CC BY
215
УДК 582.998.2:547.587
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА МЯТЫ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
© Н.Н. Сажина1, В.М. Мисин1, Е.И. Короткова2
1 Институт биохимической физики им Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4,
Москва, 119334 (Россия) e-mail: [email protected]
2Томский политехнический университет, пр. Ленина, 30, Томск, 634050
(Россия) e-mail: [email protected]
Двумя электрохимическими методами - амперометрическим и вольтамперометрическим измерены суммарное содержание антиоксидантов и их активность к кислороду и его радикалам в водном экстракте мяты перечной (Mentha piperita L.). Выявлена динамика этих параметров в первые часы после заварки и дается объяснение полученных результатов с точки зрения состава мяты.
Ключевые слова: антиоксиданты, амперометрический и вольтамперометрический методы, полифенолы, кислородные радикалы.
Введение
В настоящее время большое внимание уделяется исследованию содержания и активности антиоксидантов (АО) в лекарственных растениях, пищевых продуктах, напитках, БАДах и других объектах. Известно, что увеличение активности процессов свободнорадикального окисления в организме приводит к нарушению структуры и свойств липидных мембран, вследствие чего возникает прямая связь между избыточным содержанием свободных радикалов в организме и возникновением опасных заболеваний [1]. АО относятся к классу биологически активных веществ, которые связывают излишние свободные радикалы, препятствуя ускоренному окислению липидов. Поэтому изучение активности антиоксидантов в лекарственных травах, особенно богатых этими соединениями, представляет несомненный интерес [2].
Мята перечная (Mentha piperita L.) - один из самых распространенных видов лекарственных растений. Она широко используется в медицине, кулинарии, бытовой химии и косметологии. Мята применяется как лекарство наружно и внутрь в виде настоев и чаев при желудочно-кишечных заболеваниях, для снижения температуры при простуде, как успокоительное средство при сердцебиении, депрессии и бессоннице, как болеутоляющее средство в виде компрессов из отвара, как анестезирующее средство при ожогах и укусах насекомых, а также снимает напряжение и головную боль. Мята перечная содержит эфирное масло (2-3%), основным компонентом которого является ментол, определяющий вкус и анестезирующие свойства мяты, а также другие вещества: эфиры, феландрен, пинен, ясмол, пиперитон, ментофуран и т.д. В ее составе имеются также рутин (0,015%) и другие полифенольные соединения, дубильные и смолистые вещества, каротин (0,01%), аскорбиновая кислота (0,01%) [3].
Есть публикации, посвященные измерению содержания и активности АО в экстрактах мяты, например [4-7]. Однако это в основном трудоемкие химические методы, и полученные по этим методам результаты плохо сопоставимы между собой, в том числе из-за отсутствия единых единиц измерения. Использование двух оперативных электрохимических методов позволило изучить динамику антиоксидантной активности мяты после экстракции.
Цели настоящей работы - измерение антиоксидантной активности (АОА) водного экстракта мяты методом вольтамперометрии и изучение механизма влияния компонентов мяты на процесс электровосстановления кислорода. Параллельно в экстракте мяты были проведены измерения суммарного содержания АО фенольного типа амперометрическим методом.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объектом исследования явился водный экстракт мяты перечной (Mentha piperita L.), собранной и высушенной в 2008 г. в Западнодвинском районе Тверской области. Для получения экстракта сухую траву измельчали в ступке до размера частиц 1-2 мм. Далее 0,5 г травы заливали дистиллированной водой с Т=95 °С, объемом 50 мл и выдерживали в течение 10 мин без термостатирования, после чего экстракт тщательно отфильтровывали через бумажный фильтр «синяя лента» и при необходимости разбавляли перед измерениями [7]. Кислотность экстракта (рН) составила 6,6.
В настоящей работе использовали два электрохимических метода. Амперометрический метод [8] позволяет определить суммарное содержание фенольных соединений в изучаемых образцах. Измерения проводили на приборе «Цвет Яуза-01-АА» [9]. Сущность данного метода заключается в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при постоянном потенциале 1,3 В. При этом потенциале происходит окисление только групп -ОН природных антиоксидантов фенольного типа [7-9]. Предварительно строили градуировочную зависимость сигнала образца сравнения (галловой кислоты) от его концентрации. С помощью полученной градуировки сравнивали сигналы от исследуемого экстракта с сигналами образца сравнения - галловой кислоты. Значения СКО (относительное среднеквадратичное отклонение 5-6 идентичных показаний прибора) составили не более 5% [9].
Вольтамперометрический метод заключается в том, что в качестве модельной реакции, лежащей в основе методики, предлагается использовать процесс электровосстановления (ЭВ) кислорода, идущий по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животных и тканях растений. Реакция электровосстановления кислорода на электроде идет в несколько стадий с генерацией на поверхности электрода активных форм кислорода [10]:
О2 + е- < > О2-
О2 - + Н+ <-------> HO2
НО2 + Н+ + е- < > Н2О2
Е°отн. н.в.э =+0,682 V
(1)
(2)
(3)
Н2О2+ 2Н+ + 2е- < > 2Н2О
Е
отн. н.в.э.
=+1,770 V
(4)
Для определения активности антиоксидантов в работе [10] предложено использовать первую волну ЭВ
О2, соответствующую стадиям (1) - (3), когда на поверхности ртутно-пленочного электрода образуются активные кислородные радикалы и перекись водорода как конечный продукт. При оценке влияния природы антиоксидантов на процесс электровосстановления кислорода было замечено, что они по-разному воздействуют на данный процесс. В таблице приведены четыре условно разделенные группы веществ, различающиеся по характеру влияния на процесс ЭВ О2 [11].
Группы биологически активных веществ, отличающихся по механизму влияния на процесс электровосстановления кислорода
№ группы 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа
Названия Каталаза, фталоциани- Соединения фенольной N Б, Бе-содержащие Супероксидисмутаза
веществ ны металлов, гуммино- природы, витамины А, соединения, амины, (СОД), порфирины
вые кислоты Е, С, В, флавоноиды, аминокислоты, актив- металлов, цитохром С
убихинон, глюкоза ные альдегиды
Влияние на Увеличение тока ЭВ Уменьшение тока ЭВ Уменьшение тока ЭВ Увеличение тока ЭВ
ЭВ О2 О2, сдвиг потенциала в О2, сдвиг потенциала в О2, сдвиг потенциала в О2, сдвиг потенциала в
отрицательную область положительную об- отрицательную область положительную об-
ласть ласть
Предпола- Механизм ЕС* с после- Механизм ЕС с после- Механизм СЕС Механизм ЕС с катали-
гаемый дующей реакцией дис- дующей химической с предшествующей и тическим восстановле-
электрод- пропорционирования реакцией взаимодейст- последующей химиче- нием кислорода через
ный меха- перекиси водорода и вия АО с активными скими реакциями образование промежу-
низм частичной регенерацией кислородными радика- взаимодействия АО с точного комплекса
молекулярного кисло- лами кислородом и его ак-
я—1 рода тивными радикалами
Примечание: *Е - электродная стадия процесса, С - химическая реакция.
Еоотн. н.в.э.=+0,012 V
В качестве критерия антиоксидантной активности исследуемых веществ используется кинетический критерий К, который отражает количество кислорода и активных кислородных радикалов, прореагировавших с АО (или смесью АО) за минуту времени:
С I
К = Со (1 - —)
* V,
с размерностью мкмоль/л-мин, где 1,10 - токи электровосстановления кислорода соответственно в присутствии и при отсутствии АО в растворе фонового электролита, С0 - исходная концентрация кислорода в растворе (мкмоль/л), т. е. растворимость кислорода в фоновом электролите при нормальных условиях, * - время экспозиции рабочего электрода при постоянном потенциале предельного тока кислорода, характеризующее протекание реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами. В настоящей работе в качестве фонового электролита использовался фосфатный буферный раствор объемом 10 мл с известной исходной концентрацией молекулярного кислорода, куда добавлялось дозированное (5=10-500 мкл) количество испытуемого образца [10]. Время активации - 120 с, скорость развертки потенциала - 0,1 В/с. Вольтам-перометрический метод исследования отличается хорошей чувствительностью и является достаточно простым и дешевым. Однако, как в любом подобном электрохимическом методе, разброс показаний прибора при идентичных измерениях оказался достаточно большим (до 1,5-2,0 раз). Поэтому для каждого образца были проведены 3-4 замера, и результаты усреднялись. Среднеквадратичное отклонение кинетического критерия К от среднего значения для всех исследованных образцов составило не более 30%.
Результаты и обсуждение
На рисунках 1-3 приведены примеры вольтамперограмм, полученных в разное время после экстракции мяты: сразу после экстракции 1=5 мин (рис. 1), 1=30 мин (рис. 2) и 1=60 мин (рис. 3), для одинаковых значений концентрации экстракта мяты в буферном фоновом растворе в ячейке (5=100 мкл в 10 мл буферного раствора). Видно, что свежий экстракт мяты (рис. 1) «работает» по механизму классических АО, уменьшая ток и сдвигая потенциал в положительную область (2-я группа в таблице). Однако уже примерно через час (рис. 3) характер взаимодействия компонентов мяты с кислородом и его радикалами меняется, следуя механизму, характерному для веществ 4-й группы таблицы. Переход от одного механизма к другому происходит примерно через 30 мин (рис. 2), и кинетический критерий К становится при этом близким к нулю. Сдвиг потенциала полуволны тока восстановления кислорода (Д) остается примерно одинаковым (0,20-0,25 В). При дальнейшем хранении экстракта в лабораторных условиях характер вольтамперограммы принципиально не меняется, а модуль кинетического критерия |К| растет до значений 2,0±0,5 мкмоль/л-мин через 3 ч после экстракции.
На рисунках 3-5 показан пример зависимости кинетического критерия К и сдвига потенциала Д от концентрации экстракта мяты в фоновом растворе при временах хранения экстракта более 1 ч. По мере уменьшения дозы экстракта 5 в фоновом растворе |К| и Д понижаются от |К|=1,5±0,5 мкмоль/л-мин, Д=0,25 В при 5=100 мкл (рис. 3) до величин |К|=1,3±0,3 мкмоль/л-мин, Д=0,10 В для 5=25 мкл (рис. 4) и |К|=0,8±0,2 мкмоль/л-мин, Д=0,05 В для 5=10 мкл (рис. 5). При увеличении 5 более 100 мкл характер вольтамперограмм меняется слабо, а при 5>300 мкл наблюдается уменьшение |К|.
Параллельно с регистрацией вольтамперограмм для этого же экстракта мяты было измерено суммарное содержание АО фенольного типа С (в единицах галловой кислоты) от времени хранения экстракта 1 амперометрическим методом (рис. 6). Зависимость С от 1 свидетельствует о достаточно ощутимом падении С после экстракции и фильтрования экстракта мяты (примерно 20% за 2 ч хранения). Это, вероятно, связано с распадом нестойких фенольных соединений, содержащихся в экстракте. Характер вольтамперограмм и значения кинетического критерия (рис. 1-3) в первые моменты времени после заварки меняются, поскольку влияние классических АО фенольного типа (рис. 6) на процесс восстановления кислорода и его радикалов уменьшается.
Рис. 1. Вольтамперограммы тока восстановления кислорода при отсутствии (левая кривая) и в присутствии (правые кривые) экстракта мяты в кювете через 1=5 мин после заварки мяты. Доза экстракта 5=100 мкл в 10 мл буферного фонового раствора
Рис. 2. То же, что на рис. 1, для 1=30 мин
Рис. 3. То же, что на рис. 1, для 1=60 мин
Рис. 4. То же, что на рис. 1, для 1>60 мин. Доза экстракта 5=25 мкл в 10 мл буферного фонового раствора
-1 0,9 -0,8 -0,7 -0,5 -0,6 0.+ -0,3 -0,2 -0,1 О
V [В]
I [мкА]
-1 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 О
V [В]
-0,9 -0,8 0,7 0,6 -0.5 -0,4 0.3 -0.2 4.1 О
V [В]
V [В]
Рис. 6. Суммарное содержание фенольных антиоксидантов С в экстракте мяты в зависимости от времени хранения экстракта 1
Как уже было упомянуто во введении, одним из основных компонентов эфирного масла мяты является ментол СюН20О [12], поэтому был изучен характер вольтамперограмм при введении в буферный раствор вольтамперометрической ячейки водного раствора ментола. Навеска ментола 60 мг была растворена в 100 мл горячей воды, и дозы этого раствора 200-500 мкл добавлялись в 10 мл буферного раствора. Вольт-амперограммы снимались при тех же условиях, что и экстракт мяты. На рисунке 7 представлен типичный пример такой вольтамперограммы, из которой видно, что ментол «работает» как классический АО, уменьшая ток электровосстановления кислорода. Для дозы раствора ментола 5=500 мкл кинетический критерий К составил 1,5±0,4 мкмоль/л-мин, несколько уменьшаясь при снижении концентрации ментола. Подобным образом действует и родственное соединение ментола - циклогексанол, активность которого при той же концентрации входит в тот же интервал значений К, что и для ментола. Вольтамперограммы таких составных частей мяты, как рутин и аскорбиновая кислота, также представляют собой классический пример соединений 2-й группы таблицы [13]. Исходя из этого, можно заключить, что суммарный механизм взаимодействия компонентов мяты с кислородом и его радикалами определяется не перечисленными выше веществами, а другими компонентами, например некоторыми соединениями фенольной природы, дающими сдвиг потенциала в положительную сторону и доминирующими в химическом механизме для свежего экстракта. При хранении экстракта количество этих нестойких соединений уменьшается, и общий характер восстановления кислорода обусловливается уже соединениями, содержащимися в мяте, которые входят в 4-ю группу таблицы. Возможно, это разного рода металлокомплексы, которые действуют как катализаторы проходящих химических реакций.
Рис. 7. Вольтамперограммы тока восстановления кислорода при отсутствии (верхняя кривая) и в присутствии (нижние кривые) водного раствора ментола.
Доза раствора ментола 5=500 мкл в 10 мл буферного фонового раствора
Выводы
Амперометрическим и вольтамперометрическим методами измерены суммарное содержание антиоксидантов и их активность к кислороду и его радикалам в водном экстракте мяты перечной (Mentha piperita L.). Выявлено, что эти параметры, а также характер вольтамперограмм, т.е. механизм восстановления кислорода, после заварки принципиально меняются. Дается объяснение полученных результатов с точки зрения присутствия не только фенольных соединений, но и других классов органических соединений, в частности металлокомплексов.
Список литературы
1. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: вчера, сегодня, завтра // Биологическая кинетика: сб. обзор. ст. М., 2005. Т. 2. С. 10-45.
2. Dillard C.J., German J.B. Phytochemicals: nutraceuticals and human health // J. Sci. Food Agric. 2000. V. 80. Pp. 1744-1756.
3. Дудченко Л.Г., Козьяков А.С., Кривенко В.В. Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения. Киев, 1989. 304 с.
4. Proestos C., Chorianopoulos N., Nychas G.-J.E., Komaitis M. RP-HPLC analysis of the phenolic compounds of plant extracts. Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53, N4. Pp. 1190-1195.
5. Autoui Ali K., Mansouri A., Boskou G., Refalas P. Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile // Food Chem. 2005. V. 89, N1. Pp. 27-36.
6. Katalinic V., Vilos M., Kulisic T., Jukic M. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols // Food Chem. 2006. V. 94, N4. Pp. 550-557.
7. Мисин В.М., Сажина Н.Н., Завьялов А.Ю., Яшин Я.И. Измерение содержания фенолов в экстрактах лекарственных трав и их смесях амперометрическим методом // Химия растительного сырья. 2009. №4. С. 127-132.
8. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П. Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной активности пищевых продуктов // Пиво и воды. 2004. №6. С. 44-46.
9. Яшин А.Я. Инжекционно-проточная система с амперометрическим детектором для селективного определения антиоксидантов в пищевых продуктах и напитках // Российский химический журнал. 2008. Т. LII, №2. С. 130-135.
10. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Avramchik O.A. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry // Anal. and Bioanal. Chem. 2003. V. 375, N1-3. Pp. 465-468.
11. Короткова Е.И., Лукина А.Н. и др. Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения: сб. докл. М., 2004. С. 182-194.
12. Handbook of Chemistry and Physics. 71st edition. Michigan, CRC Press. Ann Arbon, 1990.
13. Короткова Е.И. Вольтамперометрический метод определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и природного происхождения: автореф. дис. ... д-ра хим. наук. Томск, 2009.
Поступило в редакцию 4 февраля 2010 г.
После переработки 26 апреля 2010 г.
