CC BY
63
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СОДЕРЖАНИЕ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ... 89
УДК 618.19-006.6:616.15:577.112.854 А.И. Катунина, Е.С. Герштейн, ВД. Ермилова, И.В. Терешкина, АЮ. Назаренко, АА. Тулеуова,
О.В. Кузнецова, З.К. Карабекова, М.В. Грицкевич, Е.К. Дворова, Т.Т. Березов СОДЕРЖАНИЕ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ 2; 7 И 9 В ОПУХОЛЯХ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Герштейн Елена Сергеевна, Лаборатория клинической биохимии
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-11-59; факс +7(495)324-63-52;
e-mail: esgershtein@gmail.com
Статья поступила: 01.09.2010, принята к печати 16.09.2010.
Резюме
Иммуноферментными методами показано, что содержание ММП 2 и 7 повышено в опухолях по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью у 91 и 76 % больных раком молочной железы соответственно, а уровни ММП-9 в опухолях и неизмененной ткани достоверно не отличаются. Концентрации ММП-2 и ММП-7 в сыворотке крови не коррелируют с соответствующими показателями в опухолях, не превышают норму и достоверно не снижаются после удаления первичной опухоли. Уровень ММП-9 в сыворотке крови больных достоверно ниже, чем в таковой группы контроля, а после операции повышается в 85% случаев. Однозначной взаимосвязи исследованных показателей с клинико-морфологическими факторами прогноза РМЖ не обнаружено.
Ключевые слова: матриксные металлопротеиназы 2; 7; 9, рак молочной железы.
A.I. Katunina, E.S. Gershtein, I.V. Tereshkina, A.Yu. Nazarenko, V.D. Ermilova, A.A. Tuleuova,
O.V. Kuznetsova, Z.K. Karabekova, M. V Gritskevich, E.K. Dvorova, T.T. Berezov
CONTENT OF MATRIX METALLOPRONEINASES 2; 7 AND 9
IN THE TUMORS AND BLOOD SERUM OF BREAST CANCER PATIENTS
Russian N.N.Blokhin Cancer Research Center RAMS;
Abstract
A significant increase of matrix metalloproteinases’ (MMP) 2 and 7 levels in the tumors as compared to adjacent histologically unchanged mammary gland was demonstrated by enzyme-linked immunosorbent assays in 91 and 76% of breast cancer patients respectively, while MMP-9 levels in these tissues did not differ significantly. The concentrations of MMP-2 and MMP-7 in blood serum were not associated with corresponding tumor values, did not exceed the control levels, and did not decrease after the excision of primary tumor. Serum MMP-9 was significantly decreased in breast cancer patients as compared to control group, and increased post-surgically in 85% of the patients. No unambiguous associations between the parameters studied and breast cancer clinico-morphologic prognostic factors were revealed.
Key words: matrix metalloproteinase 2, matrix metalloproteinase 7, matrix metalloproteinase 9, breast cancer.
Введение
Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и ВКМ ассоциированными с опухолью протеазами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоангиогенеза. В инвазии и метастазировании задействовано несколько классов протеаз, в том числе - мультигенное семейство матриксных металлопротеиназ или матриксинов, названных так за свою способность специфически гидролизовать все основные ВКМ и состоящее из более чем 20 секретируемых или связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопептидаз [9].
Субстратами ММП помимо большинства компонентов ВКМ могут быть также другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста [7].
Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется ТИМП - структурно родственными белками, три из которых (ТИМП-1; 2 и 4) секретируются в растворимой форме, а один (ТИМП-3) связан с ВКМ. ТИМП играют также важную самостоятельную роль в регуляции роста и диф-
ференцировки опухолевых и нормальных клеток и обладают антиангиогенными свойствами [4]. В определенной степени антиангиогенной активностью обладают и сами ММП, поскольку они участвуют в образовании антиангиогенных пептидов из более крупных белков [6; 10].
Для многих ММП продемонстрировано увеличение экспрессии и активности в опухолях различного генеза, причем эта активация происходит по пара-кринному механизму с участием факторов роста и цитокинов, секретируемых инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, а также клетками опухолевой стромы [9; 15]. В связи с этим различные ММП и ТИМП рассматриваются в настоящее время в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности злокачественных опухолей. Использование природных и синтетических ингибиторов ММП считается перспективным подходом к противоопухолевой терапии. В экспериментальных исследованиях продемонстрировано участие ММП в регуляции инвазивной, миграционной и даже пролиферативной активности РМЖ. Возможность подавления распространения опухоли с помощью синтетических ингибиторов ММП также является предметом исследований [6; 11-14].
Данные о роли ММП в прогнозе и клиническом течении РМЖ не очень многочисленны и единого мнения по этому вопросу пока нет [5; 8; 13; 15].
Цель данного исследования - провести сравнительную оценку содержания ММП-2; 7 и 9 в опухолях и гистологически неизмененной ткани больных РМЖ, а также в сыворотке крови этих больных до и после операции и проанализировать взаимосвязь изученных показателей с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания.
Материалы и методы
В исследование включили 45 больных раком молочной железы I-III стадий в возрасте от 26 до 73 лет (медиана - 54 года). Контрольную группу составили 8 практически здоровых женщин. Стадии заболевания: I - 10, IIA и IiB - по 12, IIIA - 6, и у 5 пациенток был распространенный процесс IIIB-C стадии. По гистологическому строению 36 опухолей представляли собой протоковый инфильтра-тивный рак, 5 - дольковый инфильтративный рак, другие типы РМЖ представлены единичными наблюдениями. Умеренная степень дифференцировки РМЖ выявлена у большинства пациенток (33), низкая - у 7, высокая - у 5. Во всех опухолях иммуногистохимически исследована экспрессия рецепторов: эстрогенов, прогестерона и HER2/neu.
Содержание ММП-2; 7; 9 определяли в экстрактах опухолей и участках гистологически неизмененной ткани молочной железы, а также в сыворотке крови, полученной по стандартной методике до начала лечения и через 5-15 дней после операции. Для проведения иммуноферментного анализа образцы тканей лизировали в соотношении 1 : 3 в буфере следующего состава:
20 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 %-ный Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ Р-глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центрифугировали в течение 30 мин при 20 000 об/мин, +4 °С (центрифуга Optima™ TLX, «Beckman», USA). Определение проводили с помощью стандартных наборов для прямого иммунофер-ментного анализа: «Human/Mouse/Rat MMP-2 (total)», «Human ММП-7 (total)», «Human ММП-9 (total)» (все
- Quantikine®, «R&D Systems», USA) в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 («Bio-Tek Instruments, Inc.», USA). Концентрацию исследованных показателей в тканях выражали в нанограммах (нг) на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури.
Данные обрабатывали с помощью программы «Statistica 7.0». При сравнении и анализе взаимосвязей различных показателей использовали непараметрические методы: критерии Манна-Уитни и Kruskel-Wallis, тест корреляции рангов Спирмена (R). Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.
Результаты
Во всех исследованных образцах опухолей и гистологически неизмененной ткани молочной железы обнаружены измеримые количества ММП-2 и ММП-7, а ММП-9 выявлена в 30 из 40 (75%) опухолей и в 63% образцов неизмененной молочной железы. Содержание ММП-2 и 7 достоверно повышено в опухолях по сравнению с гистологически неизмененной тканью молочной железы у 91 и 76% больных соответственно (табл. 1). У 61% больных
отмечено также увеличение содержания ММП-9 в опухоли по сравнению с неизмененной тканью, однако в целом по группе различия не достигали статистической значимости (табл. 1).
При этом уровни ММП-9 в опухоли и неизмененной молочной железе достоверно положительно коррелировали между собой (Ы=0,36; р<0,05), а для ММП-2 и ММП-7 такой взаимосвязи не обнаружено. Кроме того, отмечена положительная взаимосвязь между уровнями ММП-2 и ММП-7, а также ММП-7 и МмП-9 в опухоли (Ы=0,49 и Ы=0,48 соответственно; р<0,05).
Таким образом, в опухолях обследованных больных РМЖ значимо увеличена экспрессия ММП-2 и ММП-7, что соответствует данным ряда авторов, продемонстрировавших важную роль этих белков в патогенезе РМЖ [7; 12; 15]. Достоверного увеличения экспрессии ММП-9 нами не обнаружено, однако в литературе представлены данные об активации этой протеиназы в опухолях молочной железы, полученные другими методами [5; 15].
При исследовании сыворотки крови не выявлено достоверного повышения концентрации ММП-2 и ММП-7 у больных РМЖ по сравнению с контрольной группой, а уровень ММП-9 в сыворотке крови больных оказался достоверно ниже, чем в контроле (табл. 2).
Ни для одного из исследованных показателей не выявлено достоверных корреляционных взаимосвязей тканевых и сывороточных концентраций, что может свидетельствовать о неопухолевом происхождении ММП, циркулирующих в периферической крови больных РМЖ.
В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что после удаления первичной опухоли уровни ММП-2 и ММП-7 снизились только у половины больных, и это изменение не было статистически значимым и составляло всего
0,2-51% для ММП-2 и 2,5-39% для ММП-7 (табл. 2). Уровень ММП-9, сниженный до операции, напротив, повысился на 0,8-75% (р<0,0001) у 85% больных, но оставался ниже контрольного (табл. 2).
Для того, чтобы оценить клиническое значение определения исследуемых маркеров в опухолях и периферической крови больных РМЖ, проанализировали взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания: стадией, размером, гистологическим строением, степенью дифференцировки и рецепторным статусом первичной опухоли (табл. 3), наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах.
Обнаружено достоверное увеличение содержания ММП-9 в опухоли со снижением степени дифференцировки, что косвенно свидетельствует о неблагоприятной прогностической роли высокого уровня этой протеиназы в РМЖ.
Повышение уровня ММП-9, а также ММП-7 отмечено и в опухолях с прогностически неблагоприятным рецепторным статусом - РЭ- (р<0,05) и/или ИЕК2/пеи+.
Уровень ММП-2 практически не зависел от статуса РЭ и ИЕК2/пеи, но был более высок в РП+ опухолях (р<0,05), чем в РП-отрицательных.
Основные закономерности, выявленные для показателей сыворотки крови, - это достоверное увеличение уровня ММП-2 (р<0,05) и снижение уровня ММП-9 при III стадии РМЖ по сравнению с 1-11 (р<0,05). Уровень ММП-9 в сыворотке крови также достоверно снижался при низкодифференцированном РМЖ и размере первичной опухоли более 4,0 см (в обоих случаях р<0,05).
Таблица 1
Содержание (нг/мг белка) ММП-2, ММП-7 и ММП-9 в опухолях и гистологически неизмененной ткани МЖ
Показатель п больных Опухоль (Т) Слизистая (Ы) Т>Ы %
Медиана Диапазон Медиана Диапазон
ММП-2 45 40,1і 3,6 - 111 10,5 2,3 - 67,3 91
ММП-7 25 0,72 0,04 - 15,0 0,2 0,03 - 2,2 76
ММП-9 40 8,2 0 - 294 2,7 0- 225 61
1р<0,0001 по сравнению с неизмененной тканью (парный критерий Вилкоксона); 2р<0,01 по сравнению с неизмененной тканью (парный критерий Вилкоксона).
Таблица 2
Содержание (нг/мл) ММП-2, ММП-7 и ММП-9 в сыворотке крови здоровых доноров и больных РМЖ до начала лечения и через 5-15 дней после операции__________________________________________________
Показатель Контрольная группа Больные РМЖ
(8 человек) п больных до операции (1) после операции (2) снижение (2<1)
ММП-2 256 161 - 303 45 228 151-389 245 153-361 52%
ММП-7 3,9 2,8 - 4,5 25 4,05 1,9-9,4 4,132,8-11,0 52%
ММП-9 398 279 - 496 40 2291 87-446 2842 136-847 15%
1р<0,05 по отношению к показателю контрольной группы (тест Манна-Уитни); 2р<0,0001 по отношению к показателю до операции (парный критерий Вилкоксона).
Таблица 3
Содержание ММП-2, ММП-7 и ММП-9 в опухолях (нг/мг белка) и сыворотке крови (нг/мл) при РМЖ в зависимости от некоторых клинико-морфологических характеристик заболевания*____________________________
Показатель ММП-2 ММП-7 ММП-9
Опухоль Сыворотка Опухоль Сыворотка Опухоль Сыворотка
Стадия: I 45,2 21,3-61,4 229 185-294 1,6 0,3-1,8 3,8 3,5-4,5 0 0-8,1 217 167-314
II 35,0 22,1-52,8 235 193-229 0,6 0,2-1,4 4,7 3,5-4,0 8,6 2,2-18,6 254 221-314
III 40,1 27,9-64,0 280 242-316 0,8 0,6-1,3 4,6 4,1-5,1 13,6 0-25,1 210 140-265
Размер опухоли: до 2,0 см 31,7 21,3-46,9 265 201-315 1,1 0,6-4,1 3,8 3,5-5,2 0 0-52,6 304 182-446
2-3,9 см 42,4 22,4-64,0 242 222-265 0,6 0,3-1,0 4,6 3,7-4,1 8,8 1,8-18,6 225 167-253
4,0 см и более 47,2 36,5-69,2 227 193-265 1,8 1,4-2,2 3,9 3,5-5,2 11,1 0-14,1 182 145-223
Степень дифференцировки: 1 Высокая 37,8 19,6-65,1 221 207-235 1,0 0,1-1,8 3,8 3,5-4,0 0,9 0-5,2 223 167-279
2 Умеренная 41,9 26,3-56,4 248 193-315 0,7 0,4-1,6 4,6 3,7-5,2 8,8 0,6-19,6 250 187-314
3 Низкая 36,9 24,9-66,2 241 201-280 1,0 0,6-1,4 3,9 3,5-4,3 13,9 5,2-114 167 126-241
Рецепторный статус: РЭ+ 36,9 22,4-36,9 252 193-294 1,8 1,3-4,1 3,8 3,5-5,2 24,0 18,6-80 213 176-304
РЭ~ 42,4 26,4-61,4 243 223-309 0,6 0,3-1,4 4,6 3,7-4,1 3,9 0-11,5 236 145-275
РП+ 31,7 22,4-45,6 242 193-315 1,1 0,6-1,8 4,3 3,5-5,2 18,4 0,3-28,6 219 167-314
РП~ 46,2 32,8-68,1 248 222-265 0,7 0,3-1,4 4,7 3,9-4,5 4,7 0-11,9 238 165-262
НЕЫ2/пеи+ 41,3 26,3-56,4 246 201-308 0,7 0,4-1,6 4,6 3,9-4,2 7,6 0-19,6 232 182-253
НЕЫ2/пеи~ 40,1 22,4-64,0 241 196-294 2,6 1,0-4,1 4,1 3,6-5,1 12,8 5,8-16,4 217 167-304
*в таблице представлены медианы и квартили значений; статистически достоверные различия указаны в тексте статьи.
92 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СОДЕРЖАНИЕ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ...
Подводя итог проведенным исследованиям, отметим:
- у большинства пациенток, страдающих РМЖ, отмечено значительное увеличение продукции ММП-2 и ММП-7 в опухоли по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы.
- уровень этих протеиназ в сыворотке крови больных практически не отличается от показателей контрольной группы и достоверно не меняется после удаления опухоли.
- в опухолях значительной части больных повышена также экспрессия ММП-9, однако ее увеличение менее выражено, чем для вышеназванных показателей и не достигает уровня статистической значимости.
Достаточно парадоксальным и требующим дальнейшего изучения является тот факт, что концентрация ММП-9 в сыворотке крови больных достоверно снижена по сравнению с нормой, это снижение в наибольшей степени проявляется в некоторых прогностически неблагоприятных подгруппах, а после операции происходит нормализация уровня ММП-9, т.е. его повышение.
Следует отметить, что аналогичное снижение уровня ММП-9 мы наблюдали при раке желудка [3], а при раке яичников [2] и раке толстой кишки [1 ] уровень этого маркера в периферической крови, напротив, был повышен.
Таким образом, по данным нашего исследования, все три изученных ММП можно рассматривать в качестве возможных биомаркеров РМЖ и мишеней для молекулярно-направленной терапии, но они не являются перспективными серологическими маркерами данного заболевания.
Литература
1. Герштейн Е.С., Короткова ЕА., Щербаков А.М. и соавт. Матриксные металлопротеиназы 7 и 9 и их
тканевые ингибиторы 1 и 4 типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки // Бюлл.
эксп. биол. мед. - 2007. - Т. 143. - №4. - С. 438-41.
2. Герштейн Е.С., Левкина Н.В., ДигаеваМА. и соавт. Матриксные металлопротеиназы 2, 7, 9 и ткане-
вой ингибитор матриксных металлопротеиназ 1 типа в опухолях и сыворотке крови больных новообразованиями яичников // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2010. - Т. 149. - №5. - С. 562-5.
3. Герштейн Е.С., Ли Сини, Рябов А.Б. и соавт. Сравнительное иммуноферментное исследование мат-риксных металлопротеиназ-2, -7, -9 и их тканевого ингибитора 2 типа в опухолях и плазме крови больных раком желудка // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2009. - Т. 148. - №12. - С. 660-3.
4. Baker A.H., Edwards D.R., Murphy G. Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities // J. Cell Sci.- 2002. - Vol. 115 (Pt 19). - P. 3719-27.
5. Bartsch J.E., Staren E.D., AppertH.E. Matrix metalloproteinase expression in breast cancer//J. Surg. Res. -2003. - Vol. 110 (2). - P. 383-92.
6. Bendrik C, Robertson J, Gauldie J, Dabrosin C. Gene transfer of matrix metalloproteinase-9 induces tumor regression of breast cancer in vivo// Cancer Res. - 2008. - Vol. 68 (9). - P. 3405-12.
7. Dean R.A., Butler G.S., Hamma-Kourbali Y. et al. Identification of candidate angiogenic inhibitors processed by matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in cell-based proteomic screens: disruption of vascular endothelial growth factor (VEGF)/heparin affin regulatory peptide (pleiotrophin) and VEGF/Connective tissue growth factor angiogenic inhibitory complexes by MMP-2 proteolysis // Mol. Cell Biol. - 2007. -Vol. 27 (24). - P. 8454-65.
8. Decock J, Long J.R., Laxton RC. et al. Association of matrix metalloproteinase-8 gene variation with breast cancer prognosis//Cancer Res. - 2007. - Vol. 67 (21). - P. 10214-21.
9. Deryugina E.I., Quigley J.P. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis // Cancer Metastasis Rev. -
2006. - Vol. 25 (1). - P. 9-34.
10. Deryugina E.I., Quigley J.P. Pleiotropic roles of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis: contrasting, overlapping and compensatory functions//Biochim. Biophys. Acta. - 2010. - Vol. 1803 (1). - P. 103-20.
11. GlasspoolR.M, Twelves C.J. Matrix metalloproteinase inhibitors: past lessons and future prospects in breast cancer // Breast. - 2001. - Vol. 10 (5). - P. 368-78.
12. Kargozaran H., Yuan S.Y., Breslin J.W. etal. A role for endothelial-derived matrix metalloproteinase-2 in breast cancer cell transmigration across the endothelial-basement membrane barrier//Clin. Exp. Metastasis. -
2007. - Vol. 24 (7). - P. 495-502.
13. Liu S.C., YangS.F., Yeh K.T. et al. Relationships between the level of matrix metalloproteinase-2 and tumor size of breast cancer // Clin. Chim. Acta. - 2006. - Vol. 371 (1-2). - P. 92-6.
14. Lungu G., Covaleda L, Mendes O. et al. FGF-1-induced matrix metalloproteinase-9 expression in breast cancer cells is mediated by increased activities of NF-kappaB and activating protein-1 // Mol. Carcinogenesis. - 2008. - Vol. 47 (6). - P. 424-35.
15. McGowan P.M., Duffy M.J. Matrix metalloproteinase expression and outcome in patients with breast cancer: analysis of a published database // Ann. Oncol. - 2008. - Vol. 19 (9). - P. 1566-72.
