CC BY
15
УДК 616.61-06
ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ЕГО РЕЦЕПТОР ВТОРОГО ТИПА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И В ОПУХОЛИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ
М.Ф. Трапезникова1, П.В. Глыбин, В.Г. Туманян, Е.С. Герштейн, В.В. Дутов, Н.Е. Кушлинский
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского,
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
На основании исследования 37 больных раком почки сделан вывод: в исходных показателях VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови больных и у здоровых людей (контрольная группа) достоверных различий не наблюдалось. В сыворотке крови больных между содержанием VEGF и VEGFR-2 зафиксирована прямая связь. В опухоли отмечен более высокий уровень VEGF по сравнению с таковым в неизмененной ткани почки. При этом уровень VEGF в опухоли не был связан со стадией процесса и гистологическим строением опухоли, но достоверно повышался при снижении степени дифференцировки рака и увеличении показателя первичной опухоли Т. В свою очередь показатели VEGFR-2 в опухоли почки были достоверно выше у женщин и ниже у мужчин по сравнению с неизмененной тканью, не зависели от возраста пациентов, стадии болезни, показателя распространенности первичной опухоли Т, гистологического строения опухоли, но достоверно снижались при увеличении степени ее дифференцировки и инвазии псевдокапсулы опухоли. Независимо от пола пациентов отмечена прямая корреляция содержания VEGFR-2 в опухоли и неизмененной ткани почки. В опухоли почки у больных с ее благоприятными клиническими признаками более высокому содержанию VEGF чаще соответствовало более высокое содержание его рецептора.
Ключевые слова: фактор роста эндотелия сосудов, его рецептор, рак почки
Key words: renal carcinoma, vascular endothelial growth factor, ets receptor
1 Трапезникова Мария Федоровна, академик РАМН, д-р мед. наук, профессор, МОНИКИ. Тел.: 8 (495) 62-66-07.
Рак почки в структуре онкологических заболеваний составляет 2—3% [1] и 85% среди всех первичных злокачественных опухолей почки [2]. Прирост абсолютного числа заболевших раком почки в России за период с 1993 по 2003 г. составил 55%. В России, по данным за 2003 г., смертность от рака почки составила 7,9 тыс человек. В структуре умерших от злокачественных новообразований на его долю приходится 2,7% [3].
Известно, что общая выживаемость больных раком почки зависит от многих причин, в том числе от стадии заболевания, степени диффе-ренцировки опухоли, хирургической тактики и составляет 77% — 5 лет и 69% — 10 лет. В поздних стадиях заболевания эти показатели резко снижаются и составляют соответственно 28 и 16,3% в IV стадии опухолевого процесса [4], а используемые в лечении распространенных форм рака почки интерлейкин-2 и интерферон-а как в монорежимах, так и в комбинации неубедительны, частота объективного эффекта составляет 18-20% [5].
В последнее десятилетие исследователи уделяют пристальное внимание изучению механизмов неоангиогенеза в опухолях, в том числе и при раке почки. Стало известно, что опухоль, равно как и любая другая ткань, с определенного времени не может расти без адекватного снабжения кислородом, которое обеспечивается развитием сосудистой сети в подверженных гипоксии участках [6].
Изучение молекулярных механизмов ангиоге-неза в последние 5-10 лет привело к обнаружению целого ряда активаторов и ингибиторов ан-гиогенеза, динамический баланс которых обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли. При этом важным положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов ^ЕСР) [7,8] — мультифункциональный цитокин, вызывающий пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, и в отличие от всех других факторов роста он митогенен в основном по отношению к эндотели-альным клеткам. Кроме того, VEGF активирует урокиназу и коллагеназу, в результате чего происходит лизис эндотелиального матрикса, что повышает способность эндотелиальных клеток к миграции, а опухолевых - к инвазии и метаста-зированию [8]. Вместе с тем стало известно, что
развитие кровеносных и лимфатических сосудов зависит от влияния других членов семейства VEGF и их рецепторов [9, 10]. При этом VEGF индуцирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, защищает их от апоптоза. Полагают, что VEGF является ключевым фактором неоангиогенеза при раке почки.
На поверхности эндотелиальных клеток имеется три рецептора VEGF, являющихся типичными рецепторными тирозинкиназами: рецептор VEGFR-1 (flt-1), рецептор VEGFR-2 (KDR/Flk-1), рецептор VEGFR-3 - продукт гена flt-4, в отличие от VEGFR-1 и 2 взаимодействует не с классическим VEGF (VEGF А), а с его гомологом — VEGF С, обладающим лимфоанги-огенной активностью. VEGF A (далее в тексте как VEGF) обеспечивает биологический эффект посредством взаимодействия с VEGFR. После прикрепления VEGF к экстрацеллюлярной области рецептора, димеризации и аутофосфори-лирования последнего внутриклеточный участок рецептора способствует запуску каскадной активации протеинов, которые в свою очередь воздействуют на различные составляющие ангиоге-неза [11]. Исследователи, которые изучали роль VEGF и его рецепторов в процессе неоангиогене-за при раке почки, пытались ответить на вопрос о возможной связи продукции VEGF с прогнозом заболевания. Однако результаты оказались противоречивыми. Так, V. Paradis и соавт. (2000) пришли к заключению, что уровень VEGF у больных раком почки может выступать независимым прогностическим фактором наряду со стадией болезни и степенью дифференцировки опухоли [12]. По данным G. Djordjevic и соавт. (2007), гиперпродукция VEGF при светлоклеточном раке почки является неблагоприятным прогностическим признаком, так как ассоциируется со степенью дифференцировки и размером опухоли, уровнем пролиферативной активности [13].
В отличие от работ V. Paradis и соавт. (2000) и G. Djordjevic и соавт. (2007), другие исследователи полагают, что экспрессия VEGF в опухоли почки не может служить независимым прогностическим показателем, и не отметили достоверной разницы между уровнем VEGF и различными подтипами почечно-клеточного рака [14]. По данным D. Minardi и соавт. (2005), которые провели иммуногистохимическое исследование VEGF
в раке почки, только степень дифференцировки опухоли является прогностическим фактором выживаемости, а не уровень продукции VEGF в опухоли, но фактор роста позволяет распределять пациентов на группы, отличающиеся в прогностическом отношении [15].
Особый интерес представляли исследования по диагностике рака почки с учетом уровня VEGF в сыворотке крови. K. Sato и соавт. (1999) установили, что чувствительность сывороточного VEGF выше 100 пкг/мл при раке почки составляет 80%, специфичность — 72,7%, и предположили, что сывороточный VEGF может служить маркером рака почки [16]. J. Jacobsen и соавт. (2000), несмотря на то что у пациентов с низким уровнем VEGF-165 в сыворотке крови достоверно более длительный период выживаемости, при многофакторном анализе показали, что только стадия и степень дифференцировки рака почки являются независимыми прогностическими параметрами [17]. Это подтверждают и данные исследования L. Schips (2007) [18].
Учитывая, что блокирование ангиогенеза является перспективным направлением в терапии рака почки, а данные проведенных ранее работ, посвященных неоангиогенезу, порой противоречивы, необходимо дальнейшее изучение данной проблемы, анализ взаимосвязи неоангиогенной активности опухолевой ткани с основными кли-нико-морфологическими характеристиками болезни, что и послужило целью настоящего исследования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включено 37 больных раком почки в возрасте 33—78 лет (медиана 56 лет), 18 (48,7%) мужчин и 19 (51,3%) женщин. По стадиям больные распределялись следующим образом: T1 N0 M0 — 10 (27%), T1bN0 M0 - 9 (24,3%), T2N0 M0 - 6 (16,2%), T3aN0 M0 - 6 (16,3%), T3bN0 M0 - 4 (10,8%), T3bN1 M0 - 1 (2,7%), T1bN0 M1 - 1 (2,7%). Степень дифференцировки опухоли (Fuhrman grade) установлена у всех больных: G1 - 8 (21,6%), G2 - 16 (43,3%), G3 - 8 (21,6%), G4 - 5 (13,5%).
Показатели VEGFR-2 определяли в сыворотке крови у 37 больных и у 57 практически здоровых людей соответствующего возраста (12 мужчин и 45 женщин), которые составили группу контроля. Содержание VEGF А (далее просто VEGF) определяли в сыворотке крови у 33 больных и у 37 практически здо-
ровых людей (группа контроля). Содержание VEGF и VEGFR-2 определяли также в 31 образце неизмененной ткани и в 35 образцах опухоли больных.
Кровь у здоровых людей и больных (до лечения) брали из кубитальной вены с 8.00 до 9.00 часов натощак. Сыворотку крови отделяли от форменных элементов при центрифугировании в течение 10 мин при 2500 хg при температуре 4—8°С, разливали по аликвотам и хранили в течение 2—3 недель при температуре —40°С до исследования.
Концентрацию VEGF и VEGFR-2 определяли прямым иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов «Quantikine human VEGF» и «Quantikine® Human VEGFR-2 Immunoassay» («R&D Systems 1пс.», США) в соответствии с инструкцией производителя. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELх800 фирмы «Bio-Tek Instruments, Inc.» (США).
Концентрацию VEGF в тканях выражали в пикограммах (пг) на 1 мг белка, VEGFR-2 — в нона-граммах (нг) на 1 мг белка, определенного по методу Лоури.
При сравнении показателей использовали критерий Стъюдента, критерий Манна—Уитни, медианный тест Крускала—Уоллиса, парный критерий Вил-коксона, корреляционный тест Пирсона (r) и тест корреляции рангов Спирмена ( R). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы «Statistica 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех исследованных образцах опухолей и неизмененной ткани почки, а также в сыворотке крови больных и в группе контроля обнаружены измеримые количества VEGF и VEGFR-2.
В сыворотке крови больных содержание VEGF было связано с VEGFR-2 слабой прямой достоверной корреляцией (rs = 0,37; p = 0,026). В исследуемых тканях подобной зависимости не отмечено. Обнаружена прямая корреляция между содержанием VEGF в сыворотке и в опухоли больных (r = 0,36; p = 0,049). Данная зависимость не была характерна для рецептора VEGFR-2.
Концентрация исследуемых белков в сыворотке крови больных не отличалась от показателей группы контроля. Превышение уровня верхней референтной границы нормы, составившей для VEGF 790 пг/мл, наблюдалось только у 4 больных, а для VEGFR-2 (граница — 22,9 нг/мл) не обнаружено ни у одного пациента.
Принимая во внимание вышесказанное, полагаем, что изучение на дооперационном этапе данных факторов с целью оценки активности ан-гиогенеза и прогноза значимой ценности не представляет, равно как и использование этих маркеров в качестве диагностических критериев.
В опухолевой ткани 87% больных уровень УЕСР был в 2—53 (медиана 8,6) раза выше, чем в неизмененной ткани почки, при этом различия средних и медианных значений этого показателя в опухоли и неизмененной ткани почки были высокодостоверны (р < 0,001). Содержание УЕСРИ-2 было повышено в опухоли у 39% больных и его уровень в опухоли и неизмененной ткани почки был достоверно связан (И = 0,41, р = 0,02). Для УЕСР такая связь не обнаружена. В общей группе больных корреляция показателей УЕСР и его рецептора в опухоли не установлена.
Проанализирована взаимосвязь показателей УЕСР и УЕСРИ-2 в сыворотке крови, опухоли и неизмененной ткани почки с основной клинико-морфологической характеристикой процесса.
Первичная опухоль Т (TNM). Статистически значимая взаимосвязь с индексом Т зафиксирована для УЕСРИ-2 только в группе больных женщин при исследовании сыворотки крови. При этом отмечено достоверное повышение уровня УЕСРИ-2 с увеличением критерия Т (р = 0,01). Обнаружено более высокое содержание УЕСР в неизмененной ткани у больных раком почки с показателем распространенности Т1а (р = 0,048), в то же время содержание УЕСР в опухоли, напротив, достоверно повышалось при увеличении показателя Т (р = 0,047).
Учитывая, что показатель распространенности Т не всегда зависит непосредственно от размера первичной опухоли, изучен коэффициент соотношения УЕСР в опухоли и его содержания в неизмененной ткани больных с учетом максимального размера первичной опухоли. Медиана этого соотношения составила всего 0,8 при размере опухоли до 3,5 см и многократно увеличивалась при опухоли от 7 см и более (13,3) (р = 0,047).
Тип роста опухоли. Содержание УЕСР в неизмененной ткани достоверно различалось в группах с различным типом роста опухоли (р = 0,007). Максимальный уровень УЕСР зафиксирован при экстраренальном росте (127 ± 34,2 пг/мг белка),
минимальный — при интраренальном (39,6 ± ± 7,6 пг/мг).
Инвазия псевдокапсулы опухоли. В сыворотке крови больных с инвазией псевдокапсулы опухоли обнаружена тенденция к более высокому содержанию VEGFR-2 (р = 0,06). наличие инвазии псевдокапсулы опухоли сопровождалось также достоверным увеличением показателей VEGFR-2 в опухоли (р = 0,011).
Степень дифференцировки G (Fuhrman grade). Содержание VEGF в опухоли почки достоверно повышалось при увеличении индекса G (табл. 1). При этом медиана коэффициента соотношения показателей VEGF в опухоли и его содержания в неизмененной ткани больных составила всего 0,8 при размерах опухоли до 3,5 см и многократно увеличивалась при размерах опухоли от 7 см и более (13,3) (р = 0,047). Корреляция содержания VEGF в неизмененной и опухолевой ткани почки была обратной в группе пациентов с размерами опухоли до 7 см (г = —0,45; p = 0,047).
Обнаружено также достоверное повышение содержания VEGFR-2 в сыворотке крови больных при увеличении индекса G (p = 0,04) (табл. 2), частота высоких значений VEGFR-2 > 14 нг/мл достигала 60% при G4, а при G1 равнялась нулю. При этом медиана содержания рецептора в опухоли при увеличении индекса G достоверно снижалась (р = 0,048) (рисунок).
Таблица 1 Содержание VEGF в неизмененной и опухолевой ткани почки с учетом степени дифференцировки опухоли
VEGF (пг/мл)
Ткань G N M ± m медиана предел колебания
Неизме- G1 8 52,6 ± 10,1 50,3 16,9—98,2
ненная G2 12 56,9 ± 9,3 64,6 20,4—153
G3 7 50,9 ± 16,9 77,5 28,2—105
G4 4 70,6 ± 13,6 63,6 49,6—164
Опухо- G1 8 392 ± 130 310 13,5—1183
левая G2 14 511 ± 78,2 614 11,6—923
G3 8 579 ± 166 526 76,5—1492
G4 5 1009 276 1106 73,5—1795
Примечание. Опухоль pG1-G4 = 0,01; рG2-G4 = 0,03.
3000 2500 2000
3
3
^ 1500
^ 1000 5
J
' 500 0
-500
опухолевая ткань
й
□ медиана □ 25%-75% ПИ мин-макс
Медиана содержания рецептора VEGFR-2 в опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухолевой ткани.
В свою очередь корреляция содержания VEGFR-2 в неизмененной и опухолевой ткани ослабевала по мере увеличения индекса G со значимого показателя (г, = 0,54; р = 0,01) у больных с индексом G1—G2 до нуля у больных с индексом G3—G4. Эти данные показывают, что при G3—G4 степень снижения содержания рецептора в опухолевой ткани существенно больше, чем в неизмененной.
Таблица 2
Содержание VEGFR-2 в сыворотке крови с учетом степени дифференцировки опухоли
Содер- Степень дифференцировки
VEGFR-2 (нг/мл) G1 G2 G3 G4
Количество наблюдений 8 16 8 5
М ± т 11 ± 0,4 11,4 ± 0,6 12,5 ± 1,6 15,7 ± 1,8
95% ДИ (М) 10—13 9—13,5 9,4—15,9 9,6—15,4
Медиана 11,3 10,9 12,9 14
Предел колебания 9,3—12,4 7,4—17,1 6,5—18,5 12,9—22,8
VEGFR-2 >14 пг/мл, % 0 18,8 50 60
Примечание. ДИ — доверительный интервал.
Исследована зависимость между содержанием VEGF и VEGFR-2 в опухоли почки. Обнаружено, что в группе больных без инвазии псевдокапсулы опухоли имеется прямая корреляция содержания VEGF и его рецептора (г, = 0,64; р = 0,002). Зависимость прослеживается и при индексе G1 (г, = 0,74; р = 0,14) и G2 (г, = 0,55; р = 0,04), при размерах опухоли менее 3,5 см (г, = 0,77; р = 0,07). У больных с более неблагоприятными факторами — наличие инвазии, стадия Т2—Т3, G3—G4, размер опухоли более 3,5 см — зависимость отсутствовала. Таким образом, в опухоли почки у больных с благоприятными клиническими признаками заболевания более высокому содержанию VEGF чаще соответствовало и более высокое содержание его рецептора.
Интересные закономерности обнаружены в соотношении VEGF/VEGFR-2 в опухоли почки, которое достоверно повышалось при увеличении стадии болезни: 0,83 ± 0,17 — в I стадии, 1,39 ± 0,88 - во II, 6,1 ± 2,9 - в III (р = 0,031). Данное соотношение было достоверно выше и у больных с инвазией псевдокапсулы опухоли (4,6 ± 1,9) по сравнению с пациентами без инвазии (0,57 ± 0,12) (р = 0,002). Достоверно повышалось соотношение VEGF/VEGFR-2 в опухоли больных по мере увеличения индекса G: 0,32 ± 0,07 - при G1, 1,55 ± 0,7 - при G2, 1,78 ± 0,63 - при G3, 9,1 ± 5,4 - при G4 (р = 0,035).
ВЫВОДЫ
В исходных показателях VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови больных раком почки и у здоровых людей (контрольная группа) достоверных различий не наблюдалось. В сыворотке крови больных между содержанием VEGF и VEGFR-2 зафиксирована прямая связь.
В опухоли отмечен более высокий уровень VEGF по сравнению с таковым в неизмененной ткани почки. При этом уровень VEGF в опухоли не был связан со стадией процесса и гистологическим строением опухоли, но достоверно повышался при снижении степени дифференцировки рака и увеличении показателя первичной опухоли Т.
В свою очередь показатели VEGFR-2 в опухоли почки были достоверно выше у женщин и ниже у мужчин по сравнению с неизмененной тканью, не зависели от возраста пациентов, стадии болез-
ни, показателя распространенности первичной опухоли Т, гистологического строения опухоли, но достоверно снижались при увеличении степени ее дифференцировки и инвазии псевдокапсулы опухоли. Независимо от пола пациентов отмечена прямая корреляция содержания VEGFR-2 в опухоли и неизмененной ткани почки.
В опухоли почки у больных с ее благоприятными клиническими признаками более высокому содержанию VEGF чаще соответствовало более высокое содержание его рецептора.
Соотношение VEGF/VEGFR-2 в опухоли повышалось при увеличении стадии болезни, при наличии инвазии псевдокапсулы опухоли, а также по мере увеличения степени дифференциров-ки опухоли.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трапезникова М.Ф. Опухоли почек. М., 1978.
2. Jacobsen J., Grankvist K., Rasmuson T., Ljungberg B. Different isoform patterns for vascular endothelial growth factor between clear cell and papillary renal cell carcinoma // BJU Int. 2006. Vol. 97. № 5. Р. 1102-1108.
3. Аксель Е.М., Заболеваемость злокачественными новообразованиями мочевых и мужских половых органов в России в 2003 г. // Онкоурология. 2005. № 1. С. 6-9.
4. Ficarra V., Martignoni G., Lohse C., Novara G., Pea M. et al. External validation of the Mayo Clinic Stage, Size, Grade and Necrosis (SSIGN) score to predict cancer — specific survival using a European series of conventional renal cell carcinoma // J. Urol. 2006. Vol. 175. Iss. 4. Р. 1235-1239.
5. Носов А.К. Клинические проявления, диагностика и стадирование рака паренхимы почки // Практическая онкология. 2005. Т. 6. № 3. С. 148-155.
6. Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors // Ann. Surg. 1972. Vol. 175. № 3. Р. 409-416.
7. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Биологические маркеры опухолей в клинике — достижения, проблемы,
перспективы // Молекулярная медицина. 2008. № 3. С. 48-55.
8. Ferrara N., Keyt B. Vascular endothelial growth factor: basic biology and clinical implications // EXS. 1997. Vol. 79. Р. 209-232.
9. Dvorak H.F. Vascular permeability factor/vascular en-dothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angio-genesis and a potential target for diagnosis and therapy // J. Clin. Oncol. 2002. Vol. 20. Р. 4368-4380.
10. Ferrara N., Gerber H.P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors // Nat. Med. 2003. Vol. 9. Р. 669-676.
11. Rini B.I., Small E.J. Biology and clinical development of vascular endothelial growth factor-targeted therapy in renal cell carcinoma // J. Clin. Oncol. 2005. Vol. 23. Р. 1028-1043.
12. Paradis V., Lagha N.B., Zeimoura L. et al. Expression of vascular endothelial growth factor in renal cell carcinomas // Virchows Arch. 2000. Vol. 436. Р. 351-356.
13. Djordjevic G., Mozetic V., Mozetic D.V., Licul V., Ilijas K.M., Mustac E., Oguic R., Fuckar Z., Jonjic N. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor expression in clear cell renal cell carcinoma // Pathol. Res. Pract. 2007. Vol. 203. № 2. Р. 99-106.
14. Jacobsen J., Grankvist K., Rasmuson T., Bergh A., Landberg G., Ljungberg B. Expression of vascular endothelial growth factor protein in human renal cell carcinoma // BJU Int. 2004. Vol. 93. Р. 297-302.
15. Minardi D., Lucarini G., Mazzucchelli R., Milanese G., Natali D., Galosi A.B., Montironi R., Biagini G., Muzzon-igro G. Prognostic role of Fuhrman grade and vascular endothelial growth factor in pT1a clear cell carcinoma in partial nephrectomy specimens // J. Urology. 2005. Vol. 174. Iss. 4. Р. 1208-1212.
16. Sato K., Tsuchiya N., Sasaki R., Shimoda N., Satoh S., Ogawa O., Kato T. Increased serum levels of vascular en-dothelial growth factor in patients with renal cell carcinoma // Jpn. J. Cancer Res. 1999. Vol. 90. № 8. Р. 874-879.
17. Jacobsen J., Rasmuson T., Grankvist K., Ljungberg B. Vascular endothelial growth factor as prognostic factor in renal cell carcinoma // J. Urol. 2000. Vol. 163. № 1. Р. 343-347.
18. Schips L., Dalpiaz O., Lipsky K., Langner C., Rehak P., Puerstner P., Pummer K., Zigeuner R. Serum levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin in renal cell carcinoma patients compared to a control group // Europ. Urol. 2007. Vol. 51. № 1. Р. 168-173.
Поступила 18.11.2010
