [3]. Характеризуя начальный этап заболевания, М. Р1е1гис2ик и соавт. [4] показали, что происходит усиление экспрессии маркеров активации ^69, CD25, CD28, CD38 и CD122) на поверхности периферических Т-лимфоцитов. Однако в отношении маркера CD25 нам этого проследить не удалось, возможно, это связано с тем, что обследование больных нами проводилось в более широком диапазоне (от 1-х до 10-х суток после поступления).
На ранней стадии острого панкреатита ряд авторов отмечает значительное увеличение уровня цитокинов ^-5, ТОТ-а, ^-6 [2, 13, 14, 4], запускающих каскад реакций, приводящих к чрезмерному иммунному ответу. По мере развития заболевания усиленная активация иммунокомпетентных клеток сменяется увеличением уровня апоптоза периферических лимфоцитов, что, вероятно, и приводит к снижению их количества. Кроме того, снижение количества клеток определенных популяций может наблюдаться в связи с формированием у больных ОП иммунной супрессии, как компенсаторного механизма, ограничивающего степень развития воспалительных реакций [6]. Об этом свидетельствует повышенное содержание в периферической крови Тгед-клеток, усиление экспрессии ими инги-биторной молекулы О^А-4, а также повышенная экспрессия Т-хелперами противовоспалительного цитокина ^-10 у больных ОП.
По данным литературы число CD4+CD25+FOXP3+ Тгед-клеток у этих больных увеличивается
от момента поступления на лечение и в течение последующих 7 - 14 дней, при этом количество этих клеток зависит от степени тяжести заболевания [2]. Возможно, активация супрессорных механизмов в ответ на развивающееся системное воспаление при остром панкреатите может играть защитную
Заключение
В результате работы были определены изменения, происходящие в содержании клеточных популяций периферических лимфоцитов у больных ОП. Отмечено, что наряду с наличием признаков вторичного иммунодефицита, у больных ОП происходит увеличение количества супрессорной популяции Treg-клеток, а также усиление экспрессии ими
Литература
1. Винник Ю. С., Дунаевская С. С. Оценка тяжести пан-креатогенного иммунодефицита // Новости хирургии. — 2013. — Том 21, № 4. — с. 40 - 44
2. Li J. P., Yang J., Huang J. R. et al. Immunosuppression and the infection in patients with early SAP // Front Biosci (Landmark Ed). — 2013. -Vol. 18. — P. 892 - 900.
3. Mylona V., Koussoulas V., Tzivras D. et al. Changes in adaptive and innate immunity in patients with acute pancreatitis and systemic inflammatory response syndrome // Pancreatology. — 2011. — Vol. 11. — P. 475 - 481.
4. Pietruczuk M., Dabrowska M. I., Wereszczynska-Siemiat-kowska U. et al. Alteration of peripheral blood lymphocyte subsets in acute pancreatitis // World J Gastroenterol. — 2006. — Vol. 12, no. 33. — P. 5344 - 5351.
5. WangX., Li W., Niu C. et al. Thymosin alpha 1 is associated with improved cellular immunity and reduced infection rate in severe acute pancreatitis patients in a double-blind randomized control study // Inflammation. — 2011. — Vol. 34, no. 3. -P. 198 - 202.
6. Zhang X. P., Chen H. Q., Liu F., Zhang J. Advances in researches on the immune dysregulation and therapy of severe acute pancreatitis // J Zhejiang Univ Sci B. — 2009. — Vol. 10, no. 7. — P. 493 - 498.
7. Sakaguchi S., Miyara M., Costantino C. M., Haf-ler D. A. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune
роль для клеток и тканей организма. С другой стороны, снижение содержания и уровня активации иммунокомпетентных клеток, происходящее в результате подавления иммунного ответа, делает организм более чувствительным к инфекциям, что может вызвать серьезные осложнения.
негативного ко-стимулятора СТГА-4. Дальнейшее исследование функционирования Т^-клеток позволит лучше понять природу иммунодефицита, развивающегося у больных с острым панкреатитом, и наметить новые мишени для иммунной терапии.
Исследование выполнено при поддержке РФФИ (проект № 13-04-98826).
system // Nat. Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10. — P. 490 - 500.
8. Seddiki N., Santner-Nanan B., Martinson J. Expression of interleukin (IL) — 2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells // 1. Exp. Med. — 2006. -Vol. 203. — P. 1693 - 1700.
9. Shevach E. M. Mechanisms of Foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression // Immunity. — 2009. — Vol. 30. — P. 636 - 645.
10. Saraiva M., O'GarraA. The regulation of IL-10 production by immune cells // Nat Rev Immunol. — 2010 — Vol. 10, no. 3. — P. 170 - 181
11. Qin Y., Pinhu L., You Y. et al. The role of Fas expression on the occurrence of immunosuppression in severe acute pancreatitis // Dig Dis Sci. — 2013. — Vol. 58. — P. 3300 - 3307
12. Ueda T, Takeyama Y, Yasuda T. et al. Immunosuppression in patients with severe acute pancreatitis // 1 Gastroenterol. — 2006. — Vol. 41. — P. 779 - 784.
13. Malleo, G., Mazzon, E., Siriwardena, A. K. et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence // Shock. — 2007. — Vol. 28, no. 2. — P. 130 - 140.
14. Mofleh Al IA. Severe acute pancreatitis: pathogenetic aspects and prognostic factors // World 1 Gastroenterol. 2008. Vol. 14. P. 675 - 684.
