CC BY
43
УДК:612.014.467/.112.3:612. 084:599.323.4:616 - 021.4
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЙ МЫШЕЙ ПРИ АСЕПТИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ
Светлана Михайловна МИРОШНИЧЕНКО1, Галина Андреевна КОВАЛЕНКО1, Галина Сергеевна РУССКИХ1, Ольга Николаевна ПОТЕРЯЕВА12, Лев Евгеньевич ПАНИН |1
1 ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
С целью выявления генетически детерминированных морфологических и функциональных особенностей пери-тонеальных макрофагов мышей линии A/Sn и Balb/c, в разной степени предрасположенных к онкопатологии и различающихся по чувствительности к Mycobacterium tuberculosis, выполнен сравнительный анализ изменения хемотаксиса, адгезии и реорганизации актинового цитоскелета по F-актину, а также активности матриксных металлопротеаз-2,7 (ММП) макрофагов этих линий с показателями условно нормальных макрофагов белых беспородных мышей в ответ на асептическое воспаление. Отмечено уменьшение хемотаксиса макрофагов мышей линии A/Sn и Balb/c соответственно в 3 и 1,6 раза по сравнению с клетками белых беспородных мышей. Адгезия макрофагов мышей линии A/Sn к субстрату в 1,6 раза меньше, чем клеток животных двух других видов. При культивировании макрофагов мышей всех линий в течение 7 суток в них повышается активность ММП, и динамика роста величины данного показателя коррелирует с морфологическими характеристиками клеток (адгезия, распластывание, образование монослоя и контактное ингибирование). Исходная активность ММП макрофагов снижена у мышей линии A/Sn и повышена у мышей линии Balb/c по сравнению с активностью фермента макрофагов белых беспородных мышей.
Ключевые слова: асептическое воспаление, макрофаги, хемотаксис, адгезия, активность матриксных ме-таллопротеиназ, F-актин.
Важным этапом в иммунном ответе организма является миграция моноцитов/макрофагов в очаг повреждения. Неправильная регуляция миграции является причиной многих патологических состояний, включая злокачественные новообразования [7]. Динамические перестройки актиново-го цитоскелета клеток сопровождают процессы миграции, адгезии, фагоцитоза, экспрессии генов [11, 12]. Для быстрого реагирования на миграционный сигнал макрофаги экспрессируют специфический набор белков цитоскелета и адгезии, образуют короткоживущие точечные контакты с субстратом, фокальные комплексы, подосомы [10]. Трансмиграция клеток в воспалительный
очаг организма идет через эндотелиальные стенки, базальные мембраны и требует регулируемого протеолиза внеклеточного матрикса системой матриксных металлопротеаз (ММП).
Линейные животные часто имеют генетически закрепленные особенности иммунного реагирования, развивая преимущественно гуморальный или клеточный ответ на антиген. Мыши линий A/Sn и Balb/c относятся к иммуносупрес-сивным типам [2]. Первые характеризуются высокой частотой спонтанных новообразований, но устойчивы к Mycobacterium tuberculosis [3, 6]. Линию мышей Balb/c традиционно считают не раковой и часто используют в долгосрочных ис-
Мирошниченко С.М. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий, e-mail: [email protected]
Коваленко Г.А. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий, e-mail: [email protected]
Русских Г.С. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: Russkich_@ soramn.ru
Потеряева О.Н. - д.м.н., проф. кафедры медицинской химии, e-mail: [email protected] \Панин Л.Е. \ - академик РАМН, директор
следованиях, однако спонтанные опухоли развиваются у них в 20-30 % случаев, животные чувствительны к различным штаммам микобактерий [8]. Белые беспородные мыши (б/б) не имеют генетически закрепленных дефектов и считаются условно здоровыми. В возрасте двух месяцев животные всех трех видов еще не проявляют патологических изменений. Исследования макрофагов на этом этапе помогают увидеть генетически детерминированные дефекты клеток и понять причины, способствующие возникновению тех или иных отклонений.
Цель исследования - выявить генетически детерминированные морфологические и функциональные особенности перитонеальных макрофагов мышей линии A/Sn и Balb/c, в разной степени предрасположенных к онкопатологии и различающихся по чувствительности к Mycobacterium tuberculosis, сравнив хемотаксис, адгезию и реорганизацию актинового цитоскелета по F-актину, а также активность ММП макрофагов животных этих линий с показателями условно нормальных макрофагов белых беспородных мышей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали самцов белых беспородных мышей (контрольная группа) и мышей линии A/Sn и BALB/c в возрасте 2-3 мес. из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). В трех независимых экспериментах использовали по 4 мыши в каждой группе. Перитонеальные макрофаги получали по стандартной методике. Через 4 суток после введения крахмала животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом [1]. Аликвоты ла-важа окрашивали трипановым синим, количество живых и погибших клеток подсчитывали в камере Горяева. Индивидуально от каждой мыши клетки в одинаковом количестве высаживали по 2,4 млн на чашку Петри, после двух часов адгезии инкубационную среду заменяли на свежую и оставляли в СО2-инкубаторе на 0 ч, 72 ч и 7 суток. В ходе эксперимента для цитохимических исследований в чашки Петри вносили покровные стекла для адгезии клеток. Во все временные точки препараты клеток окрашивали по Романовскому - Гимзе (считали в 10 световых полях микроскопа). Для окраски на F-актин цитоскелета макрофагов стекла фиксировали в 2%-м растворе параформальде-гида, окрашивали родамин-фаллоидином 1:100. Сканировали и фотографировали стекла в центре коллективного пользования Института цитологии и генетики СО РАН на микроскопе Ах^Кор2р1ш (Zeiss, Германия).
Суммарную активность ММП-2,7 в гомоге-нате макрофагов оценивали методом спектро-флуориметрии, используя синтетический субстрат метилкумариламид (MCA, Calbiochem, Германия). Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре RF-5301 PC (Shi-madzu, Япония) при длине волны возбуждения 325 нм и эмиссии 393 нм. Активность ферментов выражали в мкмоль МСА/(лхч) [5].
При проведении статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (т), результаты представляли в виде M ± т. Различия между группами оценивали с использованием ¿-критерия Стъю-дента и считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В норме хемотаксис лежит в основе направленного движения клеток, которое обеспечивают белки цитоскелета клетки, адгезионные молекулы и металлопротеазы. После стимуляции крахмалом содержание макрофагов в перитоне-альном экссудате мышей линии A/Sn составляло (0,50 ± 0,04)х106/мл, BALB/c - (0,7 ± 0,44)х106/мл, б/б (контроль) - (1,6 ± 0,54) х 106/мл. Таким образом, по сравнению с хемотаксисом моноцитов в перитонеальную полость контрольных мышей величина данного показателя животных линии A/Sn снижена в 3 раза (р < 0,001), линии BALB/c - в 1,6 раза (р < 0,05).
Макрофаги в одинаковом количестве высаживались в чашки Петри для адгезии на покровных стеклах. Перитонеальные макрофаги мышей BALB/c и б/б были полностью адгезированы, в супернатанте присутствовало незначительное количество погибших клеток, окрашиваемых три-пановым синим. Адгезированных клеток у животных линии A/Sn было в 1,6 раза меньше, чем у мышей BALB/c и белых беспородных (p < 0,05). Супернатант мышей A/Sn содержал конгломераты слипшихся клеток, среди погибших макрофагов были клетки, имевшие вид живых при прижизненной окраске акридиновым оранжевым и окрашиваемых также на F-актин цитоскелета клетки. Это дает основание думать, что у макрофагов мышей A/Sn имеются нарушения в экспрессии молекул адгезии, что могло повлиять как на миграцию, так и на адгезию клеток.
При окраске клеток на F-актин было выявлено, что макрофаги б/б мышей из суспензионного состояния переходят к адгезированному, образуя филоподии и актин-богатые точки контакта с субстратом. Эти клетки слегка поляризованы, распластаны, актин ярко выражен (рис. 1, а). Из-
Рис. 1. Перитонеальные макрофаги мышей при культивировании в течение 7 суток. а—и: окраска актино-вых структурродамин-фаллоидином, флуоресцентная микроскопия, объектив х 100, увеличение х1000; к—м: окраска по Романовскому—Гимзе, объектив х40, увеличение х400. а — б/б, 0 ч, клетки имеют актин-богатые контакты с субстратом; б—A/Sn, 0 ч, округлые клетки, рыхлая структура актина; в — Balb/c, 0 ч, хорошо адгезированные клетки, актин выражен, вакуолизация цитоплазмы; г — б/б, 72 ч, плотный монослой, выражены контакты с субстратом и межклеточные контакты; д — A/Sn, 72 ч, клетки распластаны, актин-богатые контакты с субстратом; е — Balb/c, 72 ч, разряженный монослой, клетки имеют удлиненную мезенхимную форму, ж — б/б, 7 сут, разряженный монослой, хорошо выраженные межклеточные контакты, филоподии; з — A/Sn, 7 сут, гигантская многоядерная клетка, актин-богатые контакты с субстратом на лидирующем крае; и — Balb/c, 7 сут, более плотный монослой округлых клеток; к — б/б, 7 сут, разряженный монослой, часть клеток имеет пикнотичные ядра; л — A/Sn, 7 сут, плотный монослой клеток разного диаметра, многоядерные клетки, апоптозных клеток нет; м — Balb/c, 7 сут, монослой одинаковых клеток, апоптозных клеток нет
вестно, что клетки образуют филоподии, складки клеточного края, различные выпячивания цитоплазмы для улучшения контакта с субстратом и другими клетками [7]. У мышей линии А/8п выявлены нарушения в реорганизации актинового цитоскелета на начальных этапах адгезии клеток на субстрат: макрофаги недостаточно распластаны, клетки не проявляют поляризации и просто округлые, структура актина выявляется нечетко (см. рис. 1, б). При этом макрофаги мышей ВАЬВ/с быстро распластываются на покровных стеклах (уже через 1 ч они были адгезированы), клетки поляризованы, актин выражен, но отмечена вакуолизация цитоплазмы (см. рис. 1, в).
Миграция клеток сопровождается реорганизацией актинового цитоскелета, взаимодействием с внеклеточным матриксом и его протеолизом. Для осуществления деградации матрикса макрофаги секретируют целый ряд металлопротеаз [13]. Нами показано, что гомогенат макрофагов в точке «0 ч» (сразу после адгезии) обладает высокой активностью ММП, и активность ферментов макрофагов мышей ВАЬВ/с в 1,5 раза выше, чем в контроле (р < 0,05) (рис. 2) (при этом исходное количество клеток в гомогенате макрофагов ВАЬВ/с и б/б было одинаковым). Активность ММП макрофагов мышей А/8п в 2 раза ниже, чем в контроле (р < 0,001) (при этом количество адге-зированных клеток было в 1,6 раза меньше). Активность ММП возрастала на 3-и сутки культивирования макрофагов у всех животных: в клетках мышей б/б, ВАЬВ/с и А/8п она увеличивалась на 63, 40 и 60 % соответственно (р < 0,05 относительно точки «0 ч»). Активность ММП макрофагов контрольной группы мышей приближалась к таковой у ВАЬВ/с (см. рис. 2). На 7-е сутки культивирования прирост активности металлопротеаз амедлился в макрофагах мышей б/б и ВАЬВ/с до 15 и 20 % соответственно, но у мышей А/8п динамика повышения величины показателя сохранялась и составляла 40 % по отношению к предыдущему сроку (см. рис. 2).
Разница в приросте активности ММП коррелировала с морфологией макрофагов. В процессе культивирования клеток идет их адгезия, распластывание клеток, образование монослоя, затем наступает контактное ингибирование роста и старение культуры. Макрофаги б/б мышей демонстрировали именно такое развитие. На 3-и сутки макрофаги контрольной группы были хорошо распластаны и образовывали плотный монослой (см. рис. 1, г), в то же время наблюдали максимальный прирост активности ММП. На 7-е сутки клетки имели меньший размер, лежали отдельно друг от друга (разряженный монослой), имели микровыросты цитоплазмы, филоподии,
§ 1200-1
§-рюоо-
II
н
¡а ?
800600400200-
0 ч 3 сут 7 сут
Время инкубации
Б/б Ва1Ъ/с
Аэп
Рис. 2. Активность матриксных металлопротеиназ в макрофагах мышей линии Л^п и Ва1Ь/с при инкубации клеток в течение 0 ч (сразу после адгезии), 72 ч, 7 сут
с помощью которых макрофаги контактировали друг с другом, также встречались клетки, имевшие апоптозный вид (см. рис. 1, ж, к), прирост активности ферментов значительно замедлился.
Макрофаги животных линии А/8п медленнее распластывались на покровных стеклах по сравнению с клетками мышей ВАЬВ/с и б/б, но на 3-и сутки имели морфологию хорошо адгезиро-ванных и распластанных клеток, фокальные контакты выражены (рис. 1, д). В этот срок наблюдали наибольший прирост активности ММП. На 7-е сутки монослой состоял из морфологически разнородных клеток. Среди обычных макрофагов диаметром 18-25 мм встречались 2-3-ядерные клетки диаметром 50-100 мкм, а также клетки в стадии митоза (см. рис. 1, з, л). Известно, что образование многоядерных клеток не только является компенсаторным процессом, но и свидетельствует о развитии хронического воспаления. Склонность к хроническому течению воспаления является одним из факторов онкологического риска. Изначально незначительное количество макрофагов сформировало монослой за счет митотических делений клеток. Пролиферация в очаге воспаления сопряжена с мутагенезом под действием высокоактивных провоспалительных медиаторов [15]. Активность ММП продолжала увеличиваться вплоть до 7 сут, и ее прирост в 2,5 раза превышал контрольное значение. Известно, что экспрессия ММП сходна с экспрессией белков острой фазы воспаления, регулируется про-воспалительными цитокинами и усиливается при росте опухоли [4], возможно, этим объясняется известная чувствительность мышей А/8п к онко-патологии.
Макрофаги мышей ВАЬВ/с быстро распластывались на субстрате, но на 3-и сутки плотного монослоя еще не образовывали, прирост
активности ММП был ниже контроля. Старение культуры макрофагов данной линии наблюдалось позже 7 сут (см. рис. 1, и, м).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в данной работе выявлены видовые различия в морфологии макрофагов и синтезе ими ММП. Макрофаги мышей A/Sn отличались наибольшим количеством морфологических и функциональных нарушений: снижены хемотаксис, адгезия, реорганизация актиново-го цитоскелета, отмечалось также образование многоядерных клеток. Выявлен исходный низкий уровень активности ММП в ответ на асептическое воспаление и постоянный прирост активности ферментов в течение всего эксперимента. Имея такие нарушения, макрофаги не могут осуществлять противоопухолевый надзор, с одной стороны, и не обеспечивают достаточно условий для интернализации бактерий и успешного развития туберкулезной инфекции, с другой.
Исходная активность ММП макрофагов мышей BALB/c превышала активность ферментов контрольной группы. Возможно, повышенная активность ММП макрофагов в ответ на воспаление и способствует развитию туберкулезной инфекции. Из литературы известно о ключевой роли ММП в патогенезе туберкулеза [9].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры тканей в гематологии. Томск, 1992. 85-86.
2. Гольдберг Е.Д., Масная Н.В., Чурин А.А. Показатели иммунитета у мышей разных линий // Бюл. эксперим. биол. мед. 2005. 140. (8). 189-191.
3. Нестеренко Л.Н., Капина Н.А., Алт А.С. Течение хламидиоза легких у мышей инбредных линий, отличающихся генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу // Молек. генетика микробиол. вирусол. 2010. (3). 12-16.
4. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеа-зы: строение, регуляция, роль в развитии патологи-
ческих состояний (обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. 2010. 5. http://ngmu.ru/cozo/ mos/article/text_full.php?id=449
5. Потеряева О.Н., Русских Г.С., Панин Л.Е. Анализ активности матриксных металлопротеиназ и а1-протеиназного ингибитора в сыворотке крови больных сахарным диабетом 2 типа // Бюл. экспе-рим. биол. мед. 2011. 152. (11). 509-511.
6. Харьковская Н.А., Краснова Т.А., Клепиков Н.Н. Онкологическая и генетическая характеристика мышей A/Sn // Эксперим. онкол. 2000. (3). 157-159.
7. Шутова М.С., Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания номальных и трансформированных фибробластов. Роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология. 2010. 52. (1). 41-45.
8. Castro A.P., Aquas A.B., Silva M.T. Adjuvant treatment increases the resistance to Mycobacterium avium infection of Mycobacteria-susceptible Balb/c // Clin. Exp. Immunol. 1993. 92. 466-472.
9. Cesar A. Ugarte-Gil Paul Elkington, Robert H. Gilman et all. Induced sputum MMP-1, -3 and -8 concentrations during treatment of tuberculosis // PLOS One. 2013. 8. (4). ID e61333.
10. Ciobanasu C., Faivre B., Le Clainche C. Actin dynamics associated with focal adhesions // Int. J. Cell Biol. 2012. ID 9412925.
11. Fazal F., Minhajuddin M., Bijli K.M. et al. Evidence for actin cytoskeleton-dependent and independent for RelA/p65 nuclear translocation in endothelial cells // J. Biol. Chem. 2007. 282. 39403950.
12. May R.C., Machesky L.M. Phagocytosis and actin cytoskeleton // J. Cell Sci. 2001. 114. 1061-1077.
13. Murray M.Y., Howe J.D., Birkland T.P. Macrophage migration and invasion is regulated by MMP10 expression // PLOS One. 2013. 8. (5). ID e163555.
14. Wang W., Goswami S., Sahai E. et al. Tumor cells caught in the act of invading: their strategy for enhanced cell motility // Trends Cell Biol. 2005. 15. (3). 138-145.
15. Yamanishi Y., Boyle D.L., Rosengren S. et al. Regional analysis of p53 mutations in rheumatoid arthritis sinovium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99. (5). 10025-10030.
MORPHOFUNCTIONAL PARAMETERS OF PERITONEAL MACROPHAGES OF DIFFERENT MICE STRAINS AT ASEPTIC INFLAMMATION
Svetlana Mikhailovna MIROSHNICHENKO1, Galina Andreevna KOVALENKO1,
Galina Sergeevna RUSSKIKH1, Olga Nikolaevna POTERYAEVA12, Lev Evgenyevich PANIN
1 Institute for Biochemistry of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
2 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasnyi av., 52
1
This paper reports a decrease in macrophage chemotaxis in response to aseptic inflammation (induced by starch introduction) of A/Sn mice by3 times and Balb/c lines by 1.6 times as compared to albino mice macrophages. Adhesion of A/Sn mice macrophages to the substrate is reduced by 1.6 times in comparison with two other species. Activity of matrix metalloproteinases 2.7 in macrophage homogenates was shown to be increased in all lines when macrophages were cultured for 7 days. In spite of this the dynamics of enzyme activity growth is in correlation morphological characteristics of the cells (adhesion, spreading, monolayer formation and contact inhibition). The initial activity of matrix metalloproteinases of macrophages to be decreased in A/Sn mice and increased in Balb/c mice as compared with the macrophages of albino mice.
Key words: aseptic inflammation, chemotaxis, adhesion activity of matrix metalloproteinases, F-actin.
Miroshnichenko S.M. - researcher of laboratory of molecular mechanisms of intercellular interactions, e-mail: [email protected]
Kovalenko G.A. - candidate of medical sciences, senior researcher of laboratory of molecular mechanisms of intercellular interactions, e-mail: [email protected]
Russkikh G.S. - candidate of medical sciences, senior researcher of laboratory of medical biotechnology, e-mail: [email protected]
Poteryaeva O.N. - doctor of medical sciences, professor of the general and bioorganic chemistry department, e-mail: [email protected]
\Panin LE. - doctor of medical sciences, academician of RAMS, director, e-mail: [email protected]
