Естественные пути деградации гербицидов ряда сульфонилмочевины Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 573.6:579.66:632.954

В. Н. Леонтьев, кандидат химических наук, доцент, заведующий кафедрой (БГТУ);

Т. И. Ахрамович, кандидат биологических наук, доцент (БГТУ);

О. С. Игнатовец, кандидат биологических наук, ассистент (БГТУ);

О. И. Лазовская, инженер (БГТУ)

ЕСТЕСТВЕННЫЕ ПУТИ ДЕГРАДАЦИИ ГЕРБИЦИДОВ РЯДА СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНЫ

В настоящее время в сельском хозяйстве большое внимание уделяется разработке и использованию малозатратных и в то же время эффективных методов борьбы с сорной растительностью. В связи с этим широкое распространение приобрели гербициды ряда сульфонилмочевины. В работе представлены общая характеристика, механизм действия, пути деградации (гидролиз, фотохимическая трансформация и микробная деградация) метсульфурон-метила и трибенурон-метила. Показана ключевая роль хромато-масс-спектрометрии в установлении механизмов разложения данных гербицидов почвенными микроорганизмами.

Currently in agriculture much attention is paid to development and use of low-cost and at the same time effective methods of fight against weeds. In this regard, widely purchased sulfonylurea herbicides. The paper presents the general characteristics, mechanism of action, degradation pathways (hydrolysis, photochemical transformation and microbial degradation) of metsulfuron-methyl and tribenuron-methyl. The key role of chromato-mass-spectrometry to establish the mechanisms of destruction these herbicides by soil microorganisms is shown.

Введение. Производные сульфонилмочевины - класс химических соединений, к которому принадлежат гербициды нового поколения, проявляющие высокую биологическую активность при нормах расхода на 1-2 порядка ниже по сравнению с традиционно применяемыми препаратами.

Типичными представителями соединений ряда сульфонилмочевины являются метсульфу-рон-метил и трибенурон-метил (рис. 1).

О ОСН3

"V 3

С О О ОСН3

II ^

-Б— НЧ— С—N

N"4

О СН3

1 3

риса, сои и других культур для борьбы с двудольными сорняками, в том числе устойчивыми к 2,4-Д [1].

Метсульфурон-метил является действующим веществом таких препаратов, как «Аккурат», «Ларен Про», «Магнум», «Метурон», «Раджметсол» (норма расхода 8-10 г/га), три-бенурон-метил - «Гармонд», «Гранд», «Гран-стар», «Гюрза», «Тамерон», «Трибун» (норма расхода 15-25 г/га) [2].

Основная часть. Механизм действия гербицидов ряда сульфонилмочевины состоит в ингибировании ацетолактатсинтазы - ключевого фермента биосинтеза аминокислот с алкиль-ными боковыми цепями (рис. 2).

пируват

пируват

2-кетобутират

O OCH3

v 3

CO

O OCH3

II W

• s— HN— C— N

I N—^

O CH3 CH3

2

Рис. 1. Структурные формулы соединений ряда сульфонилмочевины: 1 - метсульфурон-метил; 2 - трибенурон-метил

2 -ацетолактат 1

2,3-дигидрокси-изовалерат

1

2-кетоизовалерат

лейцин валин

2-ацетогидроксибутират 1

2,3-дигидрокси-3-метилвалерат

1

2-кето -3 -метилвалерат \

изолейцин

Гербициды на их основе применяются на посевах злаковых, льна, кукурузы, хлопка, арахиса,

Рис. 2. Схема биосинтеза аминокислот с алкильными боковыми цепями

O OCH3 ^ / 3

C

O O ,OCH3

II II N^ 3

-S—H^C—H^^ N

N-4

O i CH3

O OCH3

3

CO

fVs-

nh2

\=/ I

O

H2N—^

N=<

OCH3

N

N

CH3

Рис. 3. Основные продукты гидролиза метсульфурон-метила: 1 - метсульфурон-метил; 2 - метил-2-(аминосульфонил)-бензоат; 3 - 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин

Под воздействием этих гербицидов клетки прекращают делиться и растение погибает. У культурных растений, устойчивых к сульфо-нилмочевинам, происходит их метаболизация. Ацетолактатсинтаза контролирует синтез алифатических аминокислот с разветвленным углеродным скелетом, из-за дефицита которых нарушается синтез белка и замедляется деление клеток. В результате растение останавливается в росте и постепенно погибает. Существенным фактом является отсутствие фермента ацето-лактатсинтазы у теплокровных, в частности у человека, что объясняет безопасность этих препаратов для нерастительных объектов [3].

Разложение гербицидов в почве может происходить под действием химических (гидролиз), физических (фотолиз) и биологических (микробная деградация) факторов.

Гидролиз соединений ряда сульфонилмоче-вины протекает за счет влаги, адсорбированной частицами почвы. Скорость гидролиза зависит от химической структуры гербицидов, а также от внешних условий - температуры, влажности, уровня кислотности и типа почв [1].

Основные продукты гидролиза метсульфу-рон-метила и трибенурон-метила, по данным литературы [4, 5], представлены на рис. 3 и 4 соответственно.

О

nh

// ^o

o

o

o och3 ^ / 3

c o

/ч ii 11 /=<

(' x>- s— hn—c— n—l n

1 ли:

o , ch3

och3

\=7~ \

1

ch3

o oh ^ /

co

r-SJ

К s—nh2

\=/ II 2

o

Н^^ N

i n4

ch3

4

och3

ch3

2

3

Рис. 4. Основные продукты гидролиза трибенурон-метила: 1 - трибенурон-метил; 2 - 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксид (сахарин); 3 - 2-(аминосульфонил)-бензойная кислота; 4 - 4-метокси-6-метил-2-аминометил-1,3,5-триазин

Фотолиз представляет собой ионно-ради-кальный процесс превращения вещества под действием квантов поглощенного электромагнитного излучения в ультрафиолетовой или видимой областях спектра.

Поскольку производные сульфонилмочеви-ны имеют ароматические углеводородные и гетероциклические хромофорные группы, поглощающие излучение в УФ области спектра, то под его воздействием гербициды претерпевают трансформации, приводящие, в конечном итоге, к деградации этих соединений.

Фотолиз метсульфурон-метила сильно зависит от рН. Фотодеструкция более интенсивно протекает с неионизированной формой мет-сульфурон-метила, причем продукты отличаются в случае использования различных растворителей, а также при воздействии излучения с разными значениями длин волн (рис. 5). Механизм фотохимической трансформации мет-сульфурон-метила может протекать по четырем основным конкурентным путям: разрыв связей С-Ч, Ч-СО, Ч-Б и Б-С в сульфонилмочевин-ном фрагменте молекулы [6].

О ОСН3 / 3

С О О ОСН3

/л 11 11

<' ч>— Б—Н^— С— N

\=/ II N4

О СН3

УФ-излучение

О

^ /

ОСН3

О ОСН3

II /ч

Б—н:ы— С— Н^^ N

N4

СН3

Н2О

СН3(СН3)СНОН CH3CN

О ОСН3

3

С

<^ОН

НО

О О ОСН3

II II

'— Б— Н^— С— Н^^ N

II \т '/

N4

СН3

О ОСН

■V

+ Но№

ч /

ОСН3

СН3

Рис. 5. Схема фотолиза метсульфурон-метила: 1 - метсульфурон-метил; 2 - 2-гидроксиметилбензоат; 3 - [[4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил) амино]карбонил]-сульфамиловая кислота; 4 - метилбензоат; 5 - 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин

+

+

О

4

5

В связи с тем что в структуре трибенурон-метила у одного из атомов азота мочевинного фрагмента находится СН3-группа, нарушено сопряжение бензольного и триазинового колец, что делает затруднительным фотохимическое возбуждение и деструкцию этого соединения под действием электромагнитного излучения видимой и ближней ультрафиолетовой областей спектра.

Наиболее важной составляющей разложения гербицидов в почве является деградация почвенной микробиотой, которая осуществляется благодаря способности микроорганизмов адаптировать свои ферментные системы к определенным субстратам и трансформировать их. Причем некоторые метаболиты оказываются более токсичными, чем исходные соединения. С целью определения таких метаболитов необходимо знать механизмы биодеградации конкретных пестицидов.

Изучение механизмов биодеградации гербицидов основано на идентификации их метаболитов с помощью современных физико-химических методов структурно-функционального анализа.

В частности, на рис. 6 представлена хрома-тограмма метсульфурон-метила и промежуточных продуктов его микробной деградации.

Анализ показал, что хроматографический пик со временем удерживания 6,98 мин соответствует метсульфурон-метилу в виде [М+Н]+ с m/z 382,66; пик со временем удерживания 2,87 мин - метил-2-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-4-гидрокси-бензоату в виде [М+№]+ с m/z 420,36; пик со временем удерживания 3,80 мин - метил-2-

(аминосульфонил)-бензоату в виде [М+Н]+ с m/z 216,24; пик со временем удерживания 5,62 мин - 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диок-сиду (сахарину) в виде [М+№]+ с m/z 206,43; пик со временем удерживания 10,79 мин - продукту с раскрытым триазиновым циклом в виде [М+Н]+ с m/z 398,24.

На основании полученных данных и анализа литературы [7] предложен механизм деградации метсульфурон-метила почвенными микроорганизмами (рис. 7).

В аэробных условиях метсульфурон-метил (метил-2- [[[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)амино]карбонил]амино]сульфонил]-бензо-ат) (1) претерпевает изменения в структуре по следующим направлениям:

- гидроксилирование бензольного кольца приводит к образованию метил-2-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5 -триазин-2-ил)карбамоил] сульфамоил]-4-гидроксибензоата (6);

- расщепление сульфонилмочевинного фрагмента приводит к образованию метил-2-(амииносульфонил)-бензоата (2) и 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазина (5), а соединение (2) после деметилирования в 2-(амино-сульфонил)-бензойную кислоту (3) превращается в 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-ди-оксид (сахарин) (4). В анаэробных условиях происходит деметилирование метоксигруппы триазинового кольца с образованием метил-2-[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)-кар-бамоил]сульфамоил]-бензоата (9), который затем превращается в 4-гидрокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин (10) и продукты с раскрытым триа-зиновым циклом (11, 12).

3: Diode Array TIC 1.21е6

I " " I ' " Ч " " I " " I ' " Ч " " I ' ' "I ' I " I " " I " I Ч " " I ' " Ч ' " Ч " " I '

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

00 ' ' ' 9,00' ' ' ' 10,00 ' ' 11,00 ' ' 12,00 ' ' 13,00 ' ' 4,00' ' ' 15,00

Время, мин

Рис. 6. Хроматограмма метсульфурон-метила и промежуточных продуктов его микробной деградации. На врезках - электронный и масс-спектры метсульфурон-метила

о OH ^ /

I о о ЮН

// 4.H ii /=<

^ J— S— HN— C— HN—^ ^N

CH3

о

O OH

V

C O

// 4 " ii /к

(' N>— S—HN— C—HN^4 N

W II n4

OCH3

O

7

CH3

2N N N

OCH3

CH3

O OCH3

V 3

CO

Ö-.

O OCH3

V

CO

O O OCH3

/4 ii II

(' V- S—HN—C—HN^4 N

\=/ II Лт '/

HO O

N

S— HN— C— HN-

4

N

,OCH3

N

CH3

N

CH3

OH

N

H2N ^ N N

CH3

10

O OH C OH

CO

3 O

S—nh2

O OCH3 CO

ck

s—nh2

4 /OCH3

O O OH

N OH

HN— C— H^^^ N

N

CH3

5

8

6

O

O

1

O

2

9

O

O

Рис. 7. Механизм деградации метсульфурон-метила почвенными микроорганизмами: 1 - метсульфурон-метил; 2 - метил-2-(аминосульфонил)-бензоат; 3 - 2-(аминосульфонил)-бензойная кислота; 4 - 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксид (сахарин); 5 - 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин; 6 - метил-2-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-4-гидроксибензоат;

7 - 2-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-бензойная кислота;

8 - 2-[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-бензойная кислота; 9 - метил-2-[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-бензоат;

10 - 4-гидрокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин; 11, 12 - продукты с раскрытым триазиновым циклом

Деметилирование метилового эфира у бензольного кольца приводит к образованию 2-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил] сульфамоил]-бензойной кислоты (7), которая далее превращается в 2-[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)карбамоил]сульфамоил]-бензойную кислоту (8) и соединение (3).

Таким образом, хромато-масс-спектромет-рический анализ позволил идентифицировать

четыре основных метаболита деградации мет-сульфурон-метила.

На рис. 8 представлены хроматограммы трибенурон-метила и продуктов его микробной деградации, полученные в одном эксперименте с помощью двух разных детекторов.

Анализ показал, что хроматографический пик со временем удерживания 12,21 мин соответствует трибенурон-метилу в виде [М+Н]+ с m/z

396,83; пик со временем удерживания 3,89 мин -метил-2-(аминосульфонил)-бензоату в виде [М+Н]+ с m/z 216,12; пик со временем удерживания 5,81 мин - 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксиду (сахарину) в виде [М+Ка]+ с m/z 206,27; пик со временем удерживания 9,51 мин -4-метокси-6-метил-2-аминометил-1,3,5-триази-ну в виде [М+Н]+ с m/z 155,63; пик со временем удерживания 9,95 мин - 2-гидрокси-4-метил-6-диметиламино-1,3,5-три-азину в виде [М+Н]+ с m/z 155,21.

На основании полученных данных и анализа литературы [8] предложен механизм деградации трибенурон-метила почвенными микроорганизмами (рис. 9).

В аэробных условиях трибенурон-метил (метил-2-[[[[(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)метиламино]карбонил]амино]сульфонил]-бензоат) (1) претерпевает изменения в структуре по следующим направлениям:

- расщепление сульфонилмочевинного фрагмента с выделением СО2 приводит к образованию метил-2-(аминосульфонил)-бензоата (2) и 4 -метокси-6-метил-2-аминометил-1,3,5-три-азина (7);

- соединение (2) после деметилирования в 2-(аминосульфонил)-бензойную кислоту (3) превращается в 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксид (сахарин) (4);

- соединение (7) подвергается метилированию по аминному атому азота и О-деметили-рованию с образованием 2-гидрокси-4-метил-6-диметиламино-1,3,5-триазина (8);

- соединение (7) подвергается К-деметили-рованию с образованием 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазина (9);

- соединение (1) подвергается гидроксили-рованию по СН3-группе триазинового кольца с образованием метил-2-[[[[(6-оксиметил-4-мет-окси-1,3,5-триазин-2-ил)метиламино] карбонил]-амино]сульфонил]-бензоата (5);

- соединение (5) подвергается К-деметили-рованию с последующим расщеплением суль-фониламинного фрагмента с образованием К-[4-метокси-6-(гидроксиметил)-1,3,5-триазин-2-ил]-мочевины (6).

В анаэробных условиях трибенурон-метил подвергается микробиологической трансформации с образованием метил-2-[[[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5 -триазин-2-ил)метиламино] карбо -нил]амино]сульфонил]-бензоата (10).

Таким образом, в результате хромато-масс-спектрометрического анализа идентифицированы четыре основных метаболита деградации трибе-нурон-метила, два из которых - метил-2-(амино-сульфонил)-бензоат и 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксид (сахарин) - являются общими для обоих представителей ряда сульфонилмочевины.

100

0х

ив"

н о о

и «

s

о И

(D

15

3,89 Л

5,81

J

\

12,21

1,0

0

232,45

200 225 250 nm

3 Diode Array TIC

1 3ii7

а

Время, мин

Рис. 8. Хроматограммы трибенурон-метила и продуктов его микробной деградации, полученные с помощью диодно-матричного детектора (а) и масс-детектора (б). На врезках - электронный и масс-спектры трибенурон-метила

о осн3

v 3

со

о у он

n

II

нм— с— n—и

iл-4

о сн3 сн

10

Н

n"4

осн3

сн3

о осн3

v 3

со

^б-мн

2

о

о осн3

v 3

со

о

Л Л II м

" б—н^с—n N N—^

осн3

о

сн3

сн3

Н

нчн л!

i к-л

осн3

сн3

сн3

о он

v

со

V б—мн2

о

о осн3

v 3

со

м-б-1

о

осн3

- ^

■ нм— с— n—и n

\=/ ii i n—^

о СН3 сн2он

5

n

он

н3с

i м-<

сн3 сн3

о

о

мн

б

о

о

н2ч— с— мн—^ n

мч

осн3

сн2он

9

2

1

7

3

8

4

6

Рис. 9. Механизм деградации трибенурон-метила почвенными микроорганизмами: 1 - трибенурон-метил; 2 - метил-2-(аминосульфонил)-бензоат; 3 - 2-(аминосульфонил)-бензойная кислота; 4 - 1,2-бензизотиазол-3(2Н)он-1,1-диоксид (сахарин);

5 - метил-2-[[[[(6-оксиметил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)метиламино]карбонил]амино]сульфонил]-бензоат;

6 - М-[4-метокси-6-(гидроксиметил)-1,3,5-триазин-2-ил]-мочевина; 7 - 4-метокси-6-метил-2-аминометил-1,3,5-триазин;

8 - 2-гидрокси-4-метил-6-диметиламино-1,3,5-триазин; 9 - 4-метокси-6-метил-2-амино-1,3,5-триазин; 10 - метил-2-[[[[(4-гидрокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)метиламино]карбонил]амино]сульфонил]-бензоат

Одной из ключевых стадий в исследовании механизмов биодеградации гербицидов в почве является пробоподготовка, которая существенным образом зависит от способа и полноты

экстракции остаточных количеств этих соединений и их метаболитов. Проблема состоит в том, что вышеназванные соединения адсорбируются компонентами различных типов почв

по-разному. В связи с этим полнота извлечения остаточных количеств гербицидов и их метаболитов будет сильно зависеть от способа экстракции, состава экстрагента и типа почв.

Существуют следующие способы извлечения загрязняющих веществ из почвы [9]:

- термодесорбция;

- жидкостная экстракция;

- экстракция в микроволновом поле;

- экстракция субкритической водой;

- сверхкритическая флюидная экстракция;

- парофазный анализ.

Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, рассмотрение которых выходит за рамки данной статьи.

В настоящей работе использован метод жидкостной экстракции метсульфурон-метила, три-бенурон-метила и метаболитов их деградации из модельной системы, состоящей из стерильной агродерново-подзолистой почвы и культуры соответствующих микроорганизмов-деструкторов. Причем в качестве экстрагента был выбран ме-тиленхлорид, обеспечивший наиболее полное извлечение метсульфурон-метила, трибенурон-метила и их метаболитов.

Заключение. Представленные в статье результаты исследований, выполненных в рамках задания «Анализ путей биотрансформации пестицидов группы сульфонилмочевины для разработки технологии ремедиации природных сред» ГПНИ «Фундаментальные основы биотехнологий», свидетельствуют о том, что метод хромато-масс-спектрометрии является исключительно информативным для установления механизмов биотрансформации и биодеградации пестицидов. Выработанные в ходе выполнения исследований подходы легли в основу методик мониторинга данных гербицидов и метаболитов их деградации в объектах окружающей среды, а также будут использованы для создания биопрепаратов, предназначенных для ремедиации природных

сред, загрязненных гербицидами ряда суль-фонилмочевины.

Литература

1. Куликова, Н. А. Гербициды и экологические аспекты их применения: учеб. пособие / Н. А. Куликова, Г. Ф. Лебедева. - М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2010. - 152 с.

2. Государственный реестр средств защиты растений (пестицидов) и удобрений, разрешенных к применению на территории Республики Беларусь: справ. издание / Л. В. Плешко [и др.]. -Минск: ООО «Редакция журнала «Земляробст-ва i ахова раслш», 2011. - 544 с.

3. Action mechanisms of acetolactate synthase-inhibiting herbicides / Q. Zhou [et al.] // Pesticide Biochem. and Physiol. - 2007. - Vol. 89. -P.89-96.

4. Халиков, И. С. Исследование трансформации сульфонилмочевин в природных средах: автореф. дис. ... канд. хим. наук: 02.00.10 / И.С. Халиков; ВНИХСЗР. - М., 1992. - 28 с.

5. Scientific report on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance tribenuron / EFSA Journal. - 2005. -Vol. 3. - 52 p.

6. Caselli, M. Light-induced degradation of metsulfuron-methyl in water / M. Caselli // Chemosphere. - 2005. - Vol. 59. - P. 1137-1143.

7. Metabolic pathways of agrochemicals: herbicides and plant growth regulators / D. H. Hut-son [et al.]; editor-in-chief T. Roberts. - Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1998. -851 р.

8. Stoytcheva, М. Pesticides in the modern world - pesticides use and management / М. Stoy-tcheva. - Rijeka: InTech, 2011. - 520 р.

9. Другов, Ю. С. Пробоподготовка в экологическом анализе: практ. руководство / Ю. С. Другов, А. А. Родин. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 855 с.

Поступила 27.02.2013