Экспрессия и внутриклеточная локализация параоксоназы 2 в опухолевых клетках различного типа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.112.7

Экспрессия и внутриклеточная локализация параоксоназы 2 в опухолевых клетках различного типа

М. И. Шахпаронов, Н. В. Антипова, В. О. Шендер, П. В. Шнайдер, Г. П. Арапиди, Н. Б. Пестов, М. С. Павлюков*

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

*E-mail: marat.pav@mail.ru

Поступила в редакцию 07.12.2017

Принята к печати 05.06.2018

РЕФЕРАТ Белок PON2 принадлежит к семейству параоксоназ - лактонгидролизующих ферментов с различной субстратной специфичностью. В отличие от других членов этого семейства, PON2 обладает выраженной антиоксидантной активностью, локализуется преимущественно внутри клетки и экспрессируется практически во всех типах тканей человека. Ранее предполагалось, что основная функция параоксоназ заключается в защите организма от таких патогенов, как Pseudomonas aeruginosa. Однако последние данные говорят о важной роли PON2 в предотвращении окислительного стресса и апоптоза, а также в опухолевых клетках. В данной работе мы впервые провели биоинформатический анализ данных секвенирования РНК и ДНК в образцах опухолей, полученных более чем от 10 000 пациентов, и сравнили экспрессию и мутации гена PON2 более чем в 30 типах злокачественных новообразований. Кроме того, изучена внутриклеточная локализация PON2 в различных опухолевых клеточных линиях и, наконец, с помощью масс-спектрометрии определены белки, способные взаимодействовать с PON2 в раковых клетках. Полученные нами результаты говорят о том, что высокий уровень экспрессии PON2 является значимым диагностическим признаком многих видов солидных опухолей, а также позволяют предположить, что PON2, локализованная на ядерной мембране и эндоплазматическом ретикулуме, играет важную роль в защите опухолевых клеток от неблагоприятных воздействий, таких, как противоопухолевая терапия.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА апоптоз, белок-белковые взаимодействия, глиобластома, параоксоназа, рак.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ PON2 - параоксоназа 2; TCGA - The Cancer Genome Atlas; а.о. - аминокислотный

остаток.

ВВЕДЕНИЕ

Семейство параоксоназ включает три фермента -PON1, PON2 и PON3. Филогенетический анализ этих белков показал, что PON2, по-видимому, является самым древним представителем этой группы, от которого позднее в ходе эволюции произошли PON1 и PON3 [1]. Все эти параоксоназы обладают выраженной лактоназной активностью, однако отличаются друг от друга субстратной специфичностью. Кроме того, параоксоназы различаются по профилю экспрессии. Так PON1 и PON3 синтезируются на высоком уровне в печени и секретируются в плазму крови в комплексе с липопротеинами высокой плотности. В отличие от них, PON2 экспрессируется фактически во всех тканях человека и находится преимущественно внутри клетки. Интересно отметить, что в некоторых типах клеток основная функция PON2 связана именно с его антиоксидантной активностью [2]. Так, PON2 значительно снижает продукцию супероксид-ио-

нов, взаимодействуя с первым и третьим комплексом электрон-транспортной цепи на внутренней митохон-дриальной мембране, а также ингибирует перекис-ное окисление липидов плазматической мембраны [3]. Важно отметить, что антиоксидантная активность РО^ не зависит от лактоназной активности [4].

Детальные исследования структуры показали, что РО^ имеет массу около 40 кДа, содержит два сайта гликозилирования, короткий внутриклеточный участок (1-5 а.о.), трансмембранный домен из одной альфа-спирали (6-24 а.о.), а также гидрофобный участок (67-81 а.о.) и ферментативный домен (168-246 а.о.), расположенные с наружной стороны клеточной мембраны. Благодаря трансмембранному домену в процессе трансляции РО^ встраивается в липидный бислой и распределяется между эн-доплазматическим ретикулумом, перинуклеарной областью, митохондриями и плазматической мембраной. Однако данные о преимущественной лока-

лизации PON2 внутри клетки достаточно противоречивы [3, 5-7].

В настоящее время интерес к параоксоназе 2 существенно возрос, поскольку установлено, что она связана с прогрессией злокачественных новообразований. За последний год описана важная роль PON2 в опухолевых клетках. Так, показано, что PON2 способствует росту и метастазированию рака поджелудочной железы, стимулируя захват глюкозы [8], также ускоряет пролиферацию и устойчивость клеток рака мочевого пузыря к окислительному стрессу [9], защищает от апоптоза клетки глиобластомы [10] и понижает чувствительность к радиотерапии клеток карциномы ротовой полости [11]. Однако точная роль PON2 в других видах опухолей пока не установлена.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток

Различные клеточные линии культивировали в СО2-инкубаторе в среде DMEM с 10% фетальной сыворотки коровы, 2 мМ L-глутамина и смеси пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Для трансфекции использовали Lipofectamin LTX (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки трижды промывали фосфатным буфером (ФСБ) и фиксировали 4% раствором формальдегида в ФСБ при комнатной температуре в течение 15 мин. После фиксации клетки 2 раза промывали ФСБ и инкубировали с пермеабилизирующим буфером (0.2% Triton X100 в ФСБ) в течение еще 15 мин. Далее в лунки на 30 мин добавляли 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в буфере ФСБТ (0.1% Tween 20 в ФСБ). После этого клетки инкубировали с раствором антител к PON2 (разведение 1 : 200; HPA029193, Sigma) или к CRM1 (разведение 1 : 200; NB100-79802, Novus Biologicals) в ФСБТ в течение 1 ч. Затем клетки промывали 5 раз ФСБТ и инкубировали еще 1 ч с раствором вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 555 (разведение 1 : 500; A32732, Thermo Fisher Scientific), в буфере ФСБТ. Для отмывки не связавшихся антител клетки промывали ФСБТ еще 6 раз. После этого, отобрав из лунок весь буфер, добавляли к клеткам раствор DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Через 10 мин клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

Создание плазмидных векторов

Фрагмент ДНК, кодирующий полноразмерный PON2, был амплифицирован с полученной ранее

плазмиды с помощью ПЦР с праймерами Bglii-PON2 (AAA AAG ATC TAT GGG GCG GCT GGT GGC-TGT G) и PON2-Sali (AAA AGT CGA CAG TTC ACA-ATA CAA GGC TCT GTG GTA), а затем клонирован в вектор pTurboGFP-N (Evrogen) или pTagRFP-C (Evrogen) по сайтам рестрикции Bglii и Sali. Полученные плазмиды были названы pTurboGFP-N-PON2 и pTagRFP-C-PON2 соответственно. Фрагмент ДНК, кодирующий 1-27 а.о. PON2, был амплифи-цирован с полученной ранее плазмиды с помощью ПЦР с праймерами Bglii-PON2 и PON2_rev2 (TAT-TGT CGA CAG TCG ATT TCT GAG TGC CA) и клонирован в вектор pTurboGFP-N по сайтам рестрикции Bglii и Sali, полученная плазмида была названа pTurboGFP-N-PON2-1. Фрагмент ДНК, кодирующий 1-83 а.о. PON2, был амплифицирован с полученной ранее плазмиды с помощью ПЦР с праймерами Bglii-PON2 и PON2_rev3 (AAT TGT CGA CCC TCC-AGG CTT ATC T) и клонирован в вектор pTurbo-GFP-N по сайтам рестрикции Bglii и Sali, полученная плазмида была названа pTurboGFP-N-PON2-2. Фрагмент ДНК, кодирующий 1-168 а.о. PON2, был амплифицирован с полученной ранее плазмиды с помощью ПЦР с праймерами Bglii-PON2 и PON2_rev4 (ATT TGT CGA CAT GTC ATT CAC ACT TGG A) и клонирован в вектор pTurboGFP-N по сайтам рестрикции Bglii и Sali, полученная плазмида была названа pTurboGFP-N-PON2-3. Для экспрессии PON2 с последовательностью HALO-tag фрагмент ДНК, кодирующий HALO-tag, был амплифицирован с плазмиды pFC20K HaloTag T7 SP6 Flexi (Promega) с помощью ПЦР с праймерами Sali-Halo (AGG AGT-CGA CTG AGG ATC TGT ACT TTC A) и Halo-Noti (GAG GGC GGC CGC TTA ACC GGA AAT CTC CAG-AGT A) и клонирован в вектор pTurboGFP-N-PON2 по сайтам рестрикции Sali и Noti. В результате последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок, была заменена последовательностью, кодирующей HALO-tag. Полученная плазмида была названа pTurboHALO-N-PON2. Во всех случаях отсутствие мутаций, а также правильность лигиро-вания вектора и вставки подтверждали с помощью секвенирования.

Выделение белков, взаимодействующих с PON2

Клетки линии UB7-MG, культивируемые на 75 см2 матрасе, трансфицировали плазмидой pTurbo-HALO-N-PON2. Через 48 ч после трансфекции клетки диссоциировали раствором трипсина-Версена и дважды промывали холодным ФСБ. Далее клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1% Triton X100, 0.1% дезоксихолат натрия, 1 мМ PMSF, pH 7.5. Лизат центрифугировали в течение 15 мин при 15000 об/мин и 4°С. После этого PON2

вместе с взаимодействующими с ним белками выделяли с помощью магнитных частиц с иммобилизованным лигандом Halo-Tag (Promega) по инструкции производителя.

Трипсинолиз в растворе

Все фракции белков элюировали с магнитных частиц в 100 мкл денатурирующего буфера (8 M мочевины, 2 M тиомочевины, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5), после чего образцы инкубировали в течение 20 мин при 24°C. Концентрацию белка в каждом образце измеряли с помощью Quick Start Bradford protein assay (Bio-Rad Laboratories, США) по стандартному протоколу производителя (бычий сывороточный альбумин использовали в качестве стандарта). Далее для восстановления дисульфидных связей белков образцы инкубировали в растворе 5 мМ DTT (дитиотреито-ла) при 24°C в течение 30 мин, затем проводили ал-килирование, инкубируя образцы в растворе 10 мМ йодацетамида при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте. Алкилированные образцы разбавляли раствором 50 мМ бикарбоната аммония в соотношении 1 : 4; добавляли раствор трипсина (0.01 мкг трипсина на 1 мкг белка) и инкубировали их при 37°C в течение 12 ч. После проведения гидролиза реакцию останавливали, добавляя муравьиную кислоту до ее концентрации в растворе 5%. Далее триптические пептиды обессоливали с использованием микроколонок Discovery DSC-18 (пробирки объемом 1 мл, с допустимой нагрузкой 50 мг) (Sigma-Aldrich, США), высушивали в вакуумном испарителе и хранили при -80°C до проведения LC-MS/MS-анализа.

LC-MS/MS-анализ

Анализ проводили на масс-спектрометре TripleTOF 5600 + , оснащенном источником ионов NanoSpray III (ABSciex, Канада) и совмещенном с нанопоточ-ной хроматографической системой NanoLC Ultra 2D+ (Eksigent, США). Буфер для нанесения образца и буфера А содержал: 98.9% воды, 1% метанола, 0.1% муравьиной кислоты (об/об). Буфер В представлял собой смесь 99.9% ацетонитрила и 0.1% муравьиной кислоты (об/об). Пептиды разделяли на колонке 3C18-CL-120 (Eksigent, ublin, США) при скорости потока 300 нл/мин в линейном повышающемся градиенте буфера В (от 5 до 40% в течение 90 мин). Для идентификации пептидов использовали зависимый от данных режим работы масс-спектрометра (IDA). Каждый цикл включал один обзорный MS1-спектр с последующими 50 зависимыми MS2-спектрами. В MS1-анализе использовали следующие параметры работы прибора: диапазон масс для анализа и последующего отбора ионов для фрагментационного анализа - 300-1250 m/z, время накопления

сигнала 250 мс. Ионы для MS2-анализа выбирали на основании интенсивности ионного тока с пороговым значением 200 импульсов в секунду и зарядом от +2 до +5. В MS2-анализе использовали следующие параметры: разрешение квадруполя UNIT (0.7 Да), диапазон масс 200-1800 m/z, оптимизация фокусировки ионного пучка для получения максимальной чувствительности (разрешение ~20000), время накопления сигнала 50 мс для каждого иона. Раствор триптического гидролизата ß-галактозидазы (20 фмоль) использовали с 15-минутным градиентом (5-25% буфера B) для калибровки масс-спектрометра и контроля производительности, стабильности и воспроизводимости системы.

Анализ LC-MS/MS-данных

Данные были конвертированы в mgf-файл с помощью программы ProteinPilot (version 4.5). С этой целью программа ProteinPilot была запущена в режиме идентификации со следующими параметрами: алки-лирование цистеинов йодацетамидом, гидролиз трипсином, прибор TripleTOF 5600 и поиск белков, детектируемых с порогом 95.0%, по базе данных SwissProt, таксон HomoSapiens (http://www.uniprot.org с 176397 элементами). Для более тщательной идентификации белков был сгенерирован список пиков, который проанализировали программами MASCOT (версия 2.5.1) и X! Tandem (CYCLONE, 2013.2.01) с использованием базы данных SwissProt, таксон HomoSapiens (версия 2013 03) Статистическую значимость идентификаций проверяли на основании поиска по реверсированной базе данных последовательностей белков (decoy reversed database). Допустимые отклонения от массы иона предшественника и фрагмента составляли 20 ppm и 0.04 Да соответственно. Использовали следующие параметры поиска по базе данных: допущение одного пропущенного сайта специфического расщепления трипсином, фиксированная модификация - карбамидометилирование (C), и динамическая модификация - окисление (M). Для программы X! Tandem были также выбраны параметры, позволяющие осуществлять быструю проверку аце-тилирования N-концевых остатков белков, потери молекулы аммиака N-концевых глутаминов пептидов или потери молекулы воды N-концевой глутами-новой кислоты пептидов. Результирующие файлы были загружены в программу Scaffold 4 (версия 4.2.1) для валидации и метаанализа. В качестве достоверно идентифицированных пептидов рассматривали компоненты, попадающие по уровню достоверности в массив идентификаций с Global FDR 5%. Список белков-предшественников составляли на основании списка достоверно идентифицированных пептидов (FDR 5%).

А

m со -ч

к о

5 ¡B

си £

* t

'¡и

« s

s §

^ ¡S

ч ц

х О

о VO с си

со f ¡

S о

и

о *

О

-fr -fr

MD о CN o со СЛ Ov CN m

C-S m o ■4- C-S •о о О c-s

■ T сл C-S m -— m СЛ -— •О m

ra s

CK X ra *— 5 X * *

р I 5 * Q * си т ra *

■Û и ^ си с си 0 ь u и cu с ь ra 5 I S J 3 * 3 X 0 с га р ) s T 0 с

с 1— и ra cu р ) s 5 i *

0 l_ m Ю s * ra * 0 ь m 0 0 i s Ч s ra р

0 X 0 ) X 0 I T cu 0 u с 0 ) s

cü cu T C-S ra X с 1_ 3 * X i_ i с 0 ь 0 |_ га 5 ZI р ra * р -fr Z I

0 5 i_ и 0 с ra CL ra с га cu I р cu с р CK

0 0 0 5 0 CK с

ra 5 ■ 0 i s 5 0 5 ra X 0 i s i Ï Ц X С ra С

i_ 0 I m 5 0 J р р ÍD 0 -fr 1_

ZI i ra b¿ 0

р ra * 0 С 0 X Zl р ra 0 i cu CR ГО I т 5 0 р

CK ra i .û с ra 5 0 * CK ra i Ч < 0 1-Ф С X

ra X Cü

s с X CR

ц 1_ и ГО

cu ra I

ь Cü со

0 I 0

р X t

> (ü а * и

m со c-s мэ

^r СЛ ra ra

z i

0 о

1 i s s

U ZI рр

ra ra

I cu

а ч

CK ra

5 °=

0 ra

E= if

¡5 °

СЛ 00

m s о ^ ^ m 4) CO CO 'Л О ^O Г\ CS СЛ es ^

ZI р

¡ Is

1 ë Í I H ' s

2 s

s О

J 4 a

га с

5 en О си s с С си

iE *

ГО >5

га ¡г

U

га

га га

5 5 о о

.s Ï i га

> s га с

CK CK

Q. ra

с i

О «

ь CU

s о.

и с

a i

X s

S * '

О- о

CU I

a cu

cu <

•о c-s о о

СЛ C-S сл o 00

СЛ

-— -— -— s ^— ra

* га 5

0 ь си С 5 0 S и си с си ь га 5 га * i— ra 5 0 i ra с

X .Û i— s ) s 5 0 CR S р cu 5

I 0 1- CR

■Û I р Ф ГО

с га i ч s m га и 0 t О I XI с

0 0 I cí го

s ь s I ф

р VO X ZI m Cß

? р OJ >

5 m ra 5 ra 0 ^

X 0 р

.û i ÍD

I р s J и

CK р

с ra

*

0

1

cu <

с

о

X

с

о

Рис.1.Относительный уровень экспрессии (А) и изменение числа копий (Б) гена PON2 в раковых опухолях различного вида. Результаты получены с помощью био-информатического анализа базы данных TCGA. В скобках указано число образцов каждого вида опухолей

Б

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Чтобы определить, в каких видах злокачественных опухолей PON2 может играть потенциально важную онкогенную роль, мы сравнили экспрессию этого белка в различных опухолях, используя результаты РНК-секвенирования, представленные в базе данных TCGA (The Cancer Genome Atlas). Проанализировав данные, полученные более чем от 10 000 пациентов

со злокачественными опухолями 31 вида, мы обнаружили, что наибольший уровень экспрессии РО^ наблюдается при раке печени и раке головного мозга (глиома, стадии 1-3 и глиобластома, стадия 4), а самый низкий уровень этого белка характерен для рака крови (миелоидного лейкоза и В-клеточной лимфо-мы) (рис. 1А). Вызваны ли наблюдаемые нарушения экспрессии РО^ мутациями в соответствующем

80

60

40

20

500

Глиобластома р = 0.02

сг-

Низкая (N=38) о Высокая (N=39) щ

а

т

и

ы В

1000 1500 Дни

2000

100 80 60 40 20 0

0

Глиома 2-й и 3-й стадии р = 0.02

- Низкая (N=387)

- Высокая (N=122)

2000 4000 6000

Дни

100

' , 80

60

40

20

0

Гепатоцеллюлярная карцинома р = 0.02

Низкая (N=262) ¡5 Высокая (N=97) о

е а

т

и

ы В

1000

2000 Дни

3000

4000

100 80 60 40 20 0

Острая миелоидная лейкемия р = 0.08

= Низкая (N=101) Высокая (N=49)

500 1000 1500 2000 2500 3000 Дни

0

0

0

0

Рис. 2. Кривые Каплан-Майера, показывающие выживаемость больных глиобластомой, глиомой (стадии 2 и 3), гепатоцеллюлярной карциномой и острым миелоидным лейкозом. По уровню экспрессии РО№ выделяли две группы пациентов. Результаты получены с помощью биоинформатического анализа базы данных TCGA. На графиках указано количество пациентов в каждой группе, а также значения р, определенные с помощью логарифмического рангового /-теста

гене? Чтобы понять это, мы проанализировали данные секвенирования геномной ДНК, рассчитывая выявить возможные амплификации или делеции этого гена в опухолях различного типа. Как видно из рис. 1Б, для глиобластомы характерна амплификация гена PON2, а для лейкоза, напротив, делеция. Такой результат хорошо согласуется с данными нашего анализа экспрессии PON2.

Чтобы оценить влияние PON2 на пролиферацию и устойчивость опухолевых клеток к терапии, мы проанализировали связь между уровнем экспрессии этого белка и выживаемостью пациентов с различными видами рака. Данные, представленные на рис. 2, убедительно показывают, что при раке печени, глиоме и глиобластоме высокий уровень РО^ коррелирует с плохим прогнозом для пациентов, в то время как при лейкозе наблюдается противоположная картина - повышенное количество параок-

соназы 2 является хорошим прогностическим фактором. Такие результаты полностью согласуются с нашими данными об уровне экспрессии и мутациях в гене PON2.

Отличительная клиническая особенность рака головного мозга - большая некротическая зона, возникающая в центре опухоли, объем которой зачастую может во много раз превышать количество живой опухолевой ткани [12]. Столь высокий уровень гибели раковых клеток связан с недостаточным кровоснабжением глиобластом и крайне ограниченным пространством для роста. По этой причине клетки глиобластомы постоянно находятся в условиях стресса, вызванного нехваткой питательных веществ и токсичными компонентами, выделяемыми соседними погибающими клетками. Аналогичная ситуация наблюдается в печени, так как именно в этот орган поступают потенциально опасные соединения из кро-

104 | АСТА ЫАТиИАЕ | ТОМ 10 № 3 (38) 2018

Л

Рис. 3. Имму-нофлуоресцент-ное окрашивание различных клеточных линий антителами на РО№ (А) и флуоресцентная микрофотография клеток, котранс-фицированных плазмидами pTagRFP-C-PON2 и pTurboGFP-N-PON2 (верхняя панель), или клеток, транс-фицированных плазмидой pTurboGFP-N-РО№, а затем окрашенных антителами на PON2 (нижняя панель) (Б)

Б

л -А

ви. Таким образом, можно предположить, что PON2 имеет крайне важное значение для клеток рака печени и мозга, так как помогает им приспособиться к существованию в среде с высокой концентрацией токсичных продуктов метаболизма и недостатком питательных веществ. Поэтому при развитии этих опухолей может происходить отбор клеток с повышенной экспрессией PON2, в том числе и благодаря амплификации соответствующего гена. Напротив, клетки рака крови существуют в благоприятной среде, богатой кислородом и питательными веществами, которая не содержит потенциально токсичных соединений. Вследствие этого они не нуждаются в высоком уровне PON2. По-видимому, наоборот, пониженное содержание PON2 способствует более агрессивному фенотипу таких опухолевых клеток.

Чтобы получить больше информации о функциях PON2 в опухолевых клетках, мы окрасили шесть клеточных линий (U87-MG - глиобластома; MRC5-V2 - эмбриональное легкое; SKOV3 - рак яичников; A549 - карцинома легкого; HepG2 - карцинома печени; HT1080 - фибросаркома) антителами

на этот белок. Наибольшую интенсивность окраски мы наблюдали в клетках глиобластомы и карциномы печени, что согласуется с данными биоинформа-тического анализа (рис. 3А). Во всех исследованных типах клеток PON2 локализовалась в области вокруг ядра. Поскольку качество иммуноцитофлуо-ресцентного окрашивания не позволяло точно определить локализацию PON2 в клетках, следующим шагом было изучение локализации экзоген-но-экспрессированной параоксоназы 2. С этой целью мы котрансфицировали клетки линии U87-MG плазмидами pTagRFP-C-PON2 (кодирует красный флуоресцентный белок, присоединенный к N-концу PON2) и pTurboGFP-N-PON2 (кодирует зеленый флуоресцентный белок, присоединенный к C-концу PON2), а также окрасили трансфицированные клетки антителами на PON2. Из рис. 3Б видно, что независимо от того, к какому концу PON2 был присоединен флуоресцентный белок, PON2 локализовался преимущественно вокруг ядра.

Для определения точной локализации PON2 мы окрасили трансфицированные клетки антитела-

Л

GFP PON2(1-27)-GFP PON2(1-83)-GFP PON2(1-168)-GFP

Рис. 4. Флуоресцентная микрофотография клеток, трансфицированных плазмидой pTurboGFP-N-PON2, а затем окрашенных антителами на CRM1 (А), и клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими различные участки РО№ (1-27 а.о.; 1-83 а.о.; 1-168 а.о.) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве контроля (Б)

Б

ми на CRM1 - маркер ядерной мембраны. Из рис. 4А видно, что вокруг ядра PON2 полностью колокали-зуется с CRM1. Это говорит о том, что существенная фракция PON2 в клетке расположена на ядерной мембране.

Далее мы попытались определить аминокислотную последовательность PON2, необходимую для локализации этого белка на ядерной мембране. С этой целью мы создали плазмиды, кодирующие три фрагмента PON2 (1-27 а.о.; 1-83 а.о.; 1-168 а.о.), несущие на своем N-конце зеленый флуоресцентный белок. Как видно из рис. 4Б, для локализации PON2 на ядерной мембране достаточно первых 27 аминокислот PON2, кодирующих трансмембранный сегмент.

В заключение определения внутриклеточных белков, взаимодействующих с PON2, мы использовали метод LC-MS/MS масс-спектрометрии. Мы транс-фицировали клетки плазмидой, кодирующей PON2 или контрольный белок с последовательностью Halo-tag на С-конце, и, используя магнитные частицы с лигандом для Halo-tag, выделили экзогенный PON2 и взаимодействующие с ним белки. Последующий LC-MS/MS-анализ позволил определить 286 белков, копреципитирующих с PON2. Из этих белков 168 обнаружены и в контрольном образце, а 119 взаимодействовали исключительно с PON2, но не с контрольным белком (таблица). Среди белков, уникально взаимодействующих с PON2, шесть локализовались на ядерной мембране (CACYBP, TMPO, S100A6, RAN, UBXN4, TOR1AIP1). Важно отметить, что у белка CACYBP идентифицировано наибольшее (за исключением PON2) количество пептидов, что может говорить о высокой интенсивности взаимодействия CACYBP и PON2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последний год опубликовано значительное количество работ, описывающих функции РО№ в нескольких типах раковых опухолей. Чтобы получить более общую информацию о роли этого белка в различных видах новообразований, мы впервые проанализировали экспрессию и мутации гена PON2 в злокачественных опухолях 31 типа, а также изучили связь между экспрессией РО^ и выживаемостью пациентов. Наибольшая экспрессия РО^ была выявлена в солидных опухолях, особенно при раке головного мозга и печени. Для этих опухолей также характерна амплификация гена PON2 и корреляция его экспрессии с плохим прогнозом для выживаемости пациентов. Напротив, гематологические опухоли характеризовались низким уровнем этого белка, делециями соответствующего гена и корреляцией экспрессии PON2 с хорошим терапевтическим прогнозом. Известно, что РО^ в клетке может выполнять разнообразные функции, такие, как расщепление лактонов, снижение продукции свободных радикалов в митохондриях и защита мембранных липидов от перекисного окисления. Основываясь на полученных нами результатах о локализации этого белка в клетке, а также о его взаимодействии с другими белками, можно предположить, что в опухолевых клетках основное количество РО^ защищает внутриклеточные мембраны от окисления, а также, возможно, не позволяет свободным радикалам проникнуть сквозь ядерную мембрану и повредить генетический материал клеток. Однако для более детального подтверждения такой гипотезы необходимы дальнейшие исследования. • Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 16-14-10335.

Список белков, копреципитирующихся с PON2

Ген MW N Ген MW N Ген MW N Ген MW N

PON2 39 9 RPS20 13 2 RPS18 18 1 SNU13 14 1

CACYBP 26 7 RPS7 22 2 RPL12 18 1 HNRNPD 31 1

RPS10 19 6 RPL11 20 2 RPL14 23 1 FKBP3 25 1

RPS19 16 6 RPL30 13 2 ADD3 74 1 PTRF 43 1

HSPA1A 70 6 NARS 63 2 AIDA 35 1 DHX15 91 1

PARP1 113 6 DTD1 23 2 CTNNBL1 65 1 PSME3 30 1

RPS5 23 5 EIF2S2 38 2 FLJ51636 12 1 DEK 43 1

EIF3A 75 5 EIF3G 36 2 CCDC124 26 1 DR1 19 1

EIF5 49 5 EXOSC2 33 2 COL12A1 333 1 S100A11 12 1

MANF 21 5 FARSLA 58 2 CSTB 11 1 S100A6 10 1

NELFE 43 5 GTF2F2 28 2 DCD 11 1 SEC61G 8 1

AHNAK 629 5 HDGF 27 2 MCM4 97 1 PTD004 20 1

FLJ20643 32 5 CDC37 44 2 DNAJC17 35 1 SARNP 24 1

ERP29 29 4 HYPK 15 2 DNAH10 515 1 SRSF1 28 1

EIF3J 29 4 IMPDH2 56 2 EEF1B2 25 1 SRSF3 19 1

EIF4B 69 4 TIMM8B 9 2 GTF2F1 58 1 STK10 112 1

FEN1 43 4 PYM1 23 2 GAPDHS 45 1 STK24 23 1

METAP1 43 4 CWC27 54 2 RAN 24 1 SARS 59 1

RPL9 22 3 PABPC1 71 2 HNRNPUL1 96 1 SNRPF 10 1

ATP5O 23 3 PTBP1 57 2 HIST1H2AB 14 1 CWC15 27 1

DNAJB1 38 3 PAWR 37 2 HIST1H4A 11 1 STMN1 17 1

HNRNPA1 39 3 PDIA3 57 2 IGF2BP1 63 1 TOR1AIP1 66 1

KRT2 65 3 MAGOHB 17 2 ITIH3 100 1 TCEAL4 25 1

TMPO 75 3 PBDC1 26 2 LIMS1 38 1 TUBA1C 50 1

TIMM8A 11 3 SNRPB 25 2 ZFYVE28 96 1 PTPN1 50 1

PA2G4 45 3 TARS 83 2 MESDC2 26 1 YARS 59 1

FAM50A 40 3 NSUN2 86 2 METAP2 53 1 UBXN1 33 1

SKIV2L2 118 3 MRPS11 21 1 MAPRE1 30 1 UBXN4 57 1

TCEA1 34 3 RPS16 16 1 DNAJC19 12 1 HDLBP 141 1

RPS15 17 2 RPS17 16 1 NAA50 19 1

Примечание. Указано название гена (Ген), молекулярная масса белка в кДа (MW) и количество уникальных пептидов данного белка, идентифицированных с помощью LC-MS/MS масс-спектрометрии

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Costa L.G., de Laat R., Dao K., Pellacani C., Cole T.B., Furlong C.E. // Neurotoxicology. 2014. V. 43. P. 3-9.

2. Ng C.J., Wadleigh D.J., Gangopadhyay A., Hama S., Grijalva V.R., Navab M., Fogelman A.M., Reddy S.T. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 44444-44449.

3. Hagmann H., Kuczkowski A., Ruehl M., Lamkemeyer T., Brodesser S., Horke S., Dryer S., Schermer B., Benzing T., Brinkkoetter P.T. // FASEB J. 2014. V. 28. P. 1769-1779.

4. Altenhöfer S., Witte I., Teiber J.F., Wilgenbus P., Pautz A., Li H., Daiber A., Witan H., Clement A.M., Förstermann U., et al. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 24398-24403.

5. Aviram M., Rosenblat M. // Free Radic. Biol. Med. 2004. V. 37. P. 1304-1316.

6. Horke S., Witte I., Wilgenbus P., Krüger M., Strand D., Förstermann U. // Circulation. 2007. V. 115. P. 2055-2064.

7. Rothem L., Hartman C., Dahan A., Lachter J., Eliakim R., Shamir R. // Free Radic. Biol. Med. 2007. V. 43. P. 730-739.

8. Nagarajan A., Dogra S.K., Sun L., Gandotra N., Ho T., Cai G., Cline G., Kumar P., Cowles R.A., Wajapeyee N. // Mol. Cell. 2017. V. 67. P. 685-701.

9. Bacchetti T., Sartini D., Pozzi V., Cacciamani T., Ferretti G., Emanuelli M. // Oncotarget. 2017. V. 8. P. 28785-28795.

10. Tseng J.H., Chen C.Y., Chen P.C., Hsiao S.H., Fan C.C., Liang Y.C., Chen C.P. // Oncotarget. 2017. V. 8. P. 14666-14679.

11. Krüger M., Amort J., Wilgenbus P., Helmstädter J.P., Grechowa I., Ebert J., Tenzer S., Moergel M., Witte I., Horke S. // Oncotarget. 2016. V. 7. P. 51082-51095.

12. Brat D.J., Castellano-Sanchez A.A., Hunter S.B., Pecot M., Cohen C., Hammond E.H., Devi S.N., Kaur B., van Meir E.G. // Cancer Res. 2004. V. 64. P. 920-927.