Экспрессный электрохимическим метод анализа антиоксидантной активности пищевых продуктов
A.Я. Яшин, Я.И. Яшин, Н.И. Черноусова
НПО «Химавтоматика» (Москва)
B.П. Пахомов
Институт клинической фармакологии НЦ ЭСМП МЗ РФ
В последние годы установлена связь между ростом свободных радикалов (супероксидный анион-радикал, гидро-пероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.) в биологических жидкостях человека с возникновением опасных заболеваний, в частности сердечно-сосудистых, онкологических, диабета и др. Преждевременное старение также связывают с ростом количества свободных радикалов.
Увеличение содержания в организме свободных радикалов обусловлено снижением активности ферментов антиоксидантной защиты организма: оксид-дисмутазы, каталазы, пероксидазы, а также влиянием неблагоприятных внешних факторов (загрязнения внешней среды, радиация, курение, постоянные стрессы, алкоголизм, УФ-облучение, некачественное питание).
Для снижения уровня свободных радикалов в биологических жидкостях человека рекомендуется ежедневно употреблять пищевые продукты, лекарственные препараты, биологически активные добавки и напитки, содержащие природные антиоксиданты, в частности фрукты, ягоды, овощи, растительные масла, чай, мед, вино, пиво и др. Регулярное профилактическое потребление соответствующего уровня антиокси-дантов позволит восстановить до нормы антиоксидантный статус организма
и сохранить здоровье и продолжительность полноценной жизни.
Однако для эффективной профилактики и лечения свободнорадикальной патологии прежде всего необходимо иметь достоверные сведения, во-первых, о содержании антиоксидантов в разных продуктах и напитках, во-вторых, — о состоянии антиоксидантной системы организма.
Многие существующие, особенно химические, методы недостоверно определяют антиоксидантную активность продуктов. Нами предложен оригинальный амперометрический метод определения антиоксидантной активности продуктов питания, биологически активных веществ и напитков. На основе этого метода разработан прибор. Антиоксидантная активность связана с присутствием в указанных продуктах природных соединений, в частности флавоноидов, витаминов С, Е, ароматических оксидантов и других полифенолов.
Амперометрический способ [1, 2] основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом.
Чувствительность амперометричес-кого способа определяется как приро-
дой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенным к нему. В качестве материала рабочего электрода используют стеклоуглерод, золото, платину, серебро, медь, никель, палладий и др. Потенциал может устанавливаться в пределах от 0 до 2,5 В.
Известно, что амперометрический способ анализа обладает рядом преимуществ: низким пределом обнаружения, высокой селективностью (определяются только соединения, молекулы которых могут окисляться; другие соединения, присутствующие даже в больших концентрациях, не определяются), малым объемом ячейки (0,1-5 мкл), простотой обслуживания.
В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения на уровне 10-9-10-12 г, в благоприятных условиях некоторые соединения определяются на уровне 10-15 г (фемтог-раммы).
Основные и наиболее активные природные антиоксиданты имеют феноль-ную природу. Это природные полифенолы, разные типы флавоноидов, феноль-ные оксикислоты, витамины и др.
Таким образом, амперометрический способ — наиболее подходящий метод для оценки антиоксидантной активности.
Принципиальная схема прибора [3, 4], который включает емкость для растворителя; насос; дозатор, выполненный в виде многоходового крана; ам-перометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами; усилитель тока; аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала, показана на рис. 1. Прибор позволяет проводить прямые количественные измерения антиоксидантной активности исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения. Амперо-метрический детектор может работать в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне. Причем, варьируя полярность и величины приложенных потенциалов, можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.
Прибор работает следующим образом: насос постоянно прокачивает растворитель, забирая его из емкости, через всю систему. В кран-дозатор в положении «отбор проб» вводится стандартным шприцем на 1 мл исследуемый раствор в дозируемую петлю. Поворотом ручки крана в положение «анализ» поток растворителя направляет опре-
Рис. 1. Принципиальная схема электрохимического прибора для определения антиоксидантной активности
ПИ]
НАЛИТСИу 6 •
2004
1160,84 519,44 нА
1 2 3 4 - 5 6 7 8
-- "Г"
\
-121,96
! ! ! !
340,61 774,89 1209,17 с Рис. 2. Воспроизводимость последовательных восьми дозирований разбавленных растворов бальзама «Тайга» (СКО < 3 %)
деленную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора. В последней на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами. Величина электрического тока зависит от природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и
потенциала, приложенного к электроду.
Возникающие электрические токи очень малы (в пределах 10-6-10-9 А), эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем с помощью АЦП преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера. В случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.
Рабочий электрод выполнен из стек-лоуглерода, который наиболее универсален при определении полифенольных соединений. Потенциал может изменяться от 0 до 2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений варьируются в пределах 100-1000 мВ.
Электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов в соответствии со следующими уравнениями:
Флавоноид-О-Н®флавоноид-О' + + - + Н+ (окисление
при максимальном потенциале);
Флавоноид-О-Н®флавоноид-О' + Н' (улавливание свободным радикалом).
Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н, Н. состоит из - + Н+. Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами (т.е. их ан-
тиоксидантная активность) может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде ампе-рометрического детектора.
Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из трех-пяти последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно использовать следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, ди-гидрокверцетин, мексидол, тролокс, аскорбиновую кислоту, галловую кислоту и др. Амперометрический прибор имеет ряд преимуществ при определении антиоксидантной активности. Без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени. Правильность и воспроизводимость анализа обеспечиваются за счет точного дозирования шестиходовым
Таблица 1
Сок Отношение (сигнал исследуемого
вещества/сигнал стандарта)
Лимона 7,86
Чеснока 7,82
Белой редьки 6,86
Свеклы 6,61
Граната 5,98
Грейпфрута 5,84
Красного 5,29
винограда
Апельсина 4,5
Мандарина 4,2
Красного перца 4,14
Лука 3,95
Хурмы 2,85
краном; объем дозируемой петли может меняться от 20 до 500 мкл; СКО дозирования краном менее 0,5 %; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 3 % (рис. 2).
Предел обнаружения амперометри-ческого детектора полифенолов, фла-воноидов на уровне нанопикограммов (10-9-10-12 г). При таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. Меняя величину приложенного потенциала, можно дифференцировать анти-оксиданты по классам. Дифференциация возрастает при применении импульсного режима работы амперомет-рического детектора, имеющегося в приборе. Кроме того, в автоматическом режиме можно определять вольтампе-рограммы для идентификации антиок-сидантов. Амперометрическое детектирование в импульсном режиме выполняется автоматически с помощью серии из нескольких кратковременных потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается соответствующим для определения конкретных соединений. Он налагается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего времени — 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается при высоком положительном потенциале в течение 50-200 мс и затем восстановления при отрицательном потенциале в течение 100-400 мс, прежде чем наступит новый цикл.
В импульсном режиме амперометри-ческий детектор работает стабильно длительное время. Отношение сигналов к одному и тому же антиоксиданту при разных потенциалах может быть также использовано для идентификации: высокая селективность определения характерна только для антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению; другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их определению. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость анализа очень низкая.
Наиболее актуальная задача в области определения антиоксидантной активности — создание универсального и сравнительно дешевого метода. По нашему мнению, из всех существующих методов амперометрический способ в наибольшей степени удовлетворяет этим требованиям. Особенно удобен амперометрический способ при сопоставлении антиоксидантной активности (АОА) пищевых продуктов, разных лекарственных форм, напитков, БАД и др. Некоторые из подобных сопоставлений приведены в табл. 1-4. В табл. 1 приведена АОА свежевыжатых соков фрук-
6•2004
ПИВО " "ЛПИТКИ
Таблица 2
Мед | АОА, мг/г
Донника 2,68
Гречишный 2,31
Липовый 2,11
Луговой 1,96
Эспарцетовый 1,80
Цветочный 1,64
Белой акации 1,42
Расторопши 1,27
Таблица 3
Сорт хмеля АОА, мг/г
Крылатский 15,2
Михайловский 14,5
Подвязный 14,1
Челенджер 13,2
Истринский 12,2
Ранний 11,7
Дикий 11,7
Сумерь 11,6
Таблица 4
Бальзам АОА, S б / S ' образца ' стандарта
«Тайга» 14,1
«Виватон» 9,8
«Ишимский» 5,6
«Демидовский» 4,8
«Алтайский» 1,2
Jägermeister 1,2
тов и овощей (2 г сока разбавляли 10 мл воды); в табл. 2 — АОА разных типов пчелиного меда (мед был взят у пчеловодов на ярмарке меда в Москве); в табл. 3 — АОА разных видов хмеля, собранных в соответствии с ГОСТом; в табл. 4 — АОА некоторых типов бальзамов и эликсиров, взятых в упаковках производителя.
Отдельно исследована антиоксидан-тная активность концентрата стевии «Стевиол», которая может быть использована как пищевая добавка.
Антиоксидантная активность экстракта стевии оказалась равной 116,5 мг/мл (стандарт — кверцетин). Это очень вы-
сокая антиоксидантная активность: для сравнения можно указать, что антиок-сидантная активность красного вина «Каберне» равна 12,5 мг/мл.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пахомов В.П, Яшин Я.И., Яшин А.Я., Багиро-ва В.Л., Арзамасцев А.П, Кукес В.Г., Ших Е.В. Способ определения суммарной антиокси-дантной активности биологически активных соединений. Патент № 2238554. Приоритет от 25.07.2003 г.
2. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Пахомов В.П, Чер-ноусова Н.И. Новый экспрессный амперомет-рический способ определения антиоксидант-ной активности растительных лекарственных препаратов, биологически активных добавок
и напитков/Материалы VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Фитофарм. — Миккели, Финляндия, 2004. С. 617-620.
33. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиокси-дантной активности биологически активных соединений. Патент № 2238555. Приоритет от 25.07.2003 г.
4. Яшин А.Я., Яшин Я.И. Прибор для определения антиоксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков/ Материалы VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Фитофарм 2004. — Миккели, Финляндия. С. 613-617. (^ш
УПРАВЛЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВОМ !*: В СИСТЕМЕ TRACE MODE
КРУПНЕЙШИЙ
СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ФОРУМ ПО УПРАМЕНИЮ ПРОИ360ДС1В0М
УПРАВЛЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВОМ
В СИСТЕМЕ TRACE MODE
Одиннадцатая Международная конференция и выставка
SOFTLOGiC SCADA H М I ЕАМ HRM MES
I Мировые тенденции;
ВЫСТАВКА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБОРУДОВАНИЯ
для управления современным expo производством
TRACE MODE COMPATIBLE 2005
I Промышленное оборудование с цифровым управлением:
Средство измерений, датчики, исполнительные устройства;
ПИВО "НАПИТКИ
6•2004