CC BY
67
НОВЫЕ МЕТОДЫ
УДК 577.113/212.213.7:612.112.3:57.084
А.Н. Дударев, Е.Н. Антипова, Г.А. Коваленко, И.Ф. Усынин ЭНДОДНКАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Внутрибрюшинное введение 4% крахмала усиливает миграцию макрофагов в брюшную полость и повышает активность в них щелочных, нейтральных и кислых эндоДНКаз. В процессе инкубации макрофагов in vitro последние секретируют фермент в культуральную среду, что приводит к повышению активности в ней всех изоформ эндоДНКаз. Активность кислых эндоДНКаз была в 50 раз выше, чем щелочных и нейтральных. Высокое содержание белка в инкубационной среде и повышенное содержание его в супернатанте макрофагов указывает на возможное усиление его синтеза в ответ на стимуляцию клеток крахмалом.
Ключевые слова: эндоДНКаза щелочная, нейтральная, кислая; перитонеальные макрофаги, плазмиды pG-7, суперскрученная и кольцевая ДНК
Макрофаги являются полифункциональными клетками. В организме они отвечают за клиренс чужеродных соединений, принимают участие в реакциях воспаления, иммунного ответа, противоопухолевой защиты и т.д. [1-5]. Ключевую роль макрофаги играют в синтезе белков острой фазы. Считается, что последние способствуют при действии на организм повреждающих факторов восстановлению гомеостаза [6-8]. В механизмах неспецифической противоинфекционной защиты важное место принадлежит нуклеазам. Секретируемые макрофагами во внеклеточную среду организма, эти ферменты не только обеспечивают элиминацию чужеродного, но и ставшего таковым собственного генетического материала. Актуальным является участие нуклеаз в процессах апоптоза [9-10]. Адаптивный синтез нуклеаз индуцируется вирусными, бактериальными и паразитарными возбудителями инфекций, а также чужеродной гетерогенной ДНК неинфекционной природы [11-12].
В связи с выше изложенным нами исследована культура активированных крахмалом перитонеальных макрофагов. Целью исследования было оценить секрецию макрофагами кислых, нейтральных и щелочных эндоДНКаз, обеспечивающих неспецифическую гуморальную защиту в норме в ответ на действие неспецифического раздражителя. Поставленная задача представляется вполне актуальной.
Материалы и методы
В работе использовали самцов белых беспородных мышей 3-4-месячного возраста. Для получения перитонеальных макрофагов внутрибрюшин-но вводили по 1,0 мл 4% сваренного крахмала. На
5-е сутки проводили дислокацию спинного мозга в шейном отделе, а затем декапитацию. Далее через пах шприцем вводили в брюшную полость 10 мл среды следующего состава: 5% среды RPMI 1640 с глютамином (75 мг на 250 мл), Hepes (конечная концентрация 20 мМ), ампицилин 100 мг/л, гепарин 5 ед. на 10 мл среды [13]. Объединенный лаваж (жидкость, взятая из брюшины 7 мышей) разливали строго равномерно по чашкам Петри (Д-60, все процедуры проводили в ледяной бане и по возможности стерильно) и помещали в С02-ин-кубатор для адгезии клеток. После адгезии клеток культуральную среду сливали, клетки тщательно и осторожно промывали раствором Хенкса (3-4 раза), затем контрольные чашки красили 1-2% раствором трипанового синего, выдерживали 2-3 минуты и смотрели под микроскопом. Все клетки были жизнеспособными. В опытные чашки с адгезированными макрофагами приливали по 4,5 мл инкубационной среды и помещали в С02-ин-кубатор при 37 °С на 3,6,21 и 24 часа. Для каждой временной точки имелся контроль для оценки жизнеспособности клеток. Инкубационную среду из опытных чашек сливали в пробирки Eppendorf, добавляли PMSF (фенилметилсульфонилфто-рид — ингибитор протеаз) в концентрации 1 мМ, тщательно и осторожно удаляли остатки культуральной жидкости, отмывали раствором Хенкса, тщательно удаляли остатки раствора, приливали 1 мл деионизованной стерильной воды, 100 мкл 1% Тритона, 10 мкл 0,1 М PMSF, выдерживали 15 минут на льду, разрушенные клетки тщательно переносили в стеклянный гомогенизатор, гомогенизировали во льду 5-7 мин. и переносили в пробирки Eppendorf, центрифугировали 10 мин.
прм 12 тыс. об./мин. Супернатант макрофагов и культуральную жидкость хранили при -20 °С. В супернатанте макрофагов и в ранее слитой культуральной жидкости определяли эндоДНКазную активность при pH 8,3; 7,2; 5,0. Пробы для определения эндоДНКазной активности при pH 5,0 раз-водили в 50 раз. В качестве субстрата для определения эндоДНКазной активности использовали ДНК плазмиды pGEM-7. Выращивание бактерий и амплификацию плазмидной ДНК проводили согласно Маниатису и др. [14]. Выделение плаз-мндной ДНК из бактерий, очистку хлористым литием (LiCI), затем очистку на силикогеле проводили по методу Бирнбойма [15]. Полученную плазмидную ДНК инкубировали с рестрнктазой Xba 1 до полного превращения суперскрученной ДНК в линейную. Линейную форму плазмидной ДНК в дальнейшем использовали в качестве контроля при электрофорезе в 0,8% агарозном геле. Плазмидную ДНК хранили при -20 °С и использовали в качестве субстрата для определения эндоДНКазной активности. Последнюю определяли по методу Лебедевой и др. [16]. Реакционную смесь, полученную после гидролиза ДН К плазмиды эидоДНКазой, содержащую суперскрученную и кольцевую ДНК, разделяли в 0,8% агарозном геле, сканировали и проводили компьютерный анализ результатов по программе Scion Image. Показателем эндоДНКазной активности проб служила степень перехода суперскрученной формы плазмидной ДНК в кольцевую, выраженная в процентах [16].
Результаты и обсуждение
Парис. 1 отражена активность Mg2‘-зависимой эндоДНКазы в супернатанте перитонеальных макрофагов при pH 8,3; 7,2; 5,0. Контроль — исходное соотношение суперскрученной и кольцевой ДНК плазмиды, которая инкубировалась в тех же условиях, что и опытные пробы. Активность фермента определялась сразу после взятия и адгезии клеток. Она соответствует активности фермента в макрофагах после стимуляции их крахмалом in vivo. Она оказалась самой высокой. Через 3 часа инкубации активность фермента была намного ниже и сохранялась на этом уровне на протяжении 24 часов инкубации. Жизнеспособность клеток в процессе инкубации не изменялась. Более того, через 24 часа активность эндоДНКазы несколько увеличивалась по сравнению с 3, 6 и 21 часами инкубации. Необходимо отметить, что активность кислой эндоДНКазы значительно выше, чем нейтральной и щелочной и говорит об ее лизосомальном происхождении. Высокая активность эндоДНКаз в инкубационной среде свидетельствует о том, что макрофаг не только активно синтезируют данный фермент, но и в
значительной степени секретируют его в окружа ющую среду (Рис. 2).
Таким образом, изолированные перитонеаль ные макрофаги сохраняли способность синтези ровать эндоДНКазу при всех значениях pH н; протяжении 24 часов инкубации и секретировап фермент в окружающую среду. Так как опреде ление кислых эндоДНКаз как в супернатант« макрофагов, так и в культуральной жидкосп проводилось при разведении в 50 раз, можно ут верждать, что активность кислых эндоДНКа: намного выше, чем щелочных и нейтральных Предложенная модель для оценки синтеза и про дукцин ДНКаз перитонеальными макрофагам! В условиях ИХ стимуляции может быть ОЧСН1 эффективной. Все клетки в процессе инкубашн были в хорошем состоянии и сохраняли свок жизнеспособность не менее 24 часов, на это ука зывает и определение общего белка (Рис.З). Сраз\ после выделения и адгезии макрофагов содержание белка в супернатанте не превышало 2 мг/мл
Контроль 0 3 6
Время инкубации (час)
* - достоверное отличие по сравнению с контролем ( р < 0,001 ) контроль - термостатированная ДНК плазмиды рв - 7 Рис. 1. Активность Л/#-’*-зависимой эндоДНКазы в макрофагах при инкубации их в течение 24 часов.
По оси абсцисс отложено время инкубации, по оси ординат —% перехода суперскрученной ДНК в кольцевую
Контроль
Время инкубации (час) * - достоверное отличие по сравнению с контролем ( р < 0,001 ) контроль - термостатированная ДНК плазмиды рв - 7 Рис. 2. Активность М£'-зависимой эндоДНКазы в инкубационной среде.
Условные обозначения те же. что и на рис. 1
1 -
О i--------1-------г--------1-------1--------р
О 3 6 21 24
Время инкубации МФ (часы )
* -достоверное отличие по сравнению с контролем (р <0,01) Рис. 3. Количество белка в макрофагах и культуральной среде в динамике инкубации.
Условные обозначения те же, что и на рис. 1
но уже через 3 часа инкубации количество белка в супернатанте достоверно увеличивалось и уже практически не изменялось до конца инкубации. Максимальная секреция белка в среду инкубации отмечалась сразу после адгезии клеток. Через 21 час инкубации содержание белка незначительно повышалось по сравнению с 3-м и 6-м часами инкубации.
Таким образом, секреция эндоДНКаз является одним из инструментов неспецифической резистентности, обеспечивающих гуморальную защиту организма при действии на него повреждающих факторов. В этом механизме важную роль играют не только перитонеальные макрофаги и купферовские клетки, но, вероятно, любые резидентные макрофаги, независимо от работы остального баланса органов и клеточных систем, активно участвующие в механизме неспецифической гуморальной защиты внутренней среды организма, т.е. в поддержании его гомеостаза.
PERITONEAL MACROPHAGES ARE PRODUCER OF ENDODNASE
A.N. Dudarev, E.N. Antipova, G.A. Kovalenko,
I.F. Usynin
Intraperitoneal introduction of 4% starch increases the migration of macrophages to abdominal cavity and raises activity of alkaline, neutral and acid endoDNAases in them. During the incubation of macrophages in vitro the last produce an enzyme in culture medium that results in increase of activity of all endoDNAase isoformst. Activity of acid endoDNAases was 50 times higher, than alkaline and neutral. The high content of protein in the culture medium and in supernatant of macrophages points to possible increased protein biosynthesis in reply to stimulation of cells by starch.
Литература
1.Kapp Ян Макрофаги/Ян Карр. — М., 1978.— 167 с.
2. Cytokine production of CD8 + immune T cells, but not of CD4 + T cells from Toxoplasma gondii — infected mice is polarized to a type 1 a response following stimulation with tachyzoite-infected macrophages / R. Miller, X. Wen, B. Dunford, et. al. //J. Interferon Cytokine Res.
- 2006. - Vol .26 — №11. — C. 787-792.
3. Medzhitov, R. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity / R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, CaJr.Janeway //Nature. - 1997. - Vol. 388. - №6640. - P. 394-397.
4. Hein, H. Toll-like receptors and their function in innate and adaptive immunity / H. Heine, E Lien // Immunol. - 2003. - Vol. 130. - №3. - P. 180-192.
5. Werling D. Toll-like receptors linking innate and adaptive immune response / D. Werling, T.W. Jungi // Vet. Immunol. Immunopathoi. — 2003. — Vol. 91. — №1.
- P. 1-12.
6. Raynes, G. The acute phase response / G. Raynes // Biochem. Ses. Trans. — 1994. — Vol. 22. — №1. — P. 69-73.
7. Heinrich P.C. Interleukin-6 and the acute phase response / P.C. Heinrich, J.V. Castell, T. Andus // Biochim. J. - 1990. - Vol. 265. - P. 621-636.
8. Мирошников B.M. Острофазовый белок зоны беременности в диагностической оценке термических поражений кожи / В. М. Мирошников // Вопросы мед. химии — 1989. — № 3. — С. 108-117.
9. Widlak P. The DFF40/ CAD endonuclease and its role in apoptosis / P. Widlak // Acta Biochim. Pol. — 2000.
- Vol. 47. - №4. - P. 1037-1044.
10. Widlak P. Ionik and cofactor requirements for the activity of the apoptosis endonuclease DFF40/CAD / P. Widlak , W.T. Garrard // Mol. Cell. Biochim. - 2001.
- Vol. 218 - №1-2 - P. 125-130.
И. Коваленко Г.А. Индукция ДНКазной активности в сыворотке крови как механизм резистентности к инфекциям в организме человека и животного / Г.А. Коваленко // Вестник Российской Академии Медицинских наук. — 2001 — №2 — С. 25-28.
12. Kovalenko G.A. Correlation between deoxyribonuclease activity in mink serum and resistance to Aleutian disease / G.A. Kovalenko // Scientifur. — 1994 — Vol. 18
- №2 — P. 131-134.
13. Гольдберг Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.П. Шахов.
- Томск, 1992 — 272 с.
14. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сембрук. — 1984. — С. 89-101.
15. Bimboin Н.С. Rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNK / H.C. Birnboin, J. Doly // Nucl. Acid. Res. — 1979. — Vol. 7. — №6. — P. 1513-1522.
16. Лебедева Л.Г. Характеристика ядерных эндо-ДНКаз печени крыс по молекулярной массе и катионной зависимости / Л.Г Лебедева, С.С. Александрова, А.Г. Баснакьян и др. // Биохимия. — 1995. — Т. 60.
- Вып. 5 - С. 798-804.
ВЫШЛИ В СВЕТ МОНОГРАФИИ АКАДЕМИКА Л.Е. ПАНИНА
Панин Л.Е., Усенко Г.А. Тревожность, адаптация и донозологическая диспансеризация. — Новосибирск: СО РАМН, 2004. — 316 с.
В монографии представлен обзор литературы и результаты собственных многолетних исследований в области психофизиологии, связи уровня психоэмоционального напряжения (тревожности) с уровнем напряжения адаптивных процессов в здоровом организме, его резистентности к комплексному воздействию социальных (летный труд) и климатогеографических стресс-факторов. Впервые показано наличие существенных адаптивных сдвигов у высокотревожных летчиков в период активного Солнца и дни магнитных бурь, связь этих сдвигов с заболеваемостью, дисквалификацией по состоянию здоровья и аварийностью. Разработаны пути коррекции отрицательных последствий высокотревожной реактивности. Обосновывается теоретическая и практическая значимость использования тревожностной типологии личности для изучения особенностей адаптивных сдвигов в здоровом организме в условиях стресса и с целью донозологической профилактической диспансеризации.
Панин Л.Е. Детерминантные системы в физике, химии, биологии. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2006. — 202 с.
В монографии рассматриваются новые подходы к системному анализу природных явлении в физике, химии и биологии. Заложены основы теории детерминантных систем, которые позволяют раскрыть механизм реализации фундаментального принципа естествознания — принципа детерминизма. Эволюция материального мира представлена как неизбежный и непрерывный процесс увеличения упорядоченности (негэнтропии) на основе перехода от одного типа детерминантных систем к другому. Показано, что процесс увеличения негэнтропии тесно связан с непрерывным накоплением информации, которая и определяет природное разнообразие в физике, химии и биологии. Монография может быть использована в качестве учебного пособия при подготовке студентов, аспирантов, преподавателей различного профиля для формирования научного мировоззрения. Она также может быть полезна для широкого круга просвещенного читателя, интересующегося проблемами эволюции материального мира.
Более подробную информацию, в том числе по вопросам приобретения монографий, можно получить в научной части института.
Телефон (383) 332-56-58, электронный адрес [email protected].
