CC BY
37
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 615.357:577.175.53.015.4
О.И. Гимаутдинова, П.А. Кузнецов, Ф.В. Тузиков, Л.Е. Панин
САЙТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК ЭУКАРИОТ С КОМПЛЕКСАМИ АПОЛИПОПРОТЕИН А-1-СТЕРОИДНЫЙ ГОРМОН
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Обнаружена высокая аффинность in vitro аполипопротеина А-I к ДНК и синтетическим де-зоксирибоолигонуклеотидам. Показана структурная и нуклеотидная специфичность при взаимодействии комплекса аполипопротеин A-1-тетрагидрокортизол с высокомолекулярной ДНК. Определены константы ассоциации аполипопротеина А-I и его комплексов со стероидными гормонами с олигонуклеотидами разного состава.
Ключевые слова: структура ДНК, аполипопротеин А-I, тетрагидрокортизол
сывороточный альбумин (БСА) и иммуноглобулины (IgG) фирмы «Сигма», США. ДНК из печени крыс и из молок лосося выделяли по методикам [8]. «Пришивку» денатурированных ДНК к АЭ-целлюлозе («Фармация», Швеция) осуществляли по методу [9]. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с экспериментальными животными».
Для проведения аффинной хроматографии АпоА-1 переводили диализом в буфер 0,05 М Трис НС1 pH 7,5, 0,8% NaCl, наносили на колонку (V=l мл) с аффинным сорбентом. Элюцию вели тем же буфером. Связавшийся с ДНК белок элюировали 1 М NaCl в буфере, указанном выше. Оптическую плотность регистрировали на ультрамикроспектрофотометре «Милихром» (Новосибирск). Аналогично проводили эксперименты по связыванию иммобилизованных ДНК с белками БСА и IgG.
Дезоксирибоолигонуклеотиды 5'-pATCTTTAACTGATGAACTTCT(21N),5' -pCCTGGGCAGATTGGTATCAAGGTTACAA (28N), 5' - pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC (20N) и р(Т)19 в виде натриевых солей синтезированы в ГНЦ «Вектор». Триэтиламмонийные соли CC(GCC)n, где п=3, 5 синтезированы в НИБХ СО РАН (Новосибирск). Олигонуклеотиды 21N, 28N и 20N, а также CC(GCC)n метили по 5'-концу у-32Р-АТР («Изотоп» Санкт-Петербург, 1 мкюри/ммоль) с помощью полинуклеотидкина-зы бактериофага Т4 («Сибэнзим», Новосибирск). Олигонуклеотиды осаждали 2% перхлоратом лития в ацетоне. Фракции радиоактивных олигонуклеотидов просчитывали по Черенкову. Удельная
Введение
Ранее было показано, что глюкокортикоиды и липопротеины высокой плотности оказывают кооперативное воздействие, усиливая биосинтез РНК и белка в печени белых крыс [1, 2]. В дальнейших исследованиях было показано, что активной формой гормона, действующей в ядре вместе с аполипопротеином А-1 (АпоА-1), является его восстановленная форма — тетрагидрокортизол (ТГК) [3, 4]. Флуоресцентное зондирование нативной ДНК из печени крыс с помощью акридинового оранжевого показало, что комплекс корти-зол-АпоА-1 практически не оказывал влияния на вторичную структуру ДНК, а действие комплекса ТГК-АпоА-1 вызывало увеличение количества однонитевых участков [5]. Методом МУРР было подтверждено влияние комплекса ТГК-АпоА-1 на структуру ДНК и определена стехиометрия этого взаимодействия [6]. Ферментативный анализ Д НК,ассоциированнойскомилексомТГК-АпоА-1, позволил оценить количество вновь появляющихся 81-нуклеазочувствительных участков: не менее 2-3 на 100 т.п.н. Было изучено их распределение по геному крыс в работе [7].
В настоящей работе исследовалось сродство АпоА-1 к ДНК по сравнению с некоторыми другими белками сыворотки крови, оценивались константы взаимодействия этого белка в комплексе со стероидными гормонами с различными синтетическими олигонуклеотидами и нуклеотидная специфичность взаимодействия ДНК с комплексами АпоА-1-стероидный гормон.
Материалы и методы
АпоА-1 выделяли из сыворотки крови крыс и анализировали, как описано в работе [7]. Бычий
радиоактивность составляла для 21N — 1,4><1010 срм/мкмоль, 28N — 0,9х 1010 срм/мкмоль, 20N — 2x1010 срм/мкмоль. Алкилирующие производные 4-(Ы-2-хлорэтил-М-метиламино)бензил-5' [32 Р]-фосфамиды олигонуклеотидов (21N-RC1 и др.) синтезированы по [10].
Реакцию аффинной модификации АпоА-1 алкилирующим производным олигонуклеотида проводили в буфере 0,05 М Трис НС1 pH 7,5, содержащем 0,8% NaCl при 37 °С в течение времени, достаточного для полного гидролиза С-С1 связи в реагенте — 1 час. Реакционная смесь содержала 5ХЮ'6 М АпоА-1 и 2, 4, 6, 8, 10, 20-молярные избытки реагента. Для подавления реакции аффинной модификации к раствору АпоА-1 вначале добавляли свободный олигонуклеотид в 10, 20, 50, 100, 200-кратном молярном избытке по отношению к реагенту 21N-RC1, который приливали в реакционную смесь после ее инкубации со свободным олигонуклеотидом. Концентрация реагента — 5><10‘5 М. Реакционную смесь выдерживали в условиях алкилирования как описано выше. Для определения степени модификации белка реагентом смесь после реакции наносили на полиакриламидный гель в 0,1% SDS, проводили электрофорез по Laemmli [11], гель автора-диографировали, полосы радиоактивного белка вырезали из геля и просчитывали со стандартом на счетчике Mark-Ill (США).
Способность GC-содержащего олигонуклеотида (ON1) связываться с АпоА-1 и его комплексом с гормоном изучали методом гель-ретар-дации. С этой целью комплекс АпоА-1-ТГК или белок АпоА-1 (10‘4 — 10'6 М) инкубировали с ON1 при комнатной температуре 5 мин в буфере ТЕ, добавляли раствор для нанесения на гель (10% глицерин, 0,025% бромфеноловый синий) или тот же раствор с 6 М мочевиной. Образовавшиеся аддукты ONl-AnoA-I-ТГК или ONl-AnoA-I отделяли от несвязавшегося олигонуклеотида электрофорезом в 15% ПААГ в отсутствие или в присутствии 6 М мочевины. ПААГ окрашивали бромистым этидием, Кумасси R-250 или Stains-all. Гель, окрашенный бромистым этидием, фотографировали в УФ-свете на пленку Микрат-изопан. Гели, окрашенные Кумасси R-250 или Stains-all, фотографировали в видимом свете на такую же фотопленку.
Для исследования специфичности связывания комплекса АпоА-1-ТГК с ДНК проводили реакцию конкурентного ингибирования с GC-содержащим (ON1) и АТ-богатым (ON2) олигонуклеотидами. В одном случае соответствующий олигонуклеотид в повышающейся концентрации (6,1 — 610 мкг/мл реакционной смеси) добавляли после связывания 0,5 мкг ДНК с 1,6х 107 мкмоль
комплекса АпоА-1-ТГК, как описано выше, в другом случае вначале к комплексу АпоА-1-ТГК добавляли олигонуклеотид, а затем ДНК. Каждую реакционную смесь подвергали ферментативному гидролизу нуклеазой 81 [7]. ДНК анализировали электрофорезом в 0.5%, 1% и 1.5% агарозных гелях. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете.
Для оценки нуклеотидной специфичности связывания комплексов АпоА-1-гормон с ДНК применяли гибридизацию по Саузерну [8].
Для определения констант ассоциации АпоА-I и комплексов АпоА-1-гормон с олигонуклеотидами СС(ОСС)5, ОШ и (Т)19 снимали спектры МУРР их равновесных смесей на дифрактометре фирмы Siemens (Германия) как описано в работе [6].
Результаты и их обсуждение
Некоторые сывороточные белки, например, альбумины и иммуноглобулины, имеют высокое сродство к нуклеиновым кислотам [9]. Результаты аффинной хроматографии, приведенные в таблице 1, показывают, что АпоА-1 имеет еще более высокое сродство (в 2-4 раза) к ДНК, чем БСА или иммуноглобулины.
Таблица 1
Связывание сывороточных белков с ДНК, иммобилизованными на АЭ-целлюлозе
Иммобилизованная ДНК Количество связавшегося белка,%
АроА-1 BSA IgG
ДНК крыс 40±10 20±5 9±4
ДНК из молок лосося 25±5 18±5 10±4
Примечание: п=3, Р<0,05
Концентрационная зависимость модификации АпоА-1 алкилирующим реагентом 2 Ш-11С1, полученная из результатов электрофореза в ПААГ по Лэммли, представлена на рис. 1. Видно, что уже при небольшом избытке производного олигонуклеотида достигается плато. Характер концентрационных зависимостей для двух других реагентов 20Ы-11С1 и 28К-11С1 аналогичен представленно-
о -------------1-----------1----------1-----------1
0 5 10 15 20
[2Ш-РС1]/[ароА-1]
Рис. 1. Концентрационная зависимость модификации АпоА -I алкилирующим производным олигонуклеотида, срм — радиоактивность в импульсах в мин
му на рис. 1. Отсюда можно сделать вывод, что AT-(21N) или GC-богатые (20N) олигонуклеотиды не имеют преимущественного сродства к АпоА-1 по крайней мере в пределах использованных дл и 111 юследовател ьностей от 20 до 28 нуклеотидов. Максимальное подавление модификации белка в присутствии свободного олигонуклеотида 21N происходило при 50-кратном молярном избытке ингибитора но отношению к реагенту. Около трети от первоначальной модификации при этом сохраняется, что указывает па конкурентный характер ингибирования и, следовательно, на специфичность модификации АпоА-1. Из данных модификации был оценен порядок константы ассоциации белка с олигонуклеотидом, которая составляет 10® М что сопоставимо с К для иммуноглобулинов, ассоциированных с гомогенным олигонуклеотидом p(dT)l6 [9]. По нашему мнению это свидетельствует об общем характере взаимодействия сывороточных белков с продуктами частичной деградации нуклеиновых кислот.
Чтобы убедиться в образовании ассоциатов АпоА-I-ON в присутствии стероидного гормона, их смеси анализировали методом гель-ретардации. На рис. 2 видно, что как АпоА-1, так и его комплекс с ТГК, образуют аддукты с GC- (ON1) и АТ-богатымн (ON2) олигонуклеотидами. Поскольку ON1 и ON2 имеют невысокую молекулярную массу, но достаточно высокий отрицательный заряд по сравнению с таковыми для АпоА-1, происходит не задержка, а ускорение ад-дуктов в геле по отношению к исходному белку (рис. 2, дор. 3-7, 9-11). Для выявления характера связей в аддукте олигопуклеотид-АноА-1-ТГК к нему добавляли диссоциирующий агент — 6 М мочевину перед нанесением смеси иа гель (рис. 2, дор. 7). Видно, чтоаддукт в значительной степени
I 2 } 4 5 ft 7 8 9 10 II 12
чве“ вав
Рис. 2. Связывание АпоА-1 и олигонуклеотидов ON1
-CC(GCC)3u ON2 - 5-А ТСТТТАА CTGA ТС АЛ СГГСТ (21N) в 15% ПААТ: и — АпоА-1; б — аддукт AnoA-1-ТГК-
олигонуклеотид. Гель окрашен кумасси R-250.
1 - АпоА-1:2 - CC(GCC)3:
3-5 - AnoA-l (3-9мкг) + CC(GCC)3;
6 - AnoA-l-ТГК + CC(GCC)3;
7 AnoA-l-ТГК + CC(GCC)3, в 6М мочевине;
Я - ON2; 9-11 - АпоА-1 (3-9 мкг) + ON2;
12 AnoA-1-ТГК + ON2
диссоциировал, но не полностью. Это указывает на преобладание гидрофобных взаимодействий и не исключает участие электростатических сил при образовании сложных аддуктов олигоиук-леотнд-стероид-белок.
Выбор нуклеотидной последовательности вида CC(GCC)n в качестве возможных сайтов связывания комплекса АпоА-1-ТГК с ДНК неслучаен. Имеются литературные данные о последовательностях такого вида, обнаруженных в регуляторных районах генов, например, гена АпоА-1 человека, гена множественной лекарственной устойчивости mdr1, топоизомеразы 2р, рибосомпого белка L32, рРНК 1121 и др. Участок промоторного района одного из таких генов — топоизомеразы 2р, содержащий GGC район, был проанализирован с помощью программы TRANSFAC: GenBank, locus HSU82759, accession U82759. NIL) gl778587 Homo sapiens topoisomerase II beta gene 113]. Было показано, что GGC-район перекрывается с сайтами связывания ряда факторов транскрипции, что свидетельствует о его значимости для регуляции экспрессии данного гена.
Ранее мы показали воздействие in vitro комплекса АпоА-1-ТГК на вторичную структуру ДНК крыс, в результате которого появляются однони-тевые участки, обнаруживаемые с помощью методов флуоресцентного зондирования, МУРР |(i| и ферментативным анализом с расщеплением мук-леазой S1 17]. Было найдено образование дополнительных 2-3 Sl-нуклеазочувствительных участков на 100 т.п.н. ДНК, в основном нерегулярно распределенных по геному. Но среди них были обнаружены участки, после расщепления которых S1 нуклеазой образуются фрагменты размером 5,5 и 6 кб |7|. Воздействие комплекса АпоА-1-ТГК ка структуру ДНК является дозозависимым и специфичным. Замена АпоА-1 на другой белок лпнонротеннов высокой плотности — АиоЕ или ТГК на кортизол не приводили к такому воздействию на вторичную структуру [5-71. В то же время стероидные гормоны: кортизол, ТГК, андросте-рон, ДЭАС образуют аддукты с ДНК и вызывают появление некоторого количества однонитевых участков, хотя существенно меньшего, чем ТГК или ДЭАС в комплексе с АпоА-1 [5,7].
Ранее было сделано открытие макрофаг-завп-снмого стимулирования белкового синтеза при кооперативном действии липопротепнов высокой плотности и кортизола в печени и других органах и тканях крыс Вистар в условиях адаптации 11,141. Увеличение скорости синтеза общего белка в 2-2,5 раза в таких условиях существенно выше, чем увеличение скорости синтеза ферментов глюконеоге-неза под влиянием кортизола (в 1,1-1,2 раза). Этот факт подчеркивает обнаруженное ранее отличие
Таблица 2
Константы связывания АпоА-1 с олигонуклеотидами в присутствии и в отсутствие стероидных гормонов по данным МУРР
Белок / олигонуклеотид CC(GCC)5 AT-rich T19
ApoA-I 5,37x10s M ' —
АроА-1-кортиэол 3,65* 10s M 1
ApoA-I-ТГК 1.66x10s M' 3.11X105 M ' 2.32 *10; M '
механизма кооперативного действия ЛПВГТ и кортизола с участием резидентных макрофагов от механизма глюконеогеиеза и заставляет искать молекулярные механизмы нового явления. В нашей работе |7| было высказано предположение о функциональной роли комплекса АпоА-1-ТГК, подобной функции транскрипционного фактора или коактиватора, изменяющего структуру ДНК в сайтах связывания. Для проверки ряда синтетических олигонуклеотидов на специфичность взаимодействия с комплексами АпоА-1-стероидный гормон методом МУРР были определены константы их ассоциации (таблица 2).
Из таблицы 2 видно, что константа ассоциации СС-содержащего олигонуклеотида в 4,5 раза увеличивается при замене кортизола в комплексе АроА-1-стероидный гормон на его восстановленную форму — тетрагидрокортизол. В присутствии ТГК константа ассоциации белок-олигонуклеотид в 3 раза увеличивается, тогда как в присутствии кортизола даже несколько снижается.
На основании этих результатов были выбраны две последовательности для изучения ингибирования взаимодействия комплекса АпоА-1-ТГК с ДНК крыс с последующим расщеплением нуклеазой: СС(ССС)3 и АТСТТТ ААСГС АТСААСТТСТ (2Ш). В работе |7| было показано, что АТ-богатый олигонуклеотид практически не оказывает влияния на картину расщепления Б1 нуклеазой ДНК после ее взаимодействия с комплексом АпоА-1-ТГК. Напротив, СС(ССС)3 ингибирует это взаимодействие. Таким образом, было показано, что 81-нуклеазочувствительные участки появляются при взаимодействии ДНК с комплексом АпоА-1-ТГК преимущественно в сайтах вида ССС/ССС.
Для оценки секвенс-специфичности расщепляемых Б1 нуклеазой участков взаимодействия комплекса АпоА-1-гормон (ТГК, ДЭАС-сульфат) с ДНК был проведен эксперимент с использованием метода Саузерн-гибридизации (8]. На рис. 3 представлен результат дот-гибридизации (данные денситометрирования радиоавтографов гелей с помощью программы Вап(15сап)), проведенной с :,:Ф-СС(ССС),. Из рис. 3 видно, что уменьшение сигнала от СС(ССС). зонда на ДНК, обработанной комплексами АиоА-1-ТГК (стол-
Рис. 3. Гистограмма гибридизации зонда ,2P-CC(GCC)5 с ДНК, обработанной S1 нуклеазой.
Р<0,05, п=4
1 — ДНК: 2 — ДНК-АпоА-I- ТГК; 3 - ДНК-АпоА-1-ДЭАС
бик 2) или апоА-I-ДЭАС-сульфат (столбик 3) и S1 нуклеазой по сравнению с контролем (ДНК, обработанная только S1 нуклеазой, столбик 1) составило -1,5 раза.
Заключение
В настоящей работе показано высокое сродство аполипопротеина А-I к ДНК эукариот. На модельных гетероолигонуклеотидах определены константы подобного взаимодействия и показана его специфичность, которая существенно возрастает в присутствии стероидных гормонов (ТГК, ДЭАС). Впервые продемонстрирована нуклеотидная специфичность связывания комплекса стероид-АпоА-I с ДНК экспериментами по конкурентному ингибированию взаимодействия и по Саузерн-гибридизации. Из сравнения с литературными данными по значимости последовательностей вида GCC/CGG [ 13, 15] сделан вывод, что найденные на ДНК сайты связывания с комплексами АпоА-1-ТГК (ДЭАС-сульфат) имеют функциональное значение в процессах регуляции экспрессии генов.
Сокращения: ТГК-тетрагидрокортизол, ДЭАС-де-гидроэпиандростерон, апоА-1-аполипопротеин А-1, МУРР-малоугловое рентгеновское рассеяние, 21N-RCl-алкилирующий производный олигонуклеотида, ON 1 -GC-содержащнй, ON2-AT-богатый олигонуклеотиды
SITES THE INTERACTION OF EUKARIOTIC DNA WITH APOLIPOPROTEIN A-I-STEROID HORMON COMPLEXES
O.I. Gimautdinova, P.A. Kuznetsov, F.V. Tuzikov, L.E. Panin
In this work shown the high affinity of apolipo-protein А-I to DNA in vitro and synthetic deoxyri-booligonucleotides. It was shown structural and nucleotide specificity of interaction the apoA-I-THC complexc with DNA. It was evaluated association constants apoA-I and apoA-1-steroid complexes with synthetic oligonucleotides.
Литература
1. Диплом № 99 Международной Ассоциации авторов открытий / Л.Е. Панин, И.Ф. Усынин, А.В. Харьковский. — Брюссель, 1998.
2. Панин Л.Е. Роль плазменных липопротеидов как модуляторов специфического гормонального эффекта гидрокортизона /Л.Е. Панин, И.Г. Свечникова, Н.Н. Маянская //Укр. Биохим. Журнал. — 1995. — Т. 67.
- С. 64-70.
3. Панин Л.Е. Явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей / Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН.
- 1998. -№3. - С. 11-23.
4. Panin L.E. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein А-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA and GCC elements of genes / L.E. Panin, F.V. Tuzikov, O.I. Gimautdinova // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. — 2003. - Vol. 87. - P. 309-318.
5. Гимаутдинова О.И. Влияние аполипопротеина А-1 в комплексе с тетрагидрокортизолом на вторичную структуру нативной ДНК / О.И. Гимаутдинова, Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН. - 1998. - №3, С. 32-35.
6. Взаимодействие эукариотической ДНК с аполи-попротеином А-I и его комплексами с глюкокортикои-дами / Л.Е. Панин, Ф.В. Тузиков, Н.А. Тузикова и др. // Биофизика. - 2000. - Т. 45. - С. 611-619.
7. Влияние комплекса тетрагидрокортизол-апо-липопротеин А-I на вторичную структуру эукариотической ДНК и ее взаимодействие с РНК-полимеразой / Л.Е. Панин, О.И. Гимаутдинова, П.А. Кузнецов и др. //Биохимия. — 2002. — Т. 67. — Вып. 7. — С. 953-958.
8. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. — М., 1984. — С. 146-272.
9. Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides / E.Yu. Rykova, L.V. Pautova, L.A. Yakubov et al. //FEBS Letters. - 1994. - Vol. 344. - №1. - P. 96-98.
10. The proteins of the messenger RNA binding site of E. coli ribosomes / O.I. Gimautdinova, G.G. Karpova, D.G. Knorre,N.D. Kobetsch//Nucleic Acids Res. — 1981.
- Vol. 9. - №14. - P. 3465-3481.
11. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
12. Malik S. Transcriptional regulation of the apoli-poprotein AI gene / S. Malik // Fronties in Bioscience.
- 2003. - Vol. 8. - P. 360-368.
13. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts / A.A. Bashirova, M.L. Markelov, T.V. Shlykova et al. // Gene. - 1998. - Vol. 210. - № 2. - P. 239-245.
14. Панин Л.Е., Хощенко О.М., Усынин И.Ф. Роль аполипопротеина А-I в активации биосинтеза белка и ДНК в гепатоцитах под влиянием стероидных гормонов / Л.Е. Панин, О.М. Хощенко, И.Ф. Усынин // Бюл. эксп. биол. и медицины. — 2001. — Т. 131. — № 1. — С. 63-65.
15. Identification of a single-stranded DNА-binding protein that interacts with an SI nuclease-sensitive region in the platelet-derived growth factor А-chain gene promoter / Z.Y. Wang, X.H. Lin, M. Nobuyoshi, T.F. Deuel //J. Biol. Chemistry. — 1993. — Vol. 268. — № 14. — P. 10681-10685.
