CC BY
64
ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЖЕЛЧНОМ ПЕРИТОНИТЕ
Петросян Э. А., Боташев А. А., Терещенко О. А., Помещик Ю. В., Губаз С. Г.
ГОУ ВПО Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар
Петросян Эдуард Арутюнович 350063, Краснодар, ул. Седина, д. 4 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
В экспериментах на животных с желчным перитонитом наблюдались признаки развития синдрома системной воспалительной реакции «омоложением» лейкоцитарной формулы за счет как мобилизации пристеночного пула нейтрофильных лейкоцитов, так и активации костномозгового резерва грануло-цитов в ответ на развитие эндогенной интоксикации. Анализ результатов проведенного исследования также показал, что у животных с желчным перитонитом происходит изменение функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов, которое отражается в изменении их цитохимического профиля, сопровождающегося снижением общей активности и функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов, угнетением неспецифического звена иммунной системы, проявляющимся уменьшением количества нейтрофилов, способных поглощать и переваривать микробные клетки.
SUMMARY
In experiments on animals with choleperitonitis were signs of systemic inflammatory response syndrome, «rejuvenation» of wbc as through the mobilization of neutrophils membrane pool and due to the activation of bone marrow reserve of granulocytes in response to the development of endogenous intoxication. The analysis of the results of the study also showed that animals with choleperitonitis have the change of the neutrophils functional state, which reflected in changes of their cytochemical profile, accompanied by a decrease in total activity and functional reserve of neutrophils, inhibition of nonspecific link of the immune system, manifested by a decrease of the neutrophils number, which are able to absorb and digest microbal cells.
В настоящее время остается недостаточно изученной проблемой хирургии — желчный перитонит (ЖП) [1]. Проблема особенно актуальна на фоне мировой тенденции роста количества больных, страдающих желчнокаменной болезнью. Ежегодно в мире выполняется до 2,5 млн операций на желчном пузыре и желчевыводящих путях. При этом у большинства из них выполняются лапароскопические вмешательства, при которых осложнения отмечены в 1,5 раза чаще, чем при открытой холецистэктомии [2], а ЖП отмечается до 0,5% случаев [6], из которых 12,2% заканчиваются летально [1]. Несвоевременно выполненная релапаротомия является причиной того, что при развитии ЖП погибает от 50% до 100% больных [5].
В последние годы в медицинской практике активно используется понятие systemic inflammatory response syndrome — синдром системной
воспалительной реакции» (SIRS — ССВР). Важность оценки реакции функционального состояния лейкоцитов на воспаление подтверждена тем, что число клинико-лабораторных параметров, на которых основывается диагностика ССВР, входят такие параметры, как повышение или уменьшение количества лейкоцитов крови, а также рост содержания палочкоядерных форм. Именно количественное и качественное соотношение лейкоцитов в крови может отражать уровень воспалительной реакции организма и служить оценкой системного характера функционального состояния лейкоцитов в процессе развития заболевания.
Большинство авторов единодушны в оценке ведущей роли нейтрофильных гранулоцитов (НГ) при перитонитах как индукторов провоспали-тельных и катаболических процессов [12], которые являются основными эффекторными клетками
неспецифического иммунитета и представляют собой первую линию защиты организма от патогенных микроорганизмов. Они элиминируют патогенные микроорганизмы в очагах воспаления и играют важнейшую роль в рекрутировании других типов лейкоцитов в воспаленную ткань, организуя, таким образом, клеточную составляющую неспецифического иммунного ответа, обеспечивая сопряжение неспецифического и адаптивного иммунного ответов.
При развитии перитонитов наблюдается резкое повышение концентрации окислителей как один из факторов иммунного ответа, который во многом зависит от состояния внутриклеточных антибактериальных систем НГ, одним из которых является миелопероксидаза (МПО), участвующая в процессах образования активных форм кислорода и азота. В реакции катализируемой МПО фагоцитирующие клетки образуют гипохлорит-анион (хлорноватистую кислоту) с окислительно-восстановительным потенциалом 1,35 В, способный эффективно окислять сульфгидрильные и тиоэфирные группы белков с образованием соответствующих хлорами-нов [15]. Активированные НГ, находясь в очагах воспаления и секретируя во внеклеточную среду гипохлорит-анионы, которые могут превращать ги-дропероксиды в свободные радикалы, инициируют тем самым пероксидацию липидов, способствуя деструкции белок-липидных комплексов [10]. Данное предположение становится более вероятным, если учесть, что количество гидропероксидов в очагах воспаления, как правило, увеличено.
Целью настоящего исследования является изучение функционального состояния НГ при экспериментальном желчном перитоните.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на 31 собаке, которые были разбиты на две группы: 1-я интактная — для определения лабораторных показателей нормы и 2-я — опытная с моделью 24-часового ЖП [11].
Исследование общего анализа крови проводили на автоматическом анализаторе Medonic 620 (Швейцария). Качественный состав лейкоцитов определяли унифицированным методом [7]. Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) рассчитывали по формуле [4], отражающей степень интоксикации и недостаточность иммунитета. Для интегральной характеристики состояния организма изучалась энтропия лейкоцитарной формулы [14]. Функциональное состояние НГ изучали по содержанию катионного белка (КБ) [13] и миелопероксидазы (МПО) [8] с подсчетом среднего цитохимического индекса (СЦИ) КБ и МПО формуле: СЦИ = (4а + ЗЬ + 2с + ^/100, где а, Ь, с, d — количество клеток с очень высокой, высокой, средней и низкой активностью. Цитохимическую оценку окрашенных препаратов проводили с определением «среднего цитохимического индекса» (СЦИ) [9]. Степень активности КБ и МПО НГ рассчитывали с помощью
дифференцирующего цитохимического коэффициента (ДЦК) [3], а для оценки состояния функционального резерва и метаболической активности НГ использовали показатель спонтанного и стимулированного НСТ-теста по количественному содержанию и распределению в цитоплазме формазана [8], который является интегральной величиной бактерицидной способности нейтрофилов к фагоцитозу. Для характеристики резервной и окислительной функции НГ был исследован индекс стимуляции НСТ-теста, который показывает отношение показателей НСТ-стимулированного теста к НСТ-спонтанному. Бактериальный фагоцитоз изучали по степени завершенности, поглотительной способности и переваривающей функции НГ [8]. Поглотительную и переваривающую способность определяли с использованием в качестве тест-объекта Staph. аureus Р209. Завершенность фагоцитоза оценивали процентом переваривания (% П) и индексом переваривания (ИП). Исследования проводились до и после создания модели 24-часового ЖП.
Эксперименты проведены в соответствии со статьей XI Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации [1964] и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [1985].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Развитие 24-часового ЖП сопровождается мобилизацией костномозгового резерва и пристеночного пула НГ, что подтверждается высоким лейкоцитозом, который достигает (24,40 ± 4,3) • 109 / л против (12,85 ± 2,75) • 109/л у интактных животных (p < 0,01). Установлен максимальный рост концентрации лейкоцитов со стороны палочкоядерных нейтрофилов — до (3,76 ± 0,58) • 109/л против (0,79 ± 0,28) • 109/ л (р < 0,05) и сегментоядерных нейтрофилов — до (18,22 ± 1,22) • 109/л против (8,14 ± 0,35) • 109/ л (р < 0,05) у интактных животных соответственно. Наиболее выраженные результаты получены у животных с ЖП при подсчете абсолютного содержания палочкоядерных нейтрофилов, когда его кратность достоверно возрастала до 5 раз, а сегментоядерных нейтрофилов — более чем в 2 раза (р < 0,05). В то же время у животных с 24-часовым ЖП не обнаружены статистически достоверные изменения в количестве моноцитов и лимфоцитов.
Важным показателем при оценке степени выраженности воспалительной реакции является изучение относительного соотношения лейкоцитарных фракций.
Так, у животных с 24-часовым ЖП наблюдали статистически достоверный рост относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов в 2,6
Б >■
о
о 2
CU
се Я й
Q о
В
1 5
Я ^
О b О &
S
и га i_ к га х
л
<
га h X
ш
2 s а ш с
у
m
1-Л
о
о
раза по сравнению с интактными животными (р < 0,05) и снижение относительного содержания моноцитов и лимфоцитов в 2 и 2,8 раза соответственно (р < 0,05).
Лейкоцитарная формула, как любая меняющаяся информационная система, может характеризоваться таким параметром, как энтропия, которая является интегральным показателем качественного состава лейкоцитов периферической крови, характеризующего степень неупорядоченности данных или количество неопределенности для определенного уровня физиологического состояния организма. В нормальных условиях организм оказывает модифицирующее действие на относительное распределение лейкоцитов, однако в условиях перитонита могут возникнуть нарушения естественной регуляции, что отразится изменением энтропии лейкоцитарной формулы.
Энтропия лейкоцитарной формулы у животных с 24-часовым ЖП достоверно не отличалась от интактных животных (р = 0,070). Несмотря на наблюдаемые сдвиги каждого отдельного показателя лейкоцитарной формулы, в целом система лейкоцитов сохраняла устойчивость. Все это может свидетельствовать, что изменения соотношения фракций лейкоцитов в лейкоцитарной формуле при развитии 24-часового ЖП имеет адаптационный характер и не является показателем декомпенсации.
При определение ЛИИ у животных с ЖП наблюдался 6-кратный его рост относительно интактных животных (р < 0,001), что указывает на развитие эндогенной интоксикации. Однако рост ЛИИ может быть обусловлен не только образованием токсинов в результате воспалительных процессов, но и увеличением всасывания токсинов из просвета кишечника, вызванного нарушением барьерной функции кишечной стенки при ЖП.
Таким образом, использование интегральных показателей крови в диагностическом мониторинге ЖП позволяет повысить информативность традиционных тестов, улучшить оценку степени тяжести воспалительного процесса, наметить пути прогнозирования исхода и патогенетической терапии.
Изучение СЦИ МПО у животных с 24-часовым ЖП показало достоверное его снижение до 0,87 ± 0,05 ед против 3,11 ± 0,03 ед у интактных животных (р < 0,05), которое можно объяснить участием этого фермента в метаболическом взрыве с образованием супероксидного кислорода. Падение активности МПО в НГ неизбежно приводит к угнетению его фагоцитарной функции. Одновременно у животных с ЖП отмечалось снижение СЦИ КБ до 0,97 ± 0,04 ед против 2,74 ± 0,03 ед (р < 0,05) у интактных животных, что свидетельствует о снижении антибактериальной активности НГ.
Подобная картина наблюдалась и при изучении ДЦК МПО, характеризующего долю высокоактивных НГ.
Так, у животных с 24-часовым ЖП изучаемый показатель снижался до 0,53 ± 0,07 ед против
9,65 ± 0,56 ед (р < 0,001) у интактных животных, что говорит о преобладании НГ с низкой активностью МПО над клетками с высокой активностью фермента. Аналогичная картина наблюдалась и при изучении ДЦК КБ — падение показателя до 0,54 ± 0,05 ед против 4,22 ± 0,24 ед у интактных животных (р < 0,05).
Таким образом, анализ результатов проведенного исследования показал, что у животных с ЖП происходит изменение функционального состояния НГ в виде понижения функциональной активности МПО и КБ, которые свидетельствуют о гиперактивации циркулирующих НГ с уменьшением количества гранул. Эти показатели указывают на дегрануляцию НГ в системный кровоток, следствием чего является снижение бактерицидной и фагоцитарной функции клеток еще до выхода в очаг воспаления.
Для оценки функциональной активности фагоцитов и прогнозирования тяжести заболевания у животных с 24-часовым ЖП был исследован показатель спонтанного НСТ-теста, который достоверно снижался до 34,45 ± 1,3% против 45,55 ± 2,6% (р < 0,05) в группе интактных животных, что может быть признаком функциональной неполноценности НГ. Подобную же картину мы наблюдали со стороны показателя стимулированного НСТ-теста, который снижался до 42,8 ± 2,79% против 55,6 ± 1,3% у интактных животных (р < 0,05) и свидетельствовал об уменьшение резервов метаболической активности НГ.
При изучении индекса стимуляции НСТ-теста у животных с 24-часовым ЖП отмечено достоверное его снижение до 1,10 ± 0,02 усл. ед. против 1,47 ± 0,04 усл. ед. (р < 0,05) у интактных животных, что указывает о преобладании окислительной функции НГ.
Нами также изучена способность НГ к фагоцитозу и перевариванию чужеродных частиц.
Так, у животных с 24-часовым ЖП отмечено снижение процента фагоцитоза до 49,7 ± 1,35% против 65,15 ± 2,86% у интактных животных (р < 0,05) и фагоцитарного числа до 9,27 ± 0,59 против 12,2 ± 0,44 (р < 0,05) соответственно. Одновременно наблюдалось снижение фагоцитарного индекса до 4,64 ± 0,10 против 7,13 ± 0,20 у интактных животных (р < 0,05), указывающее о падение количества НГ, способных поглощать микробные клетки. Помимо этого у животных с ЖП наблюдалось снижение процента переваривания НГ до 31,34 ± 0,89% против 42,60 ± 1,21% у интактных животных (р < 0,05) и индекса переваривания до 2,20 ± 0,16 усл. ед. против 3,47 ± 0,19 усл. ед. (р < 0,05), соответственно.
Таким образом, у животных с ЖП наблюдаются признаки развития синдрома системной воспалительной реакции, что подтверждается более чем двукратным повышением количества лейкоцитов и ростом относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов. При этом выраженный лейкоцитоз и «омоложение» лейкоцитарной формулы указывают на повышение содержания лейкоцитов не только путем мобилизации его пристеночного пула, но и за счет активации костномозгового резерва
в ответ на эндогенную интоксикацию, в то время как рост относительного содержания палочкоядер-ных нейтрофилов является признаком напряженности компенсаторных механизмов, обеспечивающих процессы детоксикации организма. Снижение показателей относительного содержания лимфоцитов фактически может быть обусловлено ростом содержания НГ, а тенденция к снижению абсолютного содержания лимфоцитов и эозинофилов указывает в пользу наличия напряжения иммунной системы и возможности развития иммунодефицита.
ЛИТЕРАТУРА
1. Багненко С. Ф., Мосягин В. Б., КарповаЕ. А. Желчный перитонит как осложнение лапароскопической холецистэктомии // Эндоскопич. хирургия. — 2000. — № 2. — С. 6-7.
2. Бойко В. В., Федак Б. С., Песоцкий О. Н. и др. Опыт применения мини-лапаротомий при хирургических вмешательствах на органах гепатобилиарной системы // Медицина неотложных состояний. — 2007. — № 4. — С. 48-50.
3. Бондарев В. И., Тараненко Л.Д., Кузнецов А. С., ГазиМ. Р. Средне-молекулярные пептиды, лизосомальные ферменты — факторы интоксикации при остром разлитом перитоните. — Донецк, 1985. (Рукопись деп. во ВНИИМК МЗ СССР, № 9391-85.)
4. Кальф-Калиф Я.Я. О лейкоцитарном индексе интоксикации и его практическом значении // Врач. дело. 1941. — № 1. — С. 31-33.
5. Козлов А. В., Таразов П. Г., Гранов Д. А. и др. Методы интервенционной радиологии у больных раком печени и желчных протоков, осложненным механической желтухой // Анналы хирург. гепатол. — 2004. — № 1. — С. 10-19.
6. Меджидов Р. Т., Алиев М. А., Хамидов М. А. и др. Сложные и нерешенные вопросы лапароскопической холецистэктомии // Тезисы Юбилейного пленума правления РОЭХ, Сочи, 2005 [Электронный ресурс]. —Режим доступа: http://www.laparoscopy.ru / article / 51104-sochi.
htmr
7. Меньшиков В. В., ДелекторскаяЛ. Н., ЗолотницкаяР. П. Лабораторные исследования в клинике: Справочник/Под ред. В. В. Меньшикова. — М: Медицина, 1987. — 368 с.
8. Нестерова И. В., Колесникова Н. В., Чудилова Г. А. Методы оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов: Методические рекомендации. — Краснодар, 1992. — 19 с.
Анализ результатов проведенного исследования также показал, что у животных с ЖП происходит изменение функционального состояния НГ, которое отражается в изменении их цитохимического профиля, сопровождающегося снижением общей активности и функционального резерва, угнетением неспецифического звена иммунной системы, проявляющимся уменьшением количества нейтрофилов, способных поглощать и переваривать микробные клетки.
9. Нестерова И. В., Колесникова Н. В., Чудилова Г. А. Оценка иммунного статуса человека по тестам I и II уровня: Учебно-методические рекомендации. — Краснодар, 1996. — 20 с.
10. Панасенко О.М., Чеканов А. В., Арнхольд Ю. и др. Образование свободных радикалов при распаде гидроперок-сида в присутствии миелопероксидазы или активированных нейтрофилов // Биохимия. — 2005. — Т. 70, № 9. — C. 1209-1217.
11. Патент РФ № 2175784, 2001. Петросян Э. А., Сергиен-ко В. И., Каде А. Х. и др. Способ моделирования желчного перитонита // Бюл. № 31.
12. Проскуряков И. Г. Изменение ферментной формулы нейтрофильных лейкоцитов при острых заболеваниях органов брюшной полости: Автореф. дис.... канд. мед. наук. — Краснодар, 1998. — 19 с.
13. Славинский А. А., Никитина Г. В. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидо-черным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения // Клин. лаб. диагностика. — 1999. — № 2. — С. 35-37.
14. Тихотук В. С., Ушаков И. Б., Карпов В. Н., Зуев В. Г. Возможности использования новых интегральных показателей периферической крови человека // Военно-мед. журн. — 1992. — № 3. — С. 27-31.
15. Furtmuller P. G., Arnhold J., Jantschko W. et al. Redox properties of the couples compound I/compound II and compound II/native enzyme of human myeloperoxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. — Vol. 301, № 2. — P. 551-557.
6 >
CT
о
о
ai
ce S й
Q о
В
15
s ^
0 ÏD
о g-
s
и ID l_ К ID X
.0
<
ID IX <u 2 s a ш с У
m
