CC BY
1176
УДК 577.175.6:547.999.3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ В ПРОДУКТАХ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
© П.А. Федина, А.Я. Яшин , Н.И. Черноусова
НПО «Химавтоматика», ул. Сельскохозяйственная, 12А, Москва, 129226 (Россия) e-mail: [email protected]
Указана важность установления антиоксидантов в основных пищевых продуктах и напитках с целью использования их для своевременной антиоксидантной терапии. Представлены результаты определения суммарного содержания антиоксидантов в продуктах растительного происхождения (экстрактах лекарственных трав, чае, кофе, винах, коньяках, бальзамах, пиве, овощах, фруктах, ягодах) амперометрическим методом.
Ключевые слова: окислительный стресс, антиоксидантная терапия, амперометрическое детектирование, природные антиоксиданты.
Введение
В условиях постоянного стресса, ухудшения экологической обстановки, потребления некачественной пищи, ультрафиолетового облучения, роста социальных заболеваний (курение, алкоголизм, наркомания) организм человека может подвергаться разрушающему действию свободных радикалов, что в конечном итоге может привести к развитию окислительного стресса. У человека окислительный стресс является причиной или важной составляющей многих серьезных заболеваний, таких как атеросклероз, онкологические заболевания, диабет, преждевременное старение.
Вредное воздействие окислительного стресса можно снять с помощью своевременной антиоксидантной терапии, т.е. путем потребления нормированного количества природных антиоксидантов. Наиболее перспективны для коррекции антиоксидантного статуса человеческого организма продукты растительного происхождения, богатые полифенолами, витаминами, каротиноидами и др., благодаря их широкому распространению, доступности, ценным свойствам, щадящим воздействием на организм (побочные эффекты развиваются реже и не так выражены, не возникает синдрома отмены) и сравнительно низкой токсичностью. В восточных странах народная мудрость гласит, что «нет такого растения, которое не являлось бы лекарственным, нет такой болезни, которую нельзя было бы вылечить растением».
В настоящей работе представлены результаты как суммарного содержания антиоксидантов в экстрактах лекарственных трав, чае, кофе, винах, коньяках, пиве, бальзамах, овощах, фруктах, ягодах, так и покомпонентного определения антиоксидантов в растительных объектах.
Экспериментальная часть
Определение суммарного содержания антиоксидантов в продуктах растительного происхождения проводилось на приборе «ЦветЯуза-01-AA» с амперометрическим детектированием (АД) [1]. Амперометрическое детектирование заключается в измерении электрического тока в ячейке, возникающего при окислении (восстановлении) анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода при подаче на него определенного потенциала. Таким образом, при применении АД регистрируется изменение тока, протекающего через ячейку, обусловленное изменением концентрации анализируемого вещества. Чувствительность амперомет-
* Автор, с которым следует вести переписку.
рического детектора очень высокая из-за малых величин шумов, порядка 10-12 А. В качестве материала рабочего электрода используется стеклоуглерод, который наиболее универсален при определении полифе-нольных соединений.
В работе [2] было указано, что электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов, в соответствии со следующими уравнениями:
Флавоноид-О-Н ^ флавоноид-О' + ё + Н+ (окисление при максимальном потенциале) Флавоноид-О-Н ^ флавоноид-О' + Н' (улавливание свободного радикала)
Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н., Н' состоит из ё + Н+. Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами [2] может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора. Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из 3-5 последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно применять следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин, мексидол, тролокс, галловую кислоту и др. Амперометрический прибор имеет ряд преимуществ при определении суммарного содержания антиоксидантов (ССА): без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут; анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени; правильность и воспроизводимость анализа обеспечиваются за счет точного дозирования шестиходовым краном; среднеквадратическое отклонение (СКО) дозирования краном - менее
0,5%; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 5%. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов - на уровне нано-пикограммов (10-9-10-12 г). Метод обладает высокой селективностью определения только антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению, другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их распознаванию. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов). Меняя величину приложенного потенциала, можно дифференцировать антиоксиданты по классам, дифференциация возрастает при применении имеющегося в приборе импульсного режима работы амперометрического детектора, кроме того, можно определять в автоматическом режиме вольтамперограммы для идентификации антиоксидантов.
Амперометрический метод - единственный непосредственно измеряющий содержание всех антиоксидантов в пробе. Другие методы - непрямые, в них измеряется ингибирование реакционных смесей (в частности, свободных радикалов), генерированных определенными реакциями. Метод восстановления Fe3+ до Fe2+ (метод FRAP (ferric reducing antioxidant power)) также может определять суммарно антиоксиданты, однако он не может определять все антиоксиданты, в частности, тиолы, так как их восстановительный потенциал значительно ниже потенциала превращения Fe3+ в Fe2+ [3].
АД хорошо коррелирует с известным методом ORAC (oxygen radical absorbance capacity), широко распространенным в США [4]. На большом массиве определений экстрактов ягод, овощей, фруктов коэффициент корреляции 0,96.
В литературе описаны и другие методы определения антиоксидантов [5-12].
Спиртовые экстракты лекарственных трав (70% спирт), чай, кофе, вина, коньяки, пиво, бальзамы, овощи, фрукты, ягоды были приготовлены согласно методике [13]. Анализировали водные заварки чая, кофе, водные экстракты овощей, фруктов и ягод, вина, коньяки, пиво и бальзамы - после предварительного разбавления.
Обсуждение результатов
В таблице 1 представлены результаты измерения ССА в экстрактах лекарственных трав. В качестве стандарта во всех приведенных измерениях использовался кверцетин.
Среди изученных экстрактов лекарственных трав наибольшее содержание антиоксидантов у корня кровохлебки и шлемника байкальского фирмы «Алтай-Фарм», наименьшее - у корня одуванчика и почек сосны фирмы «Алтай-Фарм». Основной вклад в величину ССА лекарственных трав вносят флавоноиды, дубильные вещества, оксиароматические кислоты и др. Главные действующие вещества шлемника - флавоноиды,
в составе которых производные апигенина, лютеолина, скутелляреина, изоскутелляреина, картемидина и изокартемидина [14]. Кроме того, корни содержат дубильные вещества, эфирное масло, алкалоиды, пирокатехин и другие вещества. Установлено благоприятное влияние препаратов из корней на желчевыделительную функцию печени, а также антиаллергенное, антиастматическое и антисклеротическое действие. Г епато-защитнаяактивность растения объясняется антиокислительными мембраностабилизующими свойствами корней [15]. В экспериментах на животных показано, что настойка шлемника, применяемая совместно с циклофосфаном при опухолевых заболеваниях, регулирует стрессорную реакцию и уровень лейкоцитов в крови, одновременно ингибирует образование метастазов [16]. Работами японских исследователей установлено, что препараты флавоноидов шлемника байкальского проявляют противовоспалительное, антитромби-ческое и антибактериальное действие [17]. В корнях кровохлебки содержатся галловая, эллаговая и щавелевая кислоты, пигменты, следы эфирного масла, галлотаниды, щавелевокислый кальций, витамин С, каротин, сапонин сангвисорбин, стерины. В листьях обнаружены эфирное масло и аскорбиновая кислота - до 1,8%. Экспериментальные исследования показали, что экстракт из корней кровохлебки при местном применении обладает противовоспалительным и сосудосуживающим свойствами, а при использовании внутрь тормозит перистальтику кишечника.
В работе [18] измерены значения ССА сухих экстрактов наиболее известных лекарственных средств и кореньев. Рейтинг выглядит следующим образом: кора крушины > кора дуба > крапива > лапчатка > кора ивы > шиповник > пустырник > подорожник > чага > солодка > боярышник > эхинацея >элеутерококк > зверобой > календула > расторопша > корни алтея > термопсис.
ССА различно в разных частях лекарственных растений (листья, плоды, корни) (табл. 2).
В таблице 3 приведены результаты ССА в зеленом и черном чае.
Полученные данные свидетельствуют о том, что по величине ССА зеленый чай превосходит черный в несколько раз. Это связано с присутствием катехинов в больших количествах, особенно в зеленом чае. В последние годы появились многочисленные научные публикации о предотвращении и подавлении онкологических заболеваний полифенолами чая [19-20], в частности катехинами зеленого чая [21-22], теафлавинами черного чая. ССА чая зависит от условий выращивания и технологии переработки чайного листа.
Таблица 1. Суммарное содержание антиоксидантов
в лекарственных растениях, производимых ООО «Алтай-Фарм», Барнаул
Название лекарственного растения ССА, мг/г
Кровохлебка(корень) 68,9
Шлемник байкальский 60,2
Мать-и-мачеха 18,9
Осина (кора) 18,6
Зверобой 17,5
Солодка (корень) 14,2
Календула (цветки) 13,1
Валериана 8,6
Шалфей (лист) 7,3
Сосна (почки) 4,1
Одуванчик (корень) 3,2
Таблица 2. Суммарное содержание антиоксидантов в лекарственных растениях
Название лекарственного растения ССА, мг/г
Листья мяты 29,6
Корневища мяты 19,5
Плоды бузины черной 26,6
Цветки бузины 10,8
Корни чистотела 18,0
Трава чистотела 10,7
Корневища эхинацеи 16,7
Трава эхинацеи 10,9
Плоды калины 14,2
Побеги калины 10,7
Соплодия хмеля 13,1
Листья хмеля 10,1
Листья крапивы 6,3
Корневища крапивы 1,7
Плоды лимонника 6,4
Таблица 3. Суммарное содержание антиоксидантов в зеленом и черном чае
Наименование зеленого чая ССА, мг/г Наименование черного чая ССА, мг/г
Alokozay, Дубай 171,2 Heyleys, Шри Ланка 109,4
Azercay, Азербайджан 133,2 Alokozay, Дубай 102,1
Merlin, Шри Ланка 126,8 Akbar, Шри Ланка 51,0
Ахмад, Шри Ланка 116,0 Riston Premium, Шри Ланка 43,0
Серебристые реснички, Китай 84,4 Черный байховый, Вьетнам 28,0
Чайный напиток представляет собой сложную комбинацию веществ, оказывающую многоплановое и в целом благотворное воздействие на организм человека. Общее число химических соединений, определенных в чае, составляет около 2000, некоторые из них еще не идентифицированы, а биохимическая роль из известных определена лишь в общих чертах, поэтому большое значение играет покомпонентное определение антиоксидантов чая. На рисунке 1 приведена хроматограмма антиоксидантов зеленого чая, полученная на приборе «ЦветЯуза-01» с амперометрическим детектором. В препаративном варианте ВЭЖХ катехины можно выделять в чистом виде.
ССА в кофе основных производителей приведено в таблице 4. Основные антиоксиданты кофе - хлорогеновая, кофейная, феруловая, и-кумариновая кислоты. Обжаривание зерен кофе уменьшает ССА. Употребление 2-3 порций обжаренных сортов кофе обеспечивает дневную норму потребления антиоксидантов.
Японские ученые отметили, что чашка кофе каждый день снижает риск заболевания раком печени, болезнью Паркинсона и одной из разновидностей диабета. Вместе с тем врачи напоминают, что неумеренное потребление кофе приводит к сердечным заболеваниям, бессоннице, высокому давлению.
В таблице 5 и 6 приведено ССА в различных винах и коньяках.
Были исследованы более 60 сортов красных и белых вин из разных стран (Франция, Чили, ЮАР, Аргентина, Македония, Румыния, Австрия, Грузия, Украина и др.). Общее содержание антиоксидантов в натуральных красных винах колебалось в пределах 100-240 мг/100 мл, в белых - в 5-10 раз меньше. Высокое содержание полифенольных соединений в красных винах связано с тем, что в процесс ферментации виноградного сока включается кожица ягод и виноградные косточки. Можно предположить, что вина с ССА менее 50 мг/100 мл либо могут быть поддельными, либо долгое время были открыты и тем самым доступны кислороду воздуха. На жидкостном хроматографе «ЦветЯуза-01» с АД выбраны оптимальные условия прямого определения ресвератрола (рис. 2). Содержание его коррелирует с ССА. Проведенные исследования показывают, что предложенные измерения можно использовать для оценки качества и подлинности вин.
Одним из критериев качества и подлинности коньяков является содержание в них, с одной стороны, сиреневого и ванилинового альдегидов, а с другой - суммы антиоксидантов. С этой целью проведен большой объем измерений на жидкостном хроматографе «ЦветЯуза-01» с амперометрическим детектором (рис. 3). Были исследованы более 50 сортов коньяков из разных стран (Франция, Молдова, Грузия, Украина, Россия, Словения и др.) разной выдержки. Общее содержание антиоксидантов колебалось в пределах 2-40 мг/100 мл. Количество антиоксидантов, в основном полифенолов (флавоноиды и оксиароматические кислоты), в коньяках зависит от качества исходного коньячного спирта и времени выдержки в дубовых бочках. Можно предположить, что коньяки с ССА менее 5 мг/100 мл либо могут быть поддельными, либо коньяк или исходный коньячный спирт долгое время были открыты, доступны кислороду воздуха.
Бальзамы и эликсиры обладают высоким содержанием антиоксидантов, что демонстрируют результаты, приведенные в таблице 7.
Лучшие сорта пива имеют ССА, только в 3 раза хуже, чем красные вина. ССА пива связано с хмелем, в котором содержится значительное количество пренилированных флавоноидов. Темные сорта пива имеют более высокое значение ССА. В производстве часть флавоноидов убирают из пива, так как избыточное содержание флавоноидов приводит к его помутнению. В последние годы в Г ермании разработана новая технология, которая позволяет сохранять в пиве высокое содержание полифенолов. Следует ожидать в ближайшие годы новых сортов пива с повышенным содержанием антиоксидантов. Уже появился сорт «Ксант» с добавкой ксантогумола, пренилированного флавоноида.
Таблица 4. Cуммaрное содержание антиоксидантов в кофе
Наименование CCA, мг/г ССА, мг/7г (порция на чашку)
Марагаджип 32,1 224,7
Гватемала
Бразилия 30,8 215,6
Колумбия 30,5 213,5
Кения 27 189,0
Ява 21,1 147,7
Рис. 1. Хроматограмма компонентов зеленого чая (время заварки 5 мин)
Таблица 5. Cуммaрное содержание антиоксидантов в красных винах
Таблица 6. Cуммaрное содержание антиоксидантов в коньяках
Наименование Производитель CCA, мг/100 мл
Дон Єегундо Агрикола Канталехос, 216
Чили
Єанрайз Мерло Vina Concha y Toro, Чили 192
Мерло-Каберне Кейптаун, Южная Африка 159
Cuvee Speciale Франция 157
Малбек Тесоро Аргентина 149
Рис. 2. Хроматограмма: транс-и цис-ресвератролы в сухом красном вине (разбавлено в 10 раз)
Наименование Производитель CCA, мг/100 мл
Guerin Freres «Мерле и сын», Франция 41
Варцихе АО «Давид Сараджишви- 33
ли и Энисели», Грузия
Российский ЗАО «Новокубанское», 30
РФ, Краснодарский край
Кутузов Москва (Коктебель) 27
Арманьяк «Janneau ^аппеаи S.A.», Франция 19
V.S.O.P.», 7 лет
Рис. 3. Хроматограмма ванилина и сиреневого альдегида в коньяке
В таблицах 8-10 приведено CCA в свежевыжатых соках фруктов, ягод и овощей. CCA этих продуктов зависит от их сорта, места произрастания и времени хранения.
Мощные антиоксиданты - антоцианы. Они содержатся во фруктах, овощах, ягодах, а также в листьях, цветках и корнеплодах многих растений. Молекулы антоцианов имеют полосу поглощения в видимой области, в основном в диапазоне 450^550 нм. В НПО «Химавтоматика» разработан детектор «Омега-Вид», позволяющий за 0,1^0,2 секунды зарегистрировать сигналы одновременно на 5^6 длинах волн в вышеуказанном диапазоне. В инжекционно-проточной системе этот детектор позволяет определять суммарное содержание антоциа-нов, а в жидкостном хроматографе «ЦветЯуза» селективно регистрировать разделенные антоцианы. ^ответ-ствующие хроматограммы антоцианов в ягодах брусники и клюквы приведены на рисунках 4 и 5.
Таблица 7. Суммарное содержание антиоксидантов Таблица 8. Суммарное содержание антиоксидантов
в бальзамах в фруктовых соках
Название ССА, мг/мл Наименование ССА, мг/100 г
Первопрестольный 2,83 Сок яблока (Семиренко) 57
Иммунал 1,67 Сок груши 50
Иремень 0,79 Сок киви 45
Великий Устюг 0,44 Сок нектарина 17
Рижский 0,22 Сок банана 7
Таблица 9. Суммарное содержание антиоксидантов в ягодных соках
Наименование ССА, мг/100 г
Сок черной смородины 765
Сок черной вишни 572
Сок черники 291
Сок лесной клубники 210
Сок сливы 18
Таблица 10. Суммарное содержание антиоксидантов в овощных соках
Наименование ССА, мг/100 г
Сок свеклы 217
Сок красного сладкого перца 188
Сок репы 135
Сок помидора 64
Сок моркови 19
Рис. 4. Хроматограмма антоцианов брусники
Рис. 5. Хроматограмма антоцианов клюквы
Выводы
Приведены результаты определения антиоксидантов в экстрактах лекарственных трав, чае, кофе, винах, коньяках, пиве, бальзамах, овощах, фруктах, ягодах. Значения суммарного содержания природных антиоксидантов в основных пищевых продуктах и напитках позволяют рекомендовать их для индивидуальной ан-тиоксидантной терапии, а также для создания новых напитков и пищевых продуктов с повышенной антиок-сидантной активностью. Предложено использовать содержание антиоксидантов для оценки подлинности виноградных вин, коньяков.
Список литературы
1. Яшин Я.И., Рыжнёв В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова Н.И. Природные антиоксиданты - надежная защита человека от опасных болезней и старения. М., 2008. С. 122.
2. Peyrat-Maillard M.N., Bonnely S., Berset C. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by cou-lometric detection // Talanta. 2000. V. 51. Pp. 709-716.
3. Halvorsen B.L., Holte K., Myhrstad M.C.W. e.a. A systematic screening of Total Antioxidants in dietary plants // J. Nutr. 2002. V. 132. Pp. 461-471.
4. Nemzer B.V., Yashin A.Ya., Yashin Ya.I., Chernousova N.I. Comparison of the study of the antioxidant activities of fruits and vegetables by oxygen radical absorbance capacity and amperometric methods // 4-th International Conference on Polyphenols Application. From Source to optimal industrial uses: State-of-the-art and future trends. Malta. Pp. 87.
5. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Методы исследования антиоксидантов // Химия растительного сырья. 2004. №3. C. 63-95.
6. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом // Журнал аналитической химии. 2001. Т. 56. №6. С. 627-629.
7. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. Электрогенерированный бром -реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2002. Т. 68. №9. С. 12-15.
8. Брайнина Х.З., Иванова А.В., Шарафутдинова Е.Н. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии // Известия высших учебных заведений // Пищевая технология. 2004. №4. C. 73-75.
9. Короткова Е.И. Новый способ определения активности антиоксидантов // Журнал физической химии. 2000. Т. 74. №9. С. 1544-1546.
10. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Shevchuk A.V. Study of antioxidant properties by voltammetry // Journal of Electro-analytical Chemistry. 2002. V. 518. N1. Pp. 56-60.
11. Короткова Е.И., Аврамчик О.А., Юсубов М.С., Белоусов М.В., Андреева Т.И. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии // Химикофармацевтический журнал. 2003. Т. 37. №9. С. 63-65.
12. Лапин А.А., Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Бердник И.В., Кочева Л.С., Мусин Р.З., Магдеев И.М. Антиокси-дантные свойства продуктов растительного происхождения // Химия растительного сырья. 2007. №2. С. 79-83.
13. Свидетельство № 31-07 об аттестации МВИ. Методика выполнения измерений содержания антиоксидантов в напитках и пищевых продуктах, биологически активных добавках, экстрактах лекарственных растений амперометрическим методом, разработанная ОАО НПО «Химавтоматика», аттестованная в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 / Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы». Дата выдачи 4 мая 2007 г.
14. Tsuyoshi T. et al. The flavonoids constituents from the roots of Scutellaria baicalensis // Yakugaku Zasshi. 1982. V. 102. N4. Pp. 388-391.
15. Ажунова Г.А. и др. Фармакотерапия экспериментального гепатита экстрактом шлемника байкальского // Вторая респ. конф. по мед. ботанике. Киев, 1988. С. 332-333.
16. Разина Т.Г. Шлемник байкальский как корректор цитостатической химиотерапии опухолей (экспериментальное исследование): автореф. дис. ... канд. биол. наук. Томск, 1988. 18 с.
17. Kubo et al. Antiarthritic and anti-inflammatory actions of mothanolic extract and flavonoid compounds from Scutellaria radix // Chem. pharm. Bull. Tokyo, 1984. V. 32. №7.
18. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П. Новый прибор для определения природных антиоксидантов. М., 2005. 100 c.
19. Ahmad N., Katiyar S.K., Mukhtar H. Предотвращение рака полифенолами чая. С. Ionnides (Ed) Nutrition and chemical toxicity, Wiley, West Sussex, VK, 1998. Pp. 301-343.
20. Katiyar S.K., Mukhtar H. Tea in chemoprevention of cancer: epidemiologic and experimental studies // Int. J. Oncol. 1996. V. 8. Pp. 221-238.
21. Fujiki H. e.a. Cancer inhibition by green tea // Mutat. Res. 1998. V. 402. Pp. 307-310.
22. Weisburger J.H. Tea and health // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. V. 220. Pp. 271-275.
Поступило в редакцию 8 мая 2009 г.
После переработки 30 октября 2009 г.
