CC BY
14EXAFS изучение комплексов цинка- моделей активных центров цинксодержащих протеинов
1 2 Власенко В. Г. (vlasenko@ip.rsu.ru) , Ураев А. И.,
2Бурлов А.С., 2Гарновский А.Д.
Научно-исследовательский институт физики и Научно-исследовательский институт физической и органической химии Ростовского государственного университета, г.Ростов-на-Дону.
Серия металлохелатов цинка, как моделей активных центров природных металлопротеинов, была синтезирована на основе новых азометиновых лигандных систем. Строение комплексов было изучено с помощью метода EXAFS-спектроскопии. Было показано, что в металлохелах, полученных на основе лигандов, содержащих потенциально дополнительные донорные центры N/ в хинолиновом заместителе при иминном атоме азота, реализуются связи Zn-N R=2.21-2.37 А. Комплекс, где в качестве заместителя присутствует тиобензол, имеет димерное строение с расстоянием Zn-Zn R=3.18 А и мостиками серы.
Введение
В настоящее время известны тысячи цинксодержащих протеинов, указывая на важнейшую роль этого металла в функционировании биологических систем. Цинк является единственным элементом, который представлен во всех шести классах ферментов Международного биохимического союза. Цинксодержащие протеины участвуют в биохимических реакциях по гидратации CO2 (карбоангидраза), окислении спиртов с образованием альдегидов и кетонов (алкогольдегидрогеназа-LAD), гидролизе белков (карбоксипептидаза), биосинтезе пиримидина (аспартаттранскарбамилаза) и в многочисленных других реакциях, стабилизируют пространственную структуру белковых молекул, участвуют в репликации генов и т.д. [1,2]. Несмотря на большее количество обнаруженных цинксодержащих протеинов, только для небольшого их количества (около 400 в Protein Data Bank [3]) была определена молекулярная структура с помощью рентгеноструктурного анализа. Для некоторых было изучено только ближайшее атомное окружение цинка с использованием EXAFS спектроскопии [4-7]. В остальных цинксодержащих протеинах строение координационного центра определялась по
результатам схожести их функциональных свойств, что не всегда корректно. Как было обнаружено из этих исследований, обычно, активный центр цинксодержащих протеинов содержит тетракоординированный ион Zn(II), связанный с атомами азота гистидина, атомами кислорода глицина или аспарагина и атомами серы цистеина. В качестве одного из лигандов может также служить молекула воды, как, например, в LAD [2].
Синтез простых соединений цинка, строение координационного центра которых, а также их каталитические и спектральные свойства, близки к соответствующим строению и свойствам в природных протеинах, представляет большой научный интерес. Это связано, прежде всего, с тем, что на таких простых моделях легче проследить зависимость функциональных характеристик от изменения строения координационного центра и состава лигандов. Необходимо отметить также, что цинксодержащие протеины ограничены в спектроскопических методах исследования, так как ион цинка в них диамагнитен и не содержит неспаренных электронов, в связи с чем невозможно провести исследования методами ЭПР.
До настоящего времени моделирование активных центров важнейших негемовых цинксодержащих протеинов с N,S-лигандным окружением не выходило за рамки исследования традиционных тетракоординированных металлохелатов с MNxSy хромофором и комплексов на основе макроциклических лигандов [8], например, на основе трис(пиразол)гидроборато лигандов [2]. В настоящей работе, на основе новых азометиновых лигандных систем типа L1-L2 (рис.1), содержащих дополнительные донорные центры N/ или S в заместителе при иминном атоме азота, синтезированы комплексы цинка, атомная структура которых изучена с помощью EXAFS-спектроскопии. Структуры полученных комплексов могут служить моделями активных центров цинксодержащих металлопротеинов с N- и N,S-лигандным окружением.
А
ч
H
X
N O
N. O
S-H
Lia
N
N
S
N \ H
Lib
Lic
N
N^ H
L2a
L2b
Рис.1. Структура азометиновых лигандных систем: Lia- 4-метил-Ы-(6-
фенилиминометил-циклогекса-2,4-диенил)-тозиламин, Lib- 4-метил-Ы-(6-хинолин -8-иминометил-циклогекса-2,4-диенил)-тозиламин, Lic- К-(2-[(2-меркапто-фенилимино)-метил]-фенил}-4-метил-тозиламин, L2a- 5-метил-2-фенил-4-фениламинометилен-2,4-дигидро-3-тиопиразол, L2b- 5-метил-2-фенил-4-(хинолин-8-иминометил)-2,4-дигидро-3-тиопиразол. Эксперимент
Комплексы синтезировали непосредственным взаимодействием лигандов Lia-c и L2a-b (рис.1) с ацетатом цинка в соотношении 2:1 (соединения ZnLia-c) или 1:1 (соединения Zn2a-b) в растворе метанола. После 20-40 мин кипячения выпавшие осадки отфильтровывали, промывали метанолом и перекристаллизовывали из толуола.
EXAFS-спектры ^-края поглощения Zn исследуемых соединений были получены на лабораторном EXAFS- спектрометре [9], созданном на базе дифрактометра ДРОН-3М.
В качестве источника рентгеновского излучения использовалась трубка БСВ-21-Мо при напряжении и= 17 кВ и токе 1=30 тА. Рентгеновское излучение разлагалось в спектр с помощью кварцевого кристалла-монохроматора (1340).
Образцы тщательно перемешивались с апиезоном и помещались между тонкими лавсановыми пленками. Толщина образцов подбиралась таким образом, чтобы интенсивность прошедших рентгеновских лучей уменьшалась в 2.5-3.0 раза. После стандартных процедур выделения фона, нормирования на величину скачка ^-края и выделения атомного поглощения [10] проводился Фурье-анализ полученного БХАББ (х)-спектра для каждого образца в интервале волновых векторов фотоэлектронов к от 2.5 А-1 до 13 А-1 с весовой функцией п=2. Значение волновых векторов к определялось как (1):
к = Л/2те (Е - Е0 )(2п/ к) (1)
где те - масса электрона, Е- энергия падающих фотонов, Е0 - энергия края поглощения, значение которой определялось как положение максимума первой производной 2п края поглощения.
Получаемый в результате Фурье-преобразования БХАББ-спектра модуль Фурье-трансформанты (МФТ) отображает функцию радиального распределения соседних атомов вокруг поглощающего атома 2п. Абсциссы максимумов пиков МФТ (г ) связаны с радиусами КС (Я ) соотношением г = Я-а, где а -величина линейной части фазового сдвига. Амплитуды пиков МФТ пропорциональны координационным числам КЧ (К).
Точные значения параметров структуры ближайшего окружения атома 2п определены путем нелинейной подгонки параметров соответствующих КС при сопоставлении рассчитанного БХАББ-сигнала и выделенного из полного БХАББ-спектра методом Фурье-фильтрации МФТ. Необходимые для построения модельного спектра фазы и амплитуды рассеяния фотоэлектронной волны рассчитывались с использованием программы ББББ5 [11]. В качестве модельных соединений были взяты ацетат цинка и комплекс С28Н44К6822п [12], для которых были известны рентгеноструктурные данные.
Функция качества подгонки Q, минимизация которой проводилась при нахождении параметров структуры ближайшего окружения атома 2п, рассчитывалась по формуле 2:
Обсуждение результатов
На рис. 2 показаны МФТ БХАББ-спектров исследованных образцов, а в таблице приведены параметры ближайшего окружения атома цинка в этих соединениях, полученные в результате подгонки теоретически рассчитанных х(к) выбранных моделей к экспериментальным БХАББ-спектрам.
Как видно из рис.2, МФТ стандартного соединения ацетата цинка и комплекса ZnL1a имеют один нерасщепленный основной пик. Этот пик для МФТ ацетата цинка соответствует рассеянию фотоэлектронной волны на первой КС, состоящей из четырех атомов кислорода. Подгонка для комплекса ZnL1a, при использовании модели, когда ближайшее окружение атома цинка в этом соединении имеет четыре атома азота, дала хорошие результаты. Полученное расстояние 2п-К до первой КС Я= 1.98 А характерно как для простых тетраэдрических комплексов цинка [2пК4], так и для цинксодержащих координационных центров металлопротеинов с подобным ближайшим окружением. Таким образом, в результате реакции ацетата цинка с лигандом L1a образуется комплекс типа Zn(L1a)2.
о
г, А
Рис.2. Модули Фурье-трансформант ХЛББ 2п К- краев соединений (экспериментальные МФТ-красные сплошные линии, теоретические МФТ-черные пунктирные линии): 1- ацетат цинка; 2- ZnL1a; 3- ZnL1b; 4- ZnL2a; 5- ZnL2b; 6- ZnL1c, на вставке показаны МФТ при разных интервалах Фурье-преобразования к=2.5 А"1 - 13 А"1 (синий) и к=5 А"1 - 13 А"1 (красный) с учетом фазовой коррекции.
Таблица. Структурные данные, полученные из многосферной подгонки БХАББ-данных (Я-межатомные расстояния, К- координационное число, а2- фактор Дебая-Валлера,
Q- функция качества подгонки.
6 2.04 4 0.0021 N/N' 6.5
\ N ^S^ 2 2.37 2 0.0029 S
II Nk ^ N Л
ZnL2b- Бис{1-фенил-3-метитл-4-^-(8-хинолил) имино]-5 -пиразолтиолато } Zn(2+)
Лиганд Lib отличается от лиганда Lia замещением фенила на хинолин при иминном атоме азота (рис.1). В этом случае атом азота N хинолина может находиться в удобном для координации положении и служить дополнительным донорным центром. Действительно, в МФТ комплекса ZnLib со стороны больших расстояний от основного пика можно наблюдать плечо (рис.2), соответствующее проявлению такого дополнительного взаимодействия. Подгонка в рамках такой модели дала два атома азота на среднем расстоянии Zn-N R= 2.21 Â. Относительно большой фактор Дебая-Валлера для атомов азота первой КС можно объяснить дисперсией четырех расстояний Zn-N, которые усреднялись при подгонке.
В отличие от МФТ рассмотренных выше ZnLia и ZnLib комплексов, в МФТ комплексов ZnL2a и ZnL2b (рис.2) явно видно расщепление первого основного пика, обусловленное наличием в первой КС двух отличающихся расстояний Zn-N и Zn-S. Можно также отметить, что в МФТ ZnL2b пик, соответствующий рассеянию на атомах азота имеет большую амплитуду по сравнению с подобным пиком в МФТ ZnL2a. Нами были построены модели ближайшего атомного окружения атомов цинка в этих комплексах, где в ZnL2a атом цинка имеет первую КС, состояющую из двух атомов азота и двух атомов серы [ZnN2S2], а в ZnL2b в первую КС добавляется еще два атома азота N хинолинового фрагмента [ZnN2N2S2]. Подгонка теоретически построенных EXAFS-спектров таких моделей к экспериментальным EXAFS-спектрам исследованных образцов
дала величину Q, близкую к полученным для стандартных соединений, что подтверждает достоверность выбранных моделей. Полученные структурные параметры для атомов первой КС в этих соединениях приведены в Таблице. Как видно из таблицы расстояния 2п-Б в обоих комплексах отличаются незначительно, в то время как расстояния имеют заметно различные значения. Увеличение расстояний в ZnL2b комплексе по сравнению с ZnL2а связано с вкладом в радиус его первой КС более длинных дополнительных связей 2п-№, как это наблюдалось и в случае комплекса ZnL1b. Только если для ZnL1b производилась двухсферная подгонка с выделением дополнительной КС из двух N атомов, то в ZnL2b первая КС состояла из N и N атомов и радиус ее усредняли по всем и 2п-к расстояниям.
Следующий комплекс ZnL1с, структура которого была изучена в настоящей работе, был синтезирован в результате взаимодействия ацетата меди с потенциально тридентантными лигандами L1с, имеющими дополнительный донорный центр тиофенильного фрагмента. На основании данных элементного анализа, ЯМР, ИК спектроскопии и дериватографических исследований было установлено [13], что комплексообразование в ZnL1с протекает с замещением обоих атомов водорода иминной и тионной групп и образованием димерного комплекса. Исходя из соответствующей модели, был получен теоретический БХАББ спектр, МФТ которого приведен на рис.2 вместе с МФТ экспериментального БХАББ спектра ZnL1с комплекса. Как вид МФТ, так и полученные из подгонки параметры для ZnL1с близки к таковым для ZnL2а, в соответствии с наличием у атомов цинка в этих соединениях одинаковых двух первых КС, состоящих из двух атомов азота и двух атомов серы. Характерным отличием МФТ этих комплексов должно быть появление пика в МФТ ZnL1с, обусловленного наличию 2п-2п связи в этом соединении и доказывающего достоверность димерного строения. Пик МФТ с г= 2.77 А был выбран кандидатом, ответственным за проявление такого взаимодействия. Как показал модельный расчет ZnL1с, на расстояниях г+(0.4-0.5) А от атома цинка также находятся КС, состоящие из атомов углерода макроциклов лиганда и кислорода
тозиламинного фрагмента. Для обнаружения присутствия атомов металла в этих сложных КС использовалась следующая процедура. Из экспериментов по рассеянию фотоэлектронов на различных атомах установлено, что максимум амплитуды рассеяния для легких атомов лежит при малых значениях к~ 2-4 А-1 (атомы С, O, N) , а для тяжелых атомов он сдвигается в сторону больших к > 8-10 Ä-1 (атомы 3d-металлов). Поэтому, варьируя пределы интегрирования при Фурье-преобразовании EXAFS спектра, можно выделить вклад рассеяния или на легких атомах углерода, кислорода или на тяжелых атомах металла. EXAFS спектр ZnL^ был подвергнут Фурье-преобразованию в интервалах к=2.5 А-1 - 13 А-1 и к=5 А-1 - 13 А-1 и соответствующие МФТ приведены на вставке рис.2. Как видно из рис.2, при Фурье-преобразовании EXAFS спектра ZnL^ в более коротком волновом интервале к=5 А-1 - 13 А"1, когда занижается вклад от рассеяния фотоэлектронов на легких атомах, амплитуда пика с r=2.77 Ä увеличивается по отношению к амплитуде основных пиков, однозначно доказывая его происхождение от рассеяния от атома цинка. Расстояние Zn-Zn R=3.18 Ä, полученное в результате подгонки, характерно для димеров с мостиками серы как в металлопротеинах, например R=3.16±0.02 Ä [4], так и в малых молекулах R=3.180-3.219 Ä [14-17].
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проект 01-03-32538) и программы «Университеты России» УР.05.01.006
Литература
1. D.S. Auld// BioMetals., 2001, 14, p.271-313.
2. G. Parkin//Chem.Commun., 2000, p.1971-1985.
3. http://www.imb-iena.de/ImgLibPDB/pages/MDB/PSE2MDB.shtml
4. I. Ascone, F. Lenouvel, D. Sequeval, H. Dexpert, B. Felenbok//Biochim. et Biophys. Acta., 1997, 1343, p.211-220.
5. M. Kruer, M. Haumann, W. Meyer-Klaucke, R.K. Thauer, H. Dan//Eur.J.Biochem, 2002, 269, p.2117-2123.
6. F.Drablos, D.G.Nicholson, M.Ronning// Biochim. et Biophys. Acta.-1999, 1431, p.433-442.
7. M.L.VanZile, N.J. Cosper, R.A. Scott, D. P. Giedroc//Biochemistry 2000, 39, 11818-11829.
8. Anderson O.P. et al. //J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1997, P. 111-120.
9. Шуваев А.Т., Хельмер Б.Ю., Любезнова Т. А.// Приб. и техн. эксп., 1988, т.3, с.234- 237.
10. Кочубей Д.И., Бабанов Ю.А., Замараев К.И. и др.-Рентгеноспектральный метод изучения структуры аморфных тел: EXAFS-спектроскопия. Новосибирск: Наука. Сиб.отд., 1988, 306 с.
11. Zabinski S.I., Rehr J.J., Ankudinov A., Alber R.C.// Phys.Rev., 1995, B52, P.2995.
12. Тахиров Т.Г., Дьяченко О.А., Тагиев Д.Б., Ниворожкин А.Л., Ниворожкин Л.Е., Минкин В.И.// Коорд.хим., 1988, 14, с.237-249.
13. А.С.Бурлов, А.И.Ураев, Л.И.Кузнецова, Е.Д.Гарновская, И.Г.Бородкина, Ф.И.Долгушин, К.А.Лысенко, М.Ю.Антипин, А.Д.Гарновский//Сб. мат. VI Межд. семинара по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), 8-11 октября 2002 г., Ростов-на-Дону, с.156-157.
14. A.D. Watson, C.P.Rao, J R. Dorfman, R.H. Holm // Inorg.Chem., 1985, 24, p.2820.
15. M.A. Malik, M.Motevalli, J.R.Walsh, P.O'Brien, A.C.Jones// J.Mater.Chem., 1995, 5, p.731.
16. K. Halvorsen ,G.A. Crosby, W.F. Wacholtz// Inorg.Chim.Acta, 1995, 228, p. 81.
17. P.J. Gronlund, W.F. Wacholtz, J.T. Mague// Acta Crystallogr.,Sect.C(Cr.Str.Comm.), 1995, 51, p.1540.
