CC BY
72
УДК 615.357.175.53/015.4:612.123:547.963.915/07
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-1 И ЕГО КОМПЛЕКСОВ С ТЕТРАГИДРОКОРТИЗОЛОМ С ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ ДНК
Лев Евгеньевич ПАНИН, Галина Андреевна КОВАЛЕНКО, Лев Михайлович ПОЛЯКОВ, Федор Васильевич ТУЗИКОВ, Наталья Александровна ТУЗИКОВА, Роман Александрович КНЯЗЕВ
ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Исследовалось влияние аполипопротеина А-1 на вторичную структуру прокариотической ДНК плазмиды рВ1ие8спр1 с использованием метода малоуглового рентгеновского рассеяния и электрофореза в геле агарозы. Показано, что переход суперскрученной формы плазмиды в кольцевую под действием аполипопротеина А-1 и его комплексов с тетрагидрокортизолом происходит за счет разрыва водородных связей между азотистыми основаниями комплементарных нитей ДНК. Изменение вторичной структуры ДНК плазмиды происходило и при инкубации ее с аполипопротеином А-1 без гормона. Обсуждается участие аполипопротеина А-1 в таких процессах метаболизма клетки, как репликация и транскрипция.
Ключевые слова: плазмида, суперскрученная, кольцевая ДНК, аполипопротеин А-1, тетрагидрокортизол, малоугловое рентгеновское рассеяние.
В настоящее время отношение исследователей к липопротеинам крови только как к транспортной форме липидов существенно изменилось. Оказалось, что они переносят большую группу липофильных соединений, выполняющих в организме разные функции, к которым следует отнести стероидные гормоны, токоферолы, ксенобиотики и т. д. [1]. В последнее время показано, что липопротеины переносят значительную часть дегидроэпиандростерона и его сульфатированной формы (ДЭА и ДЭАС) [2]. Нами обнаружено, что в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП) апобелком, связывающим стероидные гормоны, является аполипо-протеин А-1 (апоА-1) [3]. Оказалось, что данный белок присутствует в ядрах клеток различных органов и тканей. Особенно высоким его содержание было в транскрипционно активном хро-
матине и в ядерном матриксе. В этих же фракциях хроматина велика концентрация токоферола [4]. Кроме транспорта апоА-1 выполняет ряд регуляторных функций. Показано, что комплекс восстановленных форм стероидных гормонов с апоА-1 повышал скорость синтеза ДНК, РНК и белка в гепатоцитах, а также в клетках асцитной гепатомы и карциномы Эрлиха [5, 6]. Целью данной работы явилось изучение молекулярных механизмов взаимодействия изолированного аполипопротеина А-1, его комплексов со стероидными гормонами (тетрагидрокортизол) с про-кариотической ДНК.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Выделение липопротеинов из плазмы крови проводили методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах КВг на ультра-
Панин Л.Е. - академик РАМН, директор, e-mail:[email protected]
Коваленко Г.А. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий, e-mail: [email protected]
Поляков Л.М. - д.м.н., проф., руководитель лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: [email protected]
Тузиков Ф.В. - д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: [email protected]
Тузикова Н.А. - научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: [email protected]
Князев Р.А. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий, e-mail: [email protected]
центрифуге «Optima L-90 K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70.1 Ti [7]. Белковый компонент ЛПВП делипидировали охлажденной смесью хлороформа и метанола (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Хроматографию проводили на колонке с Сефарозой 6В CL (Pharmacia, Швеция) размером 1,6 х 100 см. Чистоту аполипопротеина А-I проверяли с помощью электрофореза в поли-акриламидном геле с додецилсульфатом натрия [8]. Концентрацию белка в пробах определяли по Лоури [9].
Комплексы тетрагидрокортизола (ТГК) с апоА-I получали, выдерживая их смесь (молярное соотношение 2:1) в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 5 мин при комнатной температуре. В качестве прокариотической ДНК использовали ДНК плазмиды pBluescript. Выращивание бактерий и амплификацию ДНК плазмиды проводили согласно Маниатису и др. [10]. Выделение ДНК из бактерий, очистку хлористым литием (LiCl) и очистку на силикагеле проводили по методу Бирнбойна [11]. Полученную ДНК хранили при -20 °С и использовали в качестве субстрата для определения специфической гидролитической активности белка. Последнюю оценивали по степени перехода суперскрученной формы плазмиды в кольцевую по методу Лебедевой и др. [12]. Активность выражали в процентах перехода суперскрученной формы ДНК в кольцевую. Часть выделенной плазмиды инкубировали с рестриктазой Sfr 274 до полного превращения суперскрученной ДНК в линейную. Последнюю в дальнейшем использовали в качестве дополнительного контроля при электрофорезе в геле агарозы.
Для оценки структурных изменений взаимодействия прокариотической ДНК и комплексов «апоА-I - ТГК» использовали метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) [13]. Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы «Siemens» (Германия), длина волны рентгеновского излучения А = 0,154 нм (CuA"a). Использовали гомогенные препараты апоА-I, комплексы кортизола и ТГК с апоА-I и ДНК с исходными концентрациями 0,40 и 3,12 мг/мл, соответственно. Малоугловые рентгенограммы получали в угловом диапазоне 0,0245 < h < 3,423 нм-1, где h = 4 х п х sin(9)/A; 29 - угол рассеяния.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее нами показано, что в ядрах соматических клеток различных органов и тканей присутствует апоА-I в достаточно большом ко-
8,3 ' 7,2 ' 5,0 pH инкубационной среды
:■:■: контроль ^ апоА-1
Рис. 1. Специфическая эндоДНКазная активность аполипопротеина А-I (* — достоверное отличие от контроля, p < 0,001; контроль — термостатированная ДНК плазмиды pBluetscript)
личестве. Например, в суммарном хроматине ядер клеток печени его содержание составляет 60 ± 4,5 нг/мг белка. Самое высокое содержание апоА-1 выявлено в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе (100 и 110 нг/мг белка соответственно) [4]. Возникает вопрос: может ли механизм активации эукариотической ДНК, описанный нами ранее [14, 15], работать на ДНК прокариотов, попадающих в клетки биологического хозяина? С этой целью мы исследовали гидролитическую активность апоА-1 на ДНК плазмиды рБ1ие8Спр1 Влияние апоА-1 на суперскрученную ДНК плазмиды оценивали при щелочном, нейтральном и кислом значении рН (8,3, 7,2 и 5,0, соответственно). Как следует из рис. 1, наиболее выраженный переход супер-скрученной формы ДНК в кольцевую отмечался при кислом и нейтральном значении рН. Это, по-видимому, связано с тем, что апоА-1 относится к слабокислым белкам и его изоэлектричес-кая точка сдвинута в кислую область. Вероятно, именно в этой области плазмидная ДНК более доступна для взаимодействия с апоА-1. Механизм трансформации суперскрученной ДНК в кольцевую не совсем ясен. Он может быть связан с разрывом водородных связей между парами азотистых оснований в комплементарных цепях ДНК, что ранее мы наблюдали в эукарио-тической ДНК. В таком случае эффект перехода должен усиливаться ТГК.
В связи с этим нами методом МУРР были проанализированы образцы исходной плазмиды и плазмиды после инкубации с апоА-1 в отсутствие и в присутствии гормона (ТГК). Из рис. 2
0,19 0,21 0,23 0,25 0,27 0,29 0,31 0,33 0,35 й, А-1
Рис. 2. Рентгенограммы МУРР от образца плазмиды рВ1ие(8спр( до и после инкубации его с апоА-1 и с комплексом «апоА-1 — ТГК» в течение 1 ч при 37 оС
видно, что при И ~ 0,27 Е-1 на рентгенограммах МУРР от препаратов нативной (контрольной) ДНК плазмиды наблюдается дифракционный максимум, а от инкубированной ДНК плазмиды с апоА-1 без гормона и в присутствии ТГК этот характерный дифракционный пик практически полностью исчезает. Таким образом, полученные методом МУРР результаты снова указывают на то, что при взаимодействии плазмиды с апоА-1 и с комплексом «апоА-1 - гормон» (ТГК) происходит изменение вторичной структуры ДНК. Как и в случае с эукариотической ДНК, в прокариотической ДНК также происходит разрыв водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образование однонитевых структур, что и вызывает переход суперскрученной формы ДНК в кольцевую. Также оказалось, что изменение вторичной структуры ДНК плазмиды в отличие от эу-кариотической ДНК не зависит от присутствия гормона (ТГК). Возможно, это объясняется тем, что в суперскрученной ДНК плазмиды в связи с избыточной внутренней энергией разрыв водородных связей, по-видимому, сразу происходит за счет гидрофобных взаимодействий. В таком случае присутствие гормона не является обязательным.
Но происходит ли при разрыве водородных связей ДНК плазмиды никирование одноцепо-чечной структуры под влиянием апоА-1? Из результатов электрофореза на рис. 3 видно, что в контрольных образцах (дорожки 1 и 2) наиболее интенсивную окраску имеет суперскрученная ДНК. После инкубации ее с апоА-1 наиболее интенсивно окрашена кольцевая ДНК (дорожки 3 и 4). В случае проявления эндоДНКазной активности у апоА-1 на электрофорезе должна частично или полностью исчезать кольцевая
Рис. 3. Электрофорез плазмиды pBluetscript в геле ага-розы после ее инкубирования с апоА-1 и с рес-триктазой Б/г274 I. Верхний ряд, дорожки: 1, 2 — контроль (термостатированная плазмида); 3, 4 — опыт (плазмида после инкубирования с апоА-1 в течение 1 ч); 5 — контроль (линейная форма плазмиды); 6, 7 — опыт (плазмида после инкубирования с апоА-1 и с рестриктазой Б/г274 I одновременно в течение 1 ч). Нижний ряд, дорожки: 1, 2 — контроль (плазми-да после термостатирования в течение 2 ч); 3, 4 — опыт (плазмида после инкубирования с апоА-1 в течение 2 ч); 5 — контроль (линейная форма плазмиды); 6, 7 — опыт (плазмида после инкубирования с апоА-1 в течение 1 ч и затем с рестриктазой Б/г274 I еще в течение 1 ч)
форма плазмиды и обнаруживаться полоса, соответствующая линейной ДНК, как это видно на дорожке 5, имеющей другую электрофорети-ческую подвижность. Такая полоса обнаруживается только после инкубации ДНК плазмиды одновременно с апоА-1 и рестриктазой Бй- 274 I (дорожки 6 и 7). При инкубации ДНК плазмиды с апоА-1 и с рестриктазой в течение двух часов был получен тот же результат, что и при инкубации в течение 1 ч (см. рис. 3, нижний ряд).
Результаты, полученные методами МУРР и электрофореза ДНК плазмиды в геле агаро-зы, показали, что после инкубации плазмиды с апоА-1 при разных значениях рН происходит изменение вторичной структуры ДНК за счет разрыва водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и за счет расплетания нитей ДНК. Переход суперскру-ченной структуры плазмиды в кольцевую в данном случае не происходит за счет разрыва фос-
фодиэфирных связей в одной из комплементарных нитей ДНК. Влияние апоА-I в комплексе с ТГК или без него в случае суперскрученной ДНК плазмиды приводит к разрыву водородных связей с образованием однонитевых структур. Об этом убедительно говорят результаты электрофореза ДНК плазмиды. Только после добавления в реакционную смесь рестриктазы Stf 274 вместе с апоА-I кольцевая и оставшаяся суперскрученная ДНК плазмиды полностью переходят в линейную форму, имеющую другую электрофоретическую подвижность. Результаты указывают также на то, что апоА-I не обладает специфической эндоДНКазной активностью, а трансформация суперскрученной формы плаз-миды в кольцевую происходит за счет разрыва водородных связей между комплементарными цепями ДНК плазмиды. Полученные нами результаты также свидетельствуют о том, что механизм репликационного синтеза эукариотичес-кой ДНК может запускаться тем же путем, что и при активации прокариотической ДНК при попадании прокариот (бактерий или их вирусов) в клетку биологического хозяина, т. е. при участии функционально активного комплекса «ТГК - апоА-I» и даже просто одного апоА-I.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Липопротеины - уникальная транспортная система для ксенобиотиков и биологически активных веществ // Успехи соврем. биол. 1992. 112. (4). 601-608.
Polyakov L.M., Chasovskikh M.I., Panin L.E. Lipoproteins is unique transport system for xenobiotics and biologically active substances // Uspekhi sovrem. biol. 1992. 112. (4). 601-606.
2. Khalil A., Fortin J.P., LeHoux J.G., Fulop T. Age-related decrease of dehydroepiandrosterone concentrations in low density lipoproteins and its role in the susceptibility of low density lipoproteins to lipid peroxidation // J. Lipid Res. 2000. 41. (1). 552-1561.
3. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Розуменко А.А., Биушкина Н.Г. Транспорт стероидных гормонов липопротеинами крови // Вопр. мед. химии. 1988. (5). 56-58.
Panin L.E., Polyakov L.M., Rozumenko A.A., Bi-ushkina N.G. Transport of steroid hormones by serum lipoproteins // Vopr. med. khimii. 1988. 34. (5). 56-58.
4. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Колосова Н.Г. и др. Распределение альфа-токоферола и аполипо-протеин А-Ьиммунореактивности в хроматине печени крыс // Биол. мембраны. 1997. 14. 512-519.
Panin L.E., Polyakov L.M., Kolosova N.G. et al. Distribution of alpha-tocopherol and apolipoprotein А-I immune reactivity in a chromatin of a liver of rats // Biol. membrany. 1997. 14. 512-519.
5. Панин Л.Е., Хощенко О.М. Роль резидентных макрофагов в регуляции биосинтеза ДНК и белка в клетках асцитной гепатомы мышей линии A/Sn(A) // Вопр. онкол. 2003. 49. 472-475.
Panin L.E., Hoshchenko O.M. Role of resident macrophages in regulation of biosynthesis of DNA and protein in ascites hepatoma cells of mice A/Sn(A) // Vopr. onkol. 2003. 49. 472-475.
6. Панин Л.Е. Роль резидентных макрофагов в механизмах клеточной пролиферации и опухолевого роста // Бюл. СО РАМН. 2008. 7. (Прил. 3). 5-10.
Panin L.E. The role of resident macrophages in mechanisms of a cellular proliferation and tumoral growth // Byul. SO RAMN. 2008. 7. (Suppl. 3). 510.
7. Hatch F.T., Lees R.S. Practical methods for plasma lipoprotein analysis // Adv. Lipid Res. 1968. 6. 62-68.
8. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. 227. 680-685.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. 193. 265-275.
10. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование. М., 1984. 480 c.
Маniаtis Т., Frich A., Sembruk D. Molecular cloning. М., 1984. 480 p.
11. Birnboin H.C., Doly J. Rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acid Res. 1979. 7. 1513-1522.
12. Лебедева Л.Г., Александрова С.С., Басна-кьян А.Г., Вотрин И.И. Характеристика ядерных эндоДНКаз печени крыс по молекулярной массе и катионной зависимости // Биохимия. 1995. 60. 798-803.
Lebedeva L.G., Aleksandrova S.S., Basnakyan A.G., Votrin I.I. Characteristic of nuclear endoDNA of rats liver by molecular mass and cationic dependence // Biokhimiya. 1995. 60. 798-803.
13. Свергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М., 1986. 280 c.
Svergun D.I., Feygin L.A. X-ray and neutron small angle X-ray scattering. М., 1986. 280 p.
14. Panin L.E. Molecular mechanisms of interaction of THC-apoA-I complex with DNA and initiation of transcription // Treds in DNA research / Ed. C.R. Woods. N.Y.: Nova Science Publishers Inc., 2006. 65-102.
15. Panin L.E., Kunitsyn V.G., Tuzikov F.V. Effect of glucocorticoids and their complexes with apolipoprotein A-I on the secondary structure of
eukaryotic DNA // Int. J. Quant. Chem. 2005. 101. 450-467.
FEATURES OF INTERACTION OF APOLIPOPROTEIN A-I AND ITS COMPLEXES WITH TETRAHYDROCORTISOL WITH PROKARYOTIC DNA
Lev Evgen'evich PANIN, Galina Andreevna KOVALENKO, Lev Mikhaylovich POLYAKOV, Fedor Vasil'evich TUZIKOV, Natal'ya Alexandrovna TUZIKOVA, Roman Alexandrovich KNYAZEV
Institute of Biochemistry SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
The influence of apolipoprotein A-I on secondary structure of prokaryotic DNA of a plasmid pBluescript has been investigated with the use of small angle X-ray scattering method and an electrophoresis in agarose gel. It has been shown that transition of the super braided form of a plasmid in ring under the influence of apolipoprotein A-I and its complexes with tetrahydrocortisol occurs at the expense of rupture of hydrogen bonds between the nitrogenous bases complementary DNA threads. Change of secondary structure of DNA of a plasmid occurred also at its incubation to apolipoprotein A-I without a hormone. The participation of apolipoprotein A-I in such processes of cell metabolism as replication and transcription has been discussed.
Key words: plasmid, super braided and ring DNA, apolipoprotein A-I, tetrahydrocortisol, small angle X-ray scattering.
Panin L.E. - academician of RAMS, director, e-mail:[email protected]
Kovalenko G.A. - candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of molecular mechanisms of intercellular interactions, e-mail: [email protected]
Polyakov L.M. - doctor of medical sciences, professor, head of laboratory for medical biotechnology, e-mail: [email protected]
Tuzikov F.V. - doctor of biological sciences, senior researcher of laboratory for medical biotechnology, e-mail: [email protected]
Tuzikova N.A. - researcher of laboratory medical biotechnology, e-mail: [email protected]
Knyazev R.A. - candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of molecular mechanisms
of intercellular interactions, e-mail: [email protected]
