CC BY
1011. Saton M., Kuroda Y., Yoshida H. Induction of autoantibodies by adjuvants. J. Autoimmun. 2003, 21: 1-9.
12. Sayin B., Somavarapu S., Li W.X. TMC-MCC (N-trimethil chitosan-mono-N-carboxy- methyl chitosan) nanocomplexes for mucosal delivery of vaccines. Eur. J. Pharm. Sci. 2009, 38 (4): 362-369.
13. Shi J., Wen Zu., Guo J. Protective efficacy of H1N1 cold-adapted live vaccine against the pandemic H1N1, seasonal H1N1 cold-adapted live vaccine, seasonal H1N1, and H5N1 influenza viruses in mice. Antiviral Res. 2012, 93 (3): 346-353.
14. Tomlienovic L., Shaw C. Mechanism of aluminum adjuvant toxicity and autoimmunity in Pediatric populations. Lupus. 2012, 21 (2): 223-230.
15. Whitehouse M. Oily adjuvants and autoimmunity: now time for reconsideration? Lupus. 2012, 21 (2): 217-222.
16. Wu Y, Wei W., Zhou M. Thermal-sensitive hydrogel as adjuvant-free vaccine delivery system for H5N1 intranasal immunization. Biomaterials. 2012, 7: 2351-2360.
17. Zafrir Y, Agmon-Levin N., Paz Z. Autoimmunity following Hepatitis B vaccine as part of the spectrum of autoimmune (auto-inflammatory) syndrome induced by adjuvants (ASIA): Analysis of 93 cases. Lupus. 2012, 21 (2): 146-152.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Ляшенко Всеволод Андреевич, д.м.н., проф.,
105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495)674-01-99
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Л.В.Шибина1, О.А.Свитич1, Л.И.Краснопрошина1, С.А.Сходова1, И.М.Ордиянц2, И.В.Бишева1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ TLR2 И TLR9 ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЦЕРВИКАЛЬНОГО КАНАЛА У ЖЕНЩИН С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ОРГАНОВ МАЛОГО ТАЗА
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Российский государственный университет дружбы народов, Москва
Цель. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов крови и уровень экспрессии генов TLR2 и эпителиальными клетками слизистой оболочки цервикального канала у женщин репродуктивного возраста с воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ) в стадии обострения и в период ремиссии. Материалы и методы. Проведено клинико-лабораторное и гинекологическое обследование 105 женщин, и по полученным результатам сформированы 3 группы: пациентки в стадии обострения ВЗОМТ; пациентки в стадии ремиссии; клинически здоровые женщины. С помощью ПЦР в режиме реального времени определяли уровень экспрессии генов TLR2, в эпителиальных клетках слизистой оболочки цервикального канала у женщин всех 3 групп. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови определяли методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител с маркерами CD45+ CD 3+ — ^клеток, CD45+ CD3+ CD4+ — Т-хелперов, CD45+, CD3+, CD8+ — Т-супрессоров-цитотоксических киллеров, CD45+, CD3-, CD16+, CD56+ — натуральных киллеров, CD45+, CD3-, CD19+ — В-лимфоцитов. Учет реакции иммунофлуоресценции проводили на проточном цитоф-луориметре «CYTOMICS FC 500» (Becton Coulter,USA). Результаты. Установлено, что уровень экспрессии гена TLR2 в исследуемых группах больных статистически значимо не отличался от показателей в группе сравнения, хотя следует отметить, что данный показатель у женщин с ВЗОМТ в стадии обострения (возбудители инфекционного процесса — уреаплазма, стафилококк, кандида) был несколько выше, чем в группе сравнения.
Выявлено, что достоверно высокий уровень экспрессия гена TLR9 в эпителиальных клетках слизистой цервикального канала коррелировал с наличием инфекционных возбудителей. В группе женщин с обострением инфекционного процесса экспрессия гена TLR9 была увеличена в 14,5 раза по сравнению с группой женщин без ВЗОМТ. В группах женщин с ВЗОМТ не было выявлено достоверных различий по отношению к группе контроля в относительном и абсолютном уровне Т-лимфоцитов CD3+; Т-хелперов CD4+, Т-супрессо-ров CD8+ цитотоксических киллеров. Содержание В-лимфоцитов достоверно не различалось во всех группах. Заключение. Повышение уровня экспрессии гена TLR9 в клетках цервикального канала женщин с ВЗОМТ может служить дополнительным диагностическим признаком наличия и степени выраженности заболевания.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 68—72
Ключевые слова: условно патогенная микрофлора, воспалительные заболевания органов малого таза, TLR2, TLR9, субпопуляция лимфоцитов
L.V.Shibina1, O.A.Svitich1, L.I.Krasnoproshina1, S.A.Skhodova1, I.M.Ordiyants2, I.V.Bisheva1
EXPRESSION OF TLR2 AND TLR9 GENES BY EPITHELIAL CELLS OF CERVICAL CANAL MUCOUS MEMBRANE IN WOMEN WITH INFLAMMATORY DISEASES OF SMALL PELVIS ORGANS
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 2Russian University of Peoples' Friendship, Moscow, Russia
Aim. Determine subpopulation composition of blood lymphocytes and the level of expression of TLR2 and TLR9 by epithelial cells of cervical canal mucous membrane in women of reproductive age with inflammatory disease of small pelvis organs (IDSPO) at exacerbation stage and remission period. Materials and methods. Clinical-laboratory and gynecological examination of 105 women was carried out and 3 groups were formed based on the results: patients at IDSPO exacerbation stage; patients at remission stage; clinically healthy women. By using real time PCR, TLR2, TLR9 gene expression levels were determined in epithelial cells of cervical canal mucous membrane in women of all the 3 groups. Subpopulation composition of blood lymphocytes was determined by flow cytofluorimetry by using monoclonal antibodies with CD45+ CD3+ -T-cell, CD45+ CD3+ CD4+ -Т-helper, CD45+, CD3 + , CD8+ -Т-suppressors-cytotoxic killers, CD45 + , CD3-, CD16+, CD56+ natural killers, CD45+, CD3-, CD19+ -В-lymphocytes. Immune fluorescence reaction evaluation was carried out in flow cytofluorimeter Cytomics FC 500 (Becton Coulter, USA). Results. The level of expression of TLR2 gene in the studied groups of patients was established not to differ significantly from parameters in the comparison groups, however it should be noted that this parameter in women with IDSPO at exacerbation stage (causative agents of the infectious process — ureaplasma, staphylococcus, candida) was somewhat higher than in the comparison group. Significantly high level of TLR9 gene expression in cervical canal epithelial cells was detected to correlate with the presence of infectious causative agents. In the group of women with exacerbation of the infectious process the expression of TLR9 was 14.5 times higher compared with the group of women without IDSPO. Among groups of women with IDSPO significant differences in relation to control group in relative and absolute levels of CD3 + T-lymphocytes; CD4+ T-helpers; CD8+ cytotoxic killer T-suppressors, B-lymphocytes compared with the same parameters in clinically healthy women were not detected. Conclusion. The increase of TLR9 gene expression level in cervical canal cells of women with IDSPO may serve as an additional diagnostic feature of the presence and degree of severity of the disease.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 68—72
Key words: opportunistic microflora, inflammatory diseases of small pelvis organs, TLR2, TLR9, lymphocyte subpopulation
ВВЕДЕНИЕ
В структуре гинекологической патологии воспалительные заболевания внутренних половых органов занимают ведущее место и составляют 55 — 65%. Они поражают молодых женщин до 40 лет [5, 11], ухудшая качество жизни, нарушая трудоспособность и специфические функции женского организма. Причиной воспалительных заболеваний органов малого таза в большинстве случаев являются возбудители инфекций, передаваемых половым путем. Известно несколько вариантов проявления влагалищного дисбактериоза: бактериальный вагиноз, урогенитальный кандидоз, мико- и уреаплазмоз, неспецифический вагинит [7, 9]. В последние десятилетия частое и бесконтрольное использование антибактериальной терапии системного и местного назначения приводит к формированию стойкого дисбактериоза влагалищного, кишечного и других биотопов, к возрастанию роли эндогенной инфекции в возникновении обострений хронических воспалительных заболеваний матки и ее придатков [2]. В то время как предупреждение, своевременное выявление и активное лечение воспалительных заболеваний внутренних половых органов у женщин репродуктивного возраста могут снизить частоту осложнений, вызываемых ВЗОМТ В настоящее время известно, что возбудители инфекционно-воспалительных заболеваний обладают способностью влиять на иммунологические механизмы, направленные на уничтожение и элиминацию этиологического агента. Знание иммунопатогенеза заболевания во многом определяет обоснованность использования и выбор иммунотропных препаратов во врачебной практике акушеров-гинекологов [3].
Система врожденного иммунитета включает клеточные компоненты (нейтрофи-лы, моноциты/макрофаги, базофилы, тучные клетки, эозинофилы, ЕК-клетки и др.) и гуморальные факторы (белки комплемента, белки острой фазы воспаления, цито-кины и др.) [4]. На сегодняшний день практически нет данных об распознающих структурах врожденного иммунитета — Toll-подобных рецепторах (Toll-like receptors — TLR) у женщин с ВЗОМТ. TLR специфичны к основным группам патогенов — грамположительным (TLR1, TLR2, TLR6 и др.) и грамотрицательным бактериям (TLR4), вирусам (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9), простейшим и грибам (TLR1, TLR2, TLR6) [8, 10]. Учитывая статистику ВОЗ последних лет о росте количества женщин, болеющих ВЗОМТ, продолжение изучения патогенетических механизмов, участия в них иммунной системы представляет большой интерес. Для оценки роли системного иммунитета в патогенетических механизмах ВЗОМТ оценили уровень субпопуляции лимфоцитов, для оценки роли местного иммунитета оценили уровень показателей TLR2, TLR9 у женщин с воспалительными заболеваниями органов малого таза репродуктивного возраста в стадии обострения и в период ремиссии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Общее количество пациентов составило 105 человек, из них 78 — женщины с ВЗОМТ (первая группа — ВЗОМТ в стадии обострения, 56 чел.; вторая группа ВЗОМТ в стадии ремиссии, 22 чел,) и 27 женщин — контрольная группа. Возраст пациенток варьировал от 19 до 45 лет. Обследуемые женщины являлись пациентками женской консультации № 157, где им проводили общеклиническое, клинико-лабораторные, гинекологическое обследования; УЗИ органов малого таза; ПЦР-диагностику хла-мидий, ЦМВ, ВПЧ 16, 18, ВПГ 1, 2. Бактериальные посевы отделяемого влагалища с целью выделения вида условно патогенных микроорганизмов, определения их количества и чувствительности к антибиотикам проводили в КВД № 3. Критериями отбора в контрольную группу служили отсутствие воспалительных и инфекционных (RW, ВИЧ, Hbs, HCV) заболеваний, аутоиммунной и эндокринной патологии. Определяли субпопуляционный состав лимфоцитов крови CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD72+ с помощью проточной цитофлуориметрии. Методика непрямой им-
Таблица 1. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови у женщин с ВЗОМТ и в группе контроля
Показатели Контроль (n=27) Стадия ремиссии (n=22) Стадия обострение (n=56)
Лейкоциты, тыс. в мкл. 6,3±0,04 6,0*±0,26 6,7*±0,13
Лимфоциты, % 30±1,1 29,2*±0,04 28,5*±0,5
Лимфоциты, абс. 2,0±0,1 1,85*±0,01 1,9*±0,01
CD3, % 72,5±2,3 66,0*±2,2 69,0*±0,5
CD3, абс. 1452±29,0 1490*±3,0 1503*±35,0
CD4, % 38,3±0,3 42,7*±0,4 40,1*±1,2
CD4. абс. 1005±31,0 1139*±12,4 1008*±5,8
CD8, % 37,8±0,7 35,4*±0,9 39,3*±0,6
CD8, абс. 820±5,3 706*±12,1 990*±24,6
ИРИ 1,5±0,3 1,9*±0,4 1,8*±0,3
CD16, % 14,5±0,03 16,1*±0,5 15,6*±0,3
CD16, абс. 290±0,9 308*±4,0 280*±8,4
CD72, % 14,9±2,1 11,9*±0,06 12,1*±0,9
CD72, абс. 308±12,5 232*±24,8 280*±3,1
Таблица 2. Уровень экспрессии генов TLR2 и в эпителиальных клетках слизистой оболочки цер-викального канала женщин с ВЗОМТ и в группе контроля
Показатели
TLR2**
TLR9*
Стадия обострения 50,12+22,30 0,87+0,32* Стадия ремиссии 25,12+9,67 0,08+0,21 Контроль 19,95+11,80 0,06+0,03
Примечание. * р<0,05 — значение статистически достоверно отличается от показателя в группе контроля; ** показатель представлен в (кол-во копий исследуемого гена) х105 относительно 106 копий гена Р-актина.
Примечание. *р>0,05 незначимы.
различия статистически
мунофлюоресценции для определения фенотипа лимфоцитов периферической крови с помощью моноклональных антител проводилась согласно [8]. Для исследования использовали кровь, взятую из кубитальной вены, в объеме 2 мл с гепарином (25 ед. гепарина на 1 мл крови). В каждой пробе анализировали 10 000 клеток. Уровень экспрессии генов TLR2 и TLR9 в эпителиальных клетках цервикального канала проводили с помощью метода ПЦР-РВ. Для этого выделяли РНК из эпителиальных клеток при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ). На следующем этапе проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора реагентов «ОТ-1» (Синтол, РФ). На последнем этапе ставили реакцию ПЦР-РВ. Последовательность праймеров и зондов TLR2 и TLR9 для реакции подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательность мРНК, полученную из электронной базы данных GenBank. Реакционную смесь готовили из реактивов «Набор для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия). Реакцию проводили в амплификаторе ДТ-96 (ДНК-технология, РФ). Изучение экспрессии исследуемого гена относительно экспрессии гена ß-актина человека проводили, используя «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК ß-актина человека» (Синтол, РФ). Анализ результатов осуществляли с использованием известных статистических методов. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel. Для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По полученным нами данным причиной ВЗОМТ в 70% случаев была инфекция бактериальной природы (30% — Ureaplasma urealyticum/parvum, 20% — Mycoplasma hominis, в остальных 20% — Candida albicans, Escherichia coli, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus; в 25% случаев микст-инфекция; в 5% случаев инфекционные агенты были вирусной этиологии (ЦМВ, ВПГ1, ВПГ2, ВПЧ высокого онкогенного риска).
Анализ показателей системного иммунитета свидетельствовал, что уровень субпопуляций лимфоцитов (Т-лимфоцитов CD3+, Т-хелперов СD4+, Т-киллеров СD8+ и В-лимфоцитов CD72+ у женщин с ВЗОМТ и у здоровых доноров статистически достоверно не отличался (р>0,05). Полученные данные представлены в табл. 1.
В результате анализа уровня экспрессии генов TLR2 и TLR9 у пациенток с ВЗОМТ и у здоровых женщин мы выявили прямую взаимосвязь степени повышения уровня экспрессии этих генов в группе с ВЗОМТ со степенью выраженности воспалительного процесса. В группе женщин с обострением ВЗОМТ экспрессия гена TLR9 была увеличена в 14,5 раза по сравнению с группой женщин без ВЗОМТ Было показано, что уровень экспрессии гена TLR2 в исследуемых группах статистически значимо не отличался от показателей в группе сравнения. Следует отметить, что данный показатель у женщин с ВЗОМТ в стадии обострения (возбудители — U. urealyticum/parvum, Staphylococcus, C. albicans) был несколько выше, чем в группе сравнения. Полученные данные приведены в табл. 2.
ОБСУЖДЕНИЕ
Можно сделать вывод, что для женщин с ВЗОМТ по сравнению с женщинами группы контроля характерно отсутствие нарушений в клеточном звене системного иммунитета. Проанализировав все полученные данные по локальному иммунитету, мы пришли к выводу, что повышение уровня экспрессии гена TLR9 в клетках цервикального канала у женщин с ВЗОМТ коррелировало с наличием инфекционных агентов. Повышение уровня TLR9 может быть использовано как дополнительный диагностический признак определения наличия и степени выраженности ВЗОМТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Буданов П.В., Стрижаков А.Н. Методы профилактики, лечения и подготовки женщин с нарушениями микроценоза влагалища к родоразрешению и гинекологическим операциям. Вопр. гинекол. акушер. перинатол. 2004, 3 (2): 39-42.
2. Логинов А.С., Парфенов А.И. Болезни кишечника. Руководство для врачей. М., Медицина, 2000.
3. Нестеров И.М., Тотолян А.А. Иммунокорригирующая терапия инфекционно-воспалительных заболеваний женской половой сферы. Санкт-Петербург, 2007.
4. Плужников М.С., Лавренова Г.В., Левин М.Я. и др. Иммунология хронического тонзиллита. В: Тонзиллит: клинические и иммунологические аспекты. СПб, Диалог, 2004.
5. Хрянин А.А., Решетников О.В., Кривенчук Н.А. и др. Распространенность хламидийной
и гонококковой инфекций в зависимости от сексуального поведения женщин. Акушер. гинекол. 2004, 4: 44-47.
6. Ярилин А.А., Климова С.В., Симонова А.В. и др. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. М., 2009.
7. Chaim W, Mazor M., Leiberman J.R. The relationship between bacterial vaginosis and preterm birth. A review. Archiv. Gynecol. Obst. Springer-Verlag, 1997, 259: 51-58.
8. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 2010, 11 (5): 373-384.
9. Lurie S., Woliovich I., Rotmensch S. еt al. Value of vaginal culture in management of acute vaginitis. Arch. Gynecol. Obstet. 2001, 265: 187-189.
10. Martin T.R., Frevert C.W. Innate immunity in the lungs. Proc. Am. Thorac. Soc. 2005, 2 (5): 403-411.
11. Quientin R., Lansac J. Pelvic inflammatory disease: medical treatment. Europ. J. Obstet. Gynecol. Repr.Biol. 2000, 92: 189-192.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Шибина Лариса Викторовна, 105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495) 917-34-72
