CC BY
207
Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 4-5, стр. 467-472 © 2007, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
эозинофильный катионный
ПРОТЕИН КАК МАРКЕР АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕнИЯ
слизистой оболочки носа
Мокроносова М.А., Тарасова Г.Д., Протасов П.Г., Смольникова Е.В., Сергеев А.В.
Лаборатория иммунологии, биохимии и микологии, Государственное учреждение Федеральный научноклинический центр оториноларингологии Росздрава, Москва
Резюме. В патогенезе поздней фазы аллергического воспаления слизистой носа эозинофилам отводят ведущую роль. В работе было поведено определение уровней эозинофилов в назальном секрете у 33 больных персистирующим аллергическим ринитом (ПАР) и 25 пациентов с хроническим инфекционным ринитом (ХИР), а также уровней эозинофильного катионного протеина (ЕСР) в назальном секрете и сыворотке крови, и определена диагностическая значимость этих показателей. Содержание эозинофилов в назальном секрете определяли с помощью эксфолиативного цитологического анализа. Забор назального секрета у пациентов проводили абсорбционным методом. Стандартизация образцов проводилась в соответствии с концентрацией мочевины в назальном секрете и сыворотке крови. Уровни ЕСР в назальном секрете и сыворотке крови были определены иммунохемилюминесцентным методом (UniCAP 100, Phadia, Швеция). Средний уровень эозинофилов в назальном секрете у больных ПАР был в 4,6 раз выше, чем у пациентов с ХИР. Средние значение концентрации ECP в сыворотке крови и назальном секрете в группе больных ПАР составили 30,5±28 мкг/л и 402,7±326,9 мкг/л соответственно. В группе больных ХИР — 12,4±11,5 мкг/л и 86,9±137,4 мкг/л. Различия были достоверными (р < 0,05). Взаимосвязи между концентрацией ECP в сыворотке крови и назальном секрете и между количеством эозинофилов и уровнем ECP в назальном секрете не было выявлено. Наибольшей чувствительностью обладал метод определения концентрации ECP в назальном секрете, наибольшей специфичностью — метод определения содержания эозинофилов в назальном секрете. Уровень ЕСР в назальном секрете характеризует активную фазу аллергического воспаления и может быть использовать как количественный параметр оценки тяжести течения ПАР.
Ключевые слова: эозинофильный катионный протеин, аллергический ринит, назальный секрет.
Mokronosova M.A., Tarasova G.D., Protassov P.G., Smol’nikova E.V., Sergeev A.V.
EOSINOPHILIC CATIONIC PROTEIN AS A MARKER OF ALLERGIC INFLAMMATION OF NASAL MUCOSA
Abstract. Eosinophils are regarded as major cell population directly involved into late phase of allergic inflammation of nasal mucosa. We performed a comparative study, measuring the amounts of eosinophils and eosinophilic cationic protein (ECP) in nasal secretions and serum samples of thirty-three patients with persistent allergic rhinitis (PAR), and twenty-five persons with chronic infectious rhinitis (CIR), to determine diagnostic significance of these parameters. Eosinophil counts in nasal secret were carried out by exfoliative cytology analysis. Sampling of nasal secretions was performed by absorption method. The samples were
standardized by concentration of urea in nasal secretions Адрес для переписки: and sera. ЕСР levels in nasal secretions and serum were
Сергеев Андрей Викторович determined by chemiluminescence assays (UniCAP
117485, Москва, ул. Бутлерова, 10, 208. 100, Phadia Sweden).
Тел.: +7(495) 336-79-54, 917-08-91. Mean scores of eosinophils in nasal secret of PAR
Факс: +7(495) 917-49-00. patients were 4.6 times higher, than in the patients
E-mail: avsergeyev@yandex.ru with CIR. Median ECP values in serum and nasal
467
Мокроносова М.А. и др.
Медицинская Иммунология
secretions of PAR patients were, resp., 30.5±28.0 pg/l and 402.7±326.9 pg/l. In patients with CIR, ECP values were 12.4±11.5 pg/l in serum and 86.9±137.4 pg/l in nasal secretions. The appropriate differences have been significant (p < 0.05). No correlations were found between ECP levels in serum and nasal secretions, as well as between ECP levels and eosinophil counts in nasal secretions. The technique of ECP determination in nasal secretions was the most sensitive approach, whereas counting of eosinophils proved to be the most specific method. ECP levels in nasal secretions well characterize an active phase of allergic inflammation and may be used as quantitative parameter for estimation of PAR severity. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N 4-5, pp 467-472)
Введение
Персистирующий аллергический ринит (ПАР) — хроническое заболевание слизистой оболочки полости носа, в основе которого лежит иммунологически обусловленная реакция гиперчувствительности слизистой оболочки полости носа на ингаляционные аллергены. Дифференциальная диагностика ПАР часто бывает затруднительной. Это связано с тем, что, во-первых, ПАР часто осложняется инфекционными заболеваниями верхних дыхательных путей. Во-вторых, необходимо отличать ПАР от многих сходных по клинической симптоматике заболеваний. В этой связи разработка методов диагностики ПАР весьма актуальна. В патогенезе ПАР особая роль принадлежит локальному накоплению эозинофилов, провоспалительных цитокинов, хемо-кинов и экспрессии молекул межклеточной адгезии на эндотелий кровеносных сосудов в области воспаления [4, 8, 21]. Существуют объективные маркеры аллергического воспаления, обнаруживаемые как в сыворотке крови, так и в назальном секрете и мокроте, уровень которых определяет степень поражения дыхательных путей [5]. К таковым относят эозинофилию, повышение уровня эозинофильного катионного протеина (ЕСР), триптазы, лейкотриенов и некоторых других медиаторов воспаления [2, 5, 8, 13]. ЕСР является объективным маркером активации эозинофилов. Он составляет 70% от всех белков, продуцируемых эозинофилами, стимулирует секрецию слизи, тормозит пролиферацию Т-лимфоцитов, действует на свертываемость крови, обладает цитотоксичностью [3, 7, 15].
Цель работы: оценить диагностическое значение показателей концентрации ECP в сыворотке и назальном секрете и проанализировать зависимость между концентрациями ECP и содержанием эозинофилов в назальном секрете больных ПАР.
Материалы и методы
Были исследованы образцы сыворотки крови и назального секрета от 33 больных ПАР и 25 пациентов с диагнозом «хронический инфекционный ринит (ХИР) в стадии обострения забо-
левания». Возраст пациентов варьировал от 3 до 58 лет. На момент обследования ни один из пациентов не получал какую-либо терапию. Для диагностики ПАР использовали анкету «The Score for Allergic Rhinitis», основанную на количественной системе подсчета в баллах и позволяющую выявить не только аллергический ринит, но и некоторые особенности данного диагноза: сезонность, сенсибилизирующий фактор, тяжесть клинических проявлений [11]. Верификацию диагноза ПАР проводили согласно общепринятым стандартам диагностики на основании клинической картины заболевания, аллергологического анамнеза, данных кожного тестирования с основным набором аэроаллергенов. При обследовании пациентов с ХИР признаков аллергии выявлено не было.
Забор назального секрета у пациентов проводили абсорбционным методом с помощью тампонов из полиакрилонитрильного волокна, которые затем помещали в 1 мл 2,7% раствора динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (рН = 7,4), и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 минут для осаждения целых клеточных элементов [1, 6, 17] Супернатант использовался в качестве исследуемого материала. Содержание ЕСР в назальном секрете и сыворотке крови пациентов исследуемых групп проводили иммунохемилюминесцентным методом на приборе «UniCAP 100» (Phadia, Швеция) с применением реагентов для определения ЕСР в сыворотке.
Стандартизацию образцов проводили в соответствии с концентрацией мочевины в назальном секрете и сыворотке крови [1, 20]. Уровень мочевины определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир 400» уреазным-глутаматдегидрогеназным методом с использованием реактивов фирмы «DiaSys Diagnostic Systems GmbH & Co KG» (Германия).
Вычисление содержания ЕСР рассчитывали по формуле: Х = А х С/В, где Х — количество искомого ЕСР в образцах назального секрета (мкг/л), А — концентрация мочевины в сыворотке крови (моль/л), В — концентрация мочевины в назальном секрете (моль/л), С — концентрация
468
2007, Т. 9, № 4-5
ЕСР — маркер аллергического ринита
ЕСР, полученная при исследовании образца назального секрета (мкг/л).
Клеточный состав назального секрета оценивали с помощью эксфолиативного цитологического анализа [9, 10]. Мазок содержимого полости носа на стекле высушивали при комнатной температуре и фиксировали в метиловом спирте в течение 10 мин. Препарат окрашивали раздельно: сначала водным раствором эозина К (1 г/л), затем водным раствором азура (1 г/л). После просушивания мазок изучали под световым микроскопом с 90-кратным увеличением с иммерсией. В мазке подсчитывали не менее 200 клеточных элементов. Определяли процентное содержание эпителиальных клеток, лимфоцитов, нейтро-фильных и эозинофильных лейкоцитов, оценивали состояние клеточных элементов — изменения мембраны, цитоплазмы, ядра, а также морфологию эпителия.
Была проведена оценка диагностической эффективности определения ECP в сыворотке и в назальном секрете и уровня эозинофилов в эксфолиативном цитологическом анализе назального секрета. Оценивались показатели чувствительности методов (способности выявлять аллергический генез ринита среди больных именно с этой патологией), специфичности методов (способности идентифицировать риниты инфекционного генеза) и вероятности правильного диагноза у больных с ПАР.
Результаты
На рисунке 1 представлены результаты по определению ECP в сыворотке крови у пациентов исследуемых групп. Величина концентрации ECP в группе больных ПАР варьировала от 3,4 до 90,5 мкг/л, среднее значение составило (30,5±28) мкг/л, а в группе больных ХИР этот показатель колебался в диапазоне от 2,9 до 51,7 мкг/л при среднем значении (12,4±11,5) мкг/л. Отличие в средних уровнях концентрации ЕСР в сыворотке крови у атопических и неатопических пациентов было достоверным (р < 0,05). На рисунке 2 представлены показатели содержания ECP, выявленные в назальном секрете больных ПАР и ХИР. Полученные значения ECP находились в диапазоне от 4,7 до 1477,2 мкг/л. Среднее значение составило 402,7±326,9 мкг/л в группе пациентов с ПАР и достоверно превышало таковое в группе неатопических пациентов, где оно соответствовало 86,9±137,4 мкг/л (р < 0,05).
С целью исследования зависимости между локальной и системной активацией эозинофилов было проведено сравнение показателей ECP в сыворотке крови и назальном секрете. Взаимосвязи между концентрацией ECP в сы-
ПАР ХИР
Диагноз
Mean | ±SE
±1,96*SE
Рисунок 1. Содержание ECP в сыворотке крови больных ПАР и ХИР
воротке крови и назальном секрете выявлено не было. При проведении анализа корреляции данных признаков по Спирмену отсутствие взаимосвязи было подтверждено г = 0,23 (р > 0,05) (рис. 3).
При анализе связи между количеством эозинофилов и уровнем ECP в назальном секрете было выявлено отсутствие зависимости между этими параметрами г = 0,28; р > 0,05, хотя и прослеживалась положительная тенденция во взаимосвязи этих признаков (рис. 4).
мкг/л
600
500
400
а. 300 о
200
100
0
ПАР ХИР
Диагноз
Mean
±SE
±1,96*SE
Рисунок 2. Содержание ECP в назальном секрете больных ПАР и ХИР
469
Мокроносова М.А. и др.
Медицинская Иммунология
мкг/л
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
ECP н.с. ст.
Рисунок 3. Взаимосвязь между уровнем ECP в назальном секрете и сыворотке крови
В таблице 1 представлена сравнительная характеристика показателей диагностической эффективности методов определения ECP в сыворотке и в назальном секрете и уровня эозинофилов в эксфолиативном цитологическом анализе назального секрета. Как видно, наибольшая чувствительность оказалась у метода определения концентрации ECP в назальном секрете. Наибольшая специфичность выявлена при опре-
делении содержания эозинофилов в назальном секрете.
На рисунке 5 представлена сравнительная характеристика апробированных методов диагностики у двух групп пациентов — атопических и неатопических. Частота повышенных значений уровня эозинофилов в назальном секрете в группе больных ПАР была 44%, а в группе с ХИР — 11% (р < 0,05). Высокие значения концентра-
0 10 20 30 40 50 60 70 80
ЭО н.с.
%
Рисунок 4. Взаимосвязь между количеством эозинофилов и концентрацией ECP в назальном секрете
470
2007, Т. 9, № 4-5
ЕСР — маркер аллергического ринита
ТАБЛИЦА 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАТИВНОСТИ
методов определения еср и эозинофилов
Методы Характеристика^"""--.....^ Определение ECP в сыворотке крови Определение ECP в назальном секрете Определение эозинофилов в назальном секрете
Чувствительность 65,4% 87,9% 43,9%
Специфичность 72,2% 72,0% 88,9%
Вероятность 77,3% 80,5% 94,7%
ции ЕСР в сыворотке крови были обнаружены в 65,4% случаев у больных ПАР и в 27,8% случаев у пациентов с ХИР (р < 0,05). Частота повышенных значений концентрации ЕСР в назальном секрете у исследуемой группы составила 87,9%, а у группы сравнения — 28% (р < 0,05).
Обсуждение
Поиск адекватных, доступных, легковоспроизводимых, неинвазивных методов диагностики ПАР представляет собой актуальную проблему [18]. ПАР — заболевание, протекающее волнообразно в течение многих лет. Для этой патологии характерно наличие острой и хронической фаз воспаления, обострений и ремиссий. Проблема стандартизации метода получения и исследования образцов назального экссудата осложняется тем, что в каждом случае на разных этапах заболевания наблюдается ринорея различной интенсивности, и концентрация белков в секрете существенно варьирует [12]. Для получения достоверных и сравнимых результатов была осуществлена процедура стандартизации образцов назального секрета по концентрации мочевины (в соответствии с таковой в сыворотке крови). В соответствии
% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Эозинофилы > 10% ECP ECP
в назальном в сыворотке > 15 мкг/л секрете > 35 мкг/л
■ ПАР ■ ХИР
Рисунок 5. частота выявления высоких уровней содержания эозинофилов и ECP у больных ПАР и ХИР
с определением концентрации мочевины была вычислена концентрация ЕСР.
Аллергическое воспаление полости носа характеризуется, прежде всего, инфильтрацией ткани слизистой оболочки полости носа эозинофилами [14]. Один из наиболее токсичных белков, составляющий наибольший удельный вес в эозинофильных гранулах, — ЕСР [16, 19]. Среднее значение концентрации ЕСР в сыворотке крови в группе больных ПАР в 2,5 раза превышало таковой показатель у больных в группе сравнения, а среднее значение концентрации ЕСР в назальном секрете в группе больных ПАР было в 3,1 раз выше, чем у пациентов с ХИР.
При сравнении диагностической значимости определения концентрации ЕСР в сыворотке крови и назальном секрете, оказалось, что второй метод наиболее чувствительный, т.е. этот факт свидетельствует о выраженном локальном аллергическом воспалении в полости носа, при отсутствии системного.
Средний уровень эозинофилов в назальном секрете у больных ПАР был в 4,6 раз выше, чем у пациентов с ХИР. Однако, не было найдено зависимости между количеством содержания эозинофилов и уровнем ЕСР в назальном секрете. Это говорит о том, что эозинофилы в назальном секрете могут находиться в неактивном состоянии и не участвовать в аллергическом воспалении.
Таким образом, определение уровня ЕСП в назальном секрете представляет собой высокочувствительный метод, характеризующий активную фазу аллергического воспаления, который можно использовать как количественный параметр оценки тяжести течения ПАР. Единственным недостатком этого метода является его высокая стоимость.
Список литературы
1. Хмельницкая Н.М., Рязанцев С.В., Кляч-ко Л.Л. и др. Методы изучения и исследования экзокринных секретов для изучения некоторых параметров местного иммунитета // Клинич. лаб. диагностика. — 1997. — № 12. — С. 43-44.
2. Balfor-Linn I. Quantitative evaluation of nasal mucosa proteins // Clin. Exp. Allergy. — 1999. — VOl. 29, N 5. - P. 719-720.
471
Мокроносова М.А. и др.
Медицинская Иммунология
3. Bernardini R., Novembre E., Mugnaini L., Rossi M.E., Vierucci A. Eosinophil cationic protein and tryptase in the nasal lavage fluid of children with grass-pollen rhinitis: levocabastine effect // Allergy Asthma Proc. — 1998. — Vol. 19, N 2. — P 75-80.
4. Bousquet J., Vignola AM., Campbell AM., Michel FB. Pathophysiology of allergic rhinitis // Int. Arch. Allergy Immunol. - 1996. - Vol. 110. - P. 207-218.
5. Durham S.R. Mechanisms of mucosal inflammation in the nose and lungs // Clin. Exp. Allergy. — 1998. - Vol. 28, N 2. - P. 11-16.
6. Frischer T., Baraldi E. Upper airway sampling // Am. J. Respir. Crit. Care. - 2000. - Vol. 162, N 2. -P. 28-30.
7. Frischer T., Halmerbauer G., Gartner C., Rath R., Tauber E., Schierl M., Koller D.Y., Urbanek R., Forster J., Kuhr J. Eosinophil-derived proteins in nasal lavage fluid of neonates of allergic patients and the development of respiratory symptoms during the first 6 months of life // Allergy. - 2000. - Vol. 55, N 8. -P. 773-777.
8. Garrelds I., De Graaf-in‘t Veld T., Nahori M., Vargaftig B.B., Gerth van Wijk R., Zijlstra FJ. Interleukin-5 and eosinophil cationic protein in nasal lavages of rhinitis patients // Eur. J. Pharmacol. -1995. - Vol. 275, N 3. - P. 295-300.
9. Jankowski R., Persoons M., Foliguet B., Cof-finet L., Thomas C., Verient-Montaut B. Eosinophil count in nasal secretions with and without nasal symptoms // Rhinology. - 2000. - Vol. 38, N 1. -P. 23-32.
10. Jean R., Delakourt C., Rufin P., Pfister A., Waernessyckle S., de Blic J., Scheinmann P. Nasal cytology in rhinitis children: comparison between brushing and blowing the nose // Allergy. - 1997. -Vol. 51, N 12. - P. 932-934.
11. Juniper E.F., Guyatt G.H., Dolvich J. Assessment of quality of life in adolescents with allergic rhino-conjunctivitis: development and testing of a questionnaire for clinical trials // J. Allergy Clin. Immunol. -1994. - Vol. 93. - P. 413-423.
12. Klimek L., Rasp G. Norm values for eosinophil cationic protein in nasal secretions: influence of specimen collection // Clin. Exp. Allergy. - 1999. - Vol. 29, N 3. - P 367-374.
13. Lee H.S., Majima Y., Sakakura Y, Shino-gi J., Kawaguchi S., Kim B.W Quantitative cytology of nasal secretions under various conditions // Laryngoscope. - 1993. - Vol. 103, N 5. -P. 533-537.
14. Lonnkvist K., Moshfegh A., Pedroletti C., Hedlin G., Hallden G., Lundahl J. Increased eosinophil trasmigration after nasal allergen challenge in children with allergic asthma and rhinitis // Allergy. - 2002. - Vol. 57. - P 1200-1204.
15. Marccuci F., Sensi L.G., Migali E., Coniglio G. Eosinophil cationic protein and specific IgE in serum and nasal mucosa of patients with grass-pollen allergic rhinitis and asthma // Allergy. - 2001. - Vol. 56, N 3. - P 231-236.
16. Rasp G., Thomas P, Bujia J. Eosinophil inflammation of the nasal mucosa in allergic and nonallergic rhinitis measured by eosinophil cationic protein levels in native nasal fluid and serum // Clin. Exp. Allergy. - 1994. - Vol. 24, N 12. -P 1151-1156.
17. Shinogi J., Majima Y, Takeuchi K., Harada T., Sakakura Y. Quantitative cytology of nasal secretions with perennial allergic rhinitis in children: comparison of infected and noninfected conditions // Laryngoscope. - 1998. - Vol. 108, N 5. - P. 703-705.
18. Togias A.G. Systemic immunologic and inflammatory aspects of allergic rhinitis // J. Allergy Clin. Immunol. - 2000. - Vol. 106. - P 247-250.
19. Wang D., Clement P, Smitz J., de Waele M., Derde M.P Monitoring nasal allergic inflammation by measuring the concentration of eosinophil cationic protein and eosinophils in nasal secretions // Allergy. -1995. - Vol. 50, N 2. - P 147-151.
20. Wang D., Yeoh K. The significance and technical aspects of quantitative measurements of inflammatory mediators in allergic rhinitis // Asian. Pac. J. Allergy Immunol. - 1999. - Vol. 17, N 3. -P. 219-228.
21. Wilson S.J., Lau L., Howarth PH. Inflammatory mediators in naturally occurring rhinitis // Clin. Exp. Allergy. - 1998. - Vol. 28. - P 220-227.
поступила в редакции 24.11.2006 принята к печати 30.01.2007
472
