Экспрессия генов раково-тестикулярных антигенов в первичной меланоме кожи человека

Михайлова Ирина Николаевна; Ковалевский Дмитрий Анатольевич; Вишневская Яна Владимировна; Утяшев Игорь Аглямович; Голубева Валентина Алексеевна; Черемушкин Евгений Александрович; Субраманиан Сомасундарам; Кондратьева Татьяна Тихоновна; Киселев Сергей Львович; Демидов Лев Вадимович; Барышников Анатолий Юрьевич; Бибилашвили Роберт Шалвович

Ирина Николаевна Михайлова1, Дмитрий Анатольевич Ковалевский2,

Яна Владимировна Вишневская3, Игорь Аглямович Утяшев4, Валентина Алексеевна Голубева5, Евгений Александрович Черемушкин6, Сомасундарам Субраманиан7, Татьяна Тихоновна Кондратьева8, Сергей Львович Киселев9, Лев Вадимович Демидов10,

Анатолий Юрьевич Барышников11, Роберт Шалвович Бибилашвили12

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ АНТИГЕНОВ В ПЕРВИЧНОЙ МЕЛАНОМЕ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

1 К. м. н., ведущий научный сотрудник, отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

2 Младший научный сотрудник, лаборатория генной инженерии Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (121552, РФ, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15А)

3 К. м. н., старший научный сотрудник, отделение патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

4 Аспирант, отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

5 К. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН

(115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

6 К. м.. н., старший научный сотрудник, отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

7 Старший научный сотрудник, отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

8 Д. м.. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория клинической цитологии НИИ клинической

онкологии РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

9 Д. б. н., заведующий, лаборатория клеточных технологий Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (119991, РФ, г. Москва, ул. Губкина, д. 3)

10 Профессор, д. м.. н., заведующий, отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

11 Профессор, д. м.. н., директор, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, заведующий, лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115448, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

12 К. ф-м. н., заведующий, лаборатория генной инженерии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (121552, РФ, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15А)

Адрес для переписки: 121552, РФ, г. Москва, 3-я ул. Черепковская, д. 15А,

ФГУ РКНПК Росмедтехнологий, Институт экспериментальной кардиологии, лаборатория генной инженерии, Ковалевский Дмитрий Анатольевич; e-mail: [email protected]

Методом полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией, выявляли корреляцию активности 13 генов раково-тестикулярных антигенов, 4 дифференцировочных антигенов ме-ланоцитов и 14 генов маркеров меланомы в 26 образцах первичной меланомы человека с митотическим индексом клеток первичной меланомы и прогнозом заболевания. Показано, что анализ экспрессии 32 генов позволяет разделить всех пациентов на 3 группы: с низкой и высокой 5-летней выживаемостью при высокой доле пациентов с метастазами и пациентов без признаков заболевания. Генная экспрессия выбранных для исследования генов может использоваться как независимый прогностический фактор продолжительности жизни пациента после хирургической операции и склонности к метастазированию с высокой специфичностью и чувствительностью.

Ключевые слова: раково-тестикулярные антигены, митотический индекс, выживаемость, прогноз заболевания, меланома.

Иммуногенотипически злокачественная клетка характеризуется повышенной экспрессией раковотестикулярных (MAGE, BAGE и т. д.) антигенов, разбалансированной экспрессией дифференцировочных антигенов (для меланоцитов дифференцировочными антигенами служат тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2 и др.) [1], а также сниженной экспрессией антигенов гистосовместимости I класса [2]. В данной работе мы изучали экспрессию TYR, WARS, MLANA и SILV, кодирующих соответственно дифференцировочные антигены тирозиназу, триптофанил-тРНК-синтетазу, структурные компоненты меланосом Melan-A и гликопротеин gp100 (табл. 1).

Идентифицированы более 70 семейств раковотестикулярных антигенов (РТА, CTA) [3], которые состоят как из множественного количества изоформ белка (MAGEA, GAGE1 и т. д.), так и из вариантов сплайсинга генов [4]. РТА кодируются генами, экспрессирующимися в герменогенных клетках, а также в опухолях различных типов. Высокий уровень РТА наблюдается при меланоме, раке мочевого пузыря, раке легкого, печени и ряде других онкологических заболеваний [5].

Некоторые авторы отмечают, что увеличение экспрессии РТА коррелирует с опухолевой прогрессией. Например, уровень экспрессии мРНК MAGE возрастает при метастатической меланоме, а экспрессия CTAG1 (NY-ESO-1) при раке мочевого пузыря — с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Роль данных антигенов не совсем понятна. Хотя уже сейчас их функции связывают с гаметогенезом [6; 7]. РТА широко используются в попытках стимулирования иммунологической терапии меланомы человека [8—15].

Митотический индекс (МИ) клеток первичной меланомы является известным и наиболее надежным прогностическим фактором течения меланомы кожи человека [16—19].

В предыдущей работе [20] мы показали, что активность 15 генов, кодирующих РТА, с высокой степенью достоверности обратно коррелирует со степенью диф-ференцированности клеток в культурах, полученных из метастазов меланомы. Мы также показали, что примерно 50% всех препаратов первичной меланомы человека и ее метастазов в лимфатических узлах активно экспрессируют гены РТА.

В данном сообщении мы преследовали цель продемонстрировать наличие корреляции между активностью РТА генов в препаратах первичных меланом человека, МИ клеток первичной меланомы и прогнозом течения заболевания. Для достижения поставленной цели необходимо было провести клинико-морфологический анализ первичных опухолей меланомы, определить пролиферативную активность по МИ, 5-летнюю выживаемость и время до прогрессирования, составить карты экспрессии выбранных для исследования генов.

© Михайлова И. Н., Ковалевский Д. А., Вишневская Я. В., Утяшев И. А., Голубева В. А., Черемушкин Е. А., Субраманиан С., Кондратьева Т. Т., Киселев С. Л., Демидов Л. В., Барышников А. Ю., Бибилашвили Р. Ш., 2010

УДК 616.5-006.81-036.8-037:575.117

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОдЫ

Исследованию подвергали ткань опухоли 26 больных первичной меланомой кожи после выполнения хирургического иссечения. Все больные (18 женщин в возрасте 15—75 лет и 14 мужчин в возрасте 32—84 года) находились на лечении в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в 1998—2002 гг.

Распространенность процесса расценивали как соответствующую I—III стадии по системе AJCC (2002) [21]. Пролиферативную активность опухолевой ткани определяли по МИ, который вычисляли как количество делящихся клеток на 1 мм2 на гистологических препаратах первичной опухоли меланомы кожи с применением окраски гематоксилином и эозином. Табл. 2 суммирует все клинико-морфологические данные для пациентов.

Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией

Опухолевые образцы, полученные во время операции по удалению первичной опухоли, хранили в жидком азоте или при температуре —75 °C. Суммарную РНК из опухолевых клеток меланомы выделяли с применением кислого фенола, гуанидина тиоцианата (NH2C( = NH)NH2 HSCN) и аммония тиоцианата (NH4SCN) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (протокол №PT3231-1, «CLONTECH», США). Использовали реактивы фирмы «Sigma-AIdrich» (США). Опухолевые клетки разрушали добавлением денатурирующего буфера непосредственно к измельченной ткани. РНК из гомогената экстрагировали последовательным добавлением кислого фенола (pH 4,0) и хлороформа с последующим осаждением изопропанолом. Описанную процедуру выполняли

2 раза.

Последовательности нуклеотидов геноспецифических праймеров (см. табл. 1) были выбраны при помощи программы OIi99 фирмы «Техноген» (Россия) и синтезированы на фирме «Синтол» (Россия). Последовательность мРНК была получена из базы данных UniGene (http:// www.ncbi.nIm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db = unigene) и AceView (http://www.ncbi.nIm.nih.gov/IEB/Research/ Acembly/index.html) Национального центра биотехнологической информации (США). Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов мРНК- и геномной последовательностей проводили при помощи программы BLAST на сервере http://www.ncbi.nIm.nih.gov/BLAST/. Для гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы использовали праймеры G3PDH 0.45 kb Control AmpIimer Set фирмы «CLONTECH» (США).

Для реакции обратной транскрипции (ОТ) использовали обратную транскриптазу М-МLV и реактивы фирмы «Promega» (США). Объем пробы составлял 25 мкл. Сначала смешивали 1 мкг РНК с 25 пМ смеси случайных наномеров («Синтол», Россия) в 5 мкл воды. Смесь прогревали при температуре 70°C в течение 5 мин и охлаждали во льду. Затем добавляли 20 мкл смеси, содержащей 5 M-MLV буфер, 3 мкМ MgCI2, смесь дезоксину-клеотидтрифосфатов в концентрации 0,2 мМ каждого, 200 ед. обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубировали при температуре 37 °C в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием (95 °С в течение

Таблица 1

Последовательность нуклеотидов генспецифических праймеров

Семейство генов Название ампли- кона Имя гена Символ гена (HGNC)® мРНКб F/Rs Последовательность нуклеотидов (5'^3) Размер ампликона

Гены, снижение или потеря активности которых ассоциированы с метастазами меланомы и плохим прогнозом

NME1 Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in; ну-клеозид дифосфат киназа, NME1 NM_198175 F CCGGAGTTCAAACCTAAGCA 169

ингибитор экспресии EDG2 — рецептора фосфолипида LPA (лизофосфатидной кислоты) R CTTCGGAAGCTTGCATGAAT

CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4); ингибитор ци-клина CDK4; онкосупрессор 1, MTS1 CDKN2A NM 000077 F GCAGTAACCATGCCCGCATAGATG 225

R GGAAGGCATATATCTACGTTAAAAGGC

TRPM1 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 1; метастатин, TRPM1 NM_002420 F ACAGAACCAGCCCTACATGG 171

супрессор метастазирования меланомы, ассоциирован с рецидивами меланомы R ACCAGCATGATGACCACAAA

DPP4 Dipeptidyl-peptidase 4; плазма-мембранная дипепдидилпеп-тидаза 4, связывающаяся с фибронектином, супрессор метастазирования DPP4 NM_001935 F GTATCCCGGTGGGAGTACTATGAC 212

R ACATCGACCAGGGCTTTGGAGATC

Гены, усиление активности которых или увеличение концентрации продуктов которых ассоциированы с метастазами меланомы и плохим прогнозом

BCL6 B-cell CLL/lymphoma 6; POZ-доменный корепрессор транскрипции, онкоген BCL6 NM_001706 F AACCTGAAAACCCACACTCG 245

R TGACGGAAATGCAGGTTACA

SPP1 Secreted phosphoprotein 1, остеопонтин OPN, экспрессия SPP1 NM_001040058 F TATGATGGCCGAGGTGATAGTGTGG 347

коррелирует с инвазивностью меланомы R CGGCTGACTTTGGAAAGTTCCTGAC

TNC Tenascin C; тенасцин С, компонент межклеточного матрикса, вместе с FN1 формирует образование лимфатических сосудов, экспрессия коррелирует с инвазивностью меланомы TNC NM 002160 F GTCACCGTGTCAACCTGATG 241

R GGGCTGGTTGTATTGATGCT

FN1 Fibronectin 1, фибронектин, компонент межклеточного матрикса, вместе с TNC формирует образование лимфатических сосудов, экспрессия коррелирует с инвазивностью меланомы FN1 NM_212482 F TGTTCGTGCAGCTGTTTACC 195

R GCCACCGTAAGTCTGGGTTA

Таблица 1 (продолжение)

Раково-тестикулярные антигены, кодируемые этими генами, узнаются аутологичными цитотоксическими лейкоцитами. Экспрессируются в разнообразных опухолях, но не в нормальных тканях, за исключением тестикул, плаценты и незрелых (бластных) клеток различной природы

MAGE-B1 Melanoma antigen family B1, MAGEB1 NM_002363.3 F TAAGTTCATCACCCAAGATCTGGTGC 346

тестикулярный антиген R AACAAAGTGAACAATCTGCCTGAGTTC

MAGE-B2 Melanoma antigen family B2, MAGEB2 NM_002364.3 F CAGTGTTGTCTTTGGCCTTGAGCTG 217

тестикулярный антиген R GACTCCCAACATATTCAGGAATTCCC

GAGE-1-8 G antigen 1, 2C, 3, 4, 5, 6, 7; GAGE1, GAGE2. GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7. GAGE8 NM_001468.1 F GGCCTAGACCAAGACGCTACGTAG 212

тестикулярные антигены R GTGACCCTGTTCCTGGCTATCAGC

GAGE3 G antigen 3, тестикулярный GAGE3 U19144 F AGATGAGTTGGCGAGGAAGA 223

антиген R TTCCCCTTCTTCAGGTGTTG

GAGE-4-7 G antigen 4, 5, 6, 7; тестикуляр- GAGE4. GAGE5, NM_002045 F GGCCTAGACCAAGGCGCTATGTAC 212

ные антигены GAGE6, GAGE7 R GTGACCCTGTTCCTGGCTATCAGC

MAGE-C1 Melanoma antigen family C1; MAGEC1 NM_005462.2 F AGTGGACCCTGATGACTCCTATGTC 271

РТА не имеет четко выраженой тканевой специфичности R CCGGTACTCTAGGTAATGTTCCTGC

MAGE-A4 Melanoma antigen family A 4; MAGEA4 NM_002362.3 F TTCCTGTGATCTTCGGCAAAGCCTC 204

не имеет четко выраженой тканевой специфичности R TGTCGCCCTCCATTGCAATTGTGC

BAGE B melanoma antigen; не имеет BAGE NM_001187 F GCCAATTTAGGGTCTCCGGTATCTC 211

четко выраженой тканевой специфичности R TCTGGCCGCCATCTTACTGCTCC

Белки этих генов специфичны для опухолей и нормальных лимфобластов. Они узнаются аутологичными цитоток-сичными Т-лимфоцитами, слабо экспрессированы как в тестикулах, так и в яичниках, плаценте и простате

MAGE-A1 Melanoma antigen family A, 1 (directs expression of antigen MZ2-E) MAGEA1 NM_004988.3 F GGGCCAAGCACCTCTTGTATCCTG 212

R ATGCCAAAGACCAGCTGCAAGGAC

MAGE-A10 Melanoma antigen family A, 10 MAGEA10 NM_021048.3 F GTTTAGTGAAGCCTCCGAGTGCATG 192

R TAGCCCTCTATGAAGATTATGCTTAGG

MG-A3 Melanoma antigen family A, 2, MAGEA2. MAGEA3, NM_005362.3 F CCCACTACCATGAACTACCCTCTC 223

3, 6, 12 MAGEA6. MAGEA12 R AATACTGCCAATTTCCGACGACACTC

MG-A2 Melanoma antigen family A, 2, MAGEA2. MAGEA3, NM_175743.1 F TCCAAGGGCCCTCATTGAAACCAG 233

3, 6, 12 MAGEA6. MAGEA12 R GGAATGGGCCTCATATCACACGAG

CTAG1A Cancer/testis antigen 1A, 1B, 2 (CTAG1); меланоцитный дифференцирующий антиген CTAG1A. CTAG1B, CTAG2 NM_001327 F CTCCATCAGCTCCTGTCTCC 209

R CTCCTCCAGCGACAAACAAT

Таблица 1 (окончание)

Дифференцировочные антигены меланомы. Компоненты меланосомы, участвуют в меланогенезе. Незрелые ме-ланосомы характерны для меланомы и фетальных клеток и распознаются моноклональными антителами HMB45. В зрелых меланосомах, преобладающих в меланоцитах, антиген gp100 (PMEL17) — продукт гена SILV — экранирован от HMB45

SILV Silver homolog (mouse); gp100; pmel17; компонент мелано-сомного матрикса SILV NM_006928 F GGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGG 375

R AGGTAAGTATGAGTGACCACAAGTGC

ДАМ MLANA Melan-A, Mart1, Melanoma antigen recognized by T-cells-1; MLANA NM_005511.1 F GCTCATCGGCTGTTGGTATT 190

компонент меланосомного матрикса R ATAAGCAGGTGGAGCATTGG

TYR Tyrosinase (oculocutaneous TYR NM_000372.3 F AGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTC 290

albinism IA); тирозиназа R GGTATGCTTTGCTAAAGTGAGGTAGG

WARS Tryptophanyl-tRNA synthetase; WARS NM_004184 F ACCGGCCAAAGACCACACCACTTC 238

триптофанил тРНК синтаза ACAGATACTTCTCGTCATCCGTCATC

Маркеры меланомы (высокоэкспрессированы в меланоме)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

S100B Ca-связывающий белок S100; S100B NM_006272.1 F AGCCCGCCATGGCCGTGTAGAC 257

S100 calcium binding protein B R CCAGCGCTGAGCGTTCACCTGG

В метастазах меланомы в лимфоузлах нет интегрина ITGB3; integrin, beta 3 (platelet glycoprotein IIIa, antigen CD61) ACCACAGTTGGGGTTCTGTC

ITGB3 ITGB3 NM_000212 F ACCTCACCGTGTCTCCAATC 208

MFI2 Antigen p97 (melanoma associated) identified by monoclonal antibodies 133.2 and 96.5; подавлен в лимфоузлах с метастазами меланомы MFI2 NM_005929.3 F CGTGAACAACCCCAAGAACT 400

R GTGGTCGTCTCCAAACAGGT

MIA Melanoma inhibitory activity, секретируемый клетками меланомы белок, ассоциирован с прогрессированием меланомы MIA NM_006533 F CCCGGTCCCTGGTGTGCCTTG 398

R CTGAGCTCACTGGCAGTAGAAATCC

MCAM Melanoma cell adhesion molecule; CD146, MUC18, меланом-ный адгезин MCAM NM_006500.2 F GGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACC 241

R GTGCCGTTGACGTTCCAGGAGATG

TIMP1 TIMP metallopeptidase inhibitor 1; ингибитор метал- TIMP1 NM_003254 F GACCTCGTCATCAGGGCCAAGTTC 201

лопротеиназ; ассоциирован с многими опухолями R CTCCTCGCTGCGGTTGTGGGAC

Ген «домашнего хозяйства» (ген глицеральдегидфосфодегидрогеназы)

G3PDH Glyceraldehyde-3-phosphate GAPDH NM_002046.3 F ACCACAGTCCATGCCATCAC 452

dehydrogenase R TCCACCACCCTGTTGCTGTA

а Приведены названия всех генов, хотя бы одна из альтернативных версий мРНК которых амплифицируется использованой парой праймеров. б Описание каталожного номера мРНК: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/release_notes.html в F — прямой праймер; R — обратный праймер.

5 мин). Полученную одноцепочечную кДНК хранили при температуре —20 °C. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в программируемом термостате фирмы «Hybaid» (США). КДНК (1/100) амплифицировали с 0,5 мкМ генспецифических олигонуклеотидов и 2,0 ед. ДНК-полимеразы «Thermus Aquaticus» («БиоМастер», Россия). Амплификацию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0,01 М Трис-HCl (pH 8,5 при температуре 25 °C), 0,05 M KCl, 0,002 M MgCb, 10 мкг/мл желатина, 200 мкМ каждого dNTP, 200 мкг/мл антител TaqStart («CLONTECH», США).

Для всех опытов ПЦР проводили по схеме: 94 °С — 30 с, 60 °С — 60 с, 72 °С — 1 мин — 35 циклов, 72 °С — 7 мин. Интенсивность люминесценции продуктов ПЦР после электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле измеряли с помощью системы «AIphalmagerTM» («Alpha Innotech Corporation», Santa Clara, США) и программного обеспечения «ImageQuant» («Molecular Dynamics», Sunnyvale, США), результаты представляли в произвольных единицах.

Для количественной оценки исследуемых кДНК использовали серийные 4-кратные разведения в 1, 4, 16, 64, 256, 1024 раза. Для одной кДНК проводили анализ всех 32 генов. В качестве внешнего стандарта использовали продукты амплификации 2 генов TYR и SILV. Кривые серийных разведений удовлетворительно описывались гиперболической зависимостью с фиксированным уровнем насыщения, не зависящим от гена (данные не приводятся, но эти и другие дополнительные данные могут быть найдены по адресу www.cardio.ru). Уровни экспрессии генов вычисляли по кривым разведения в зависимости от выхода продукта ПЦР по отношению к внешнему стандарту.

Математическая обработка данных

Кластерный анализ данных. Для того чтобы независимым способом найти соответствия между уровнем экспрессии генов в исследуемых образцах и клиническими характеристиками пациентов, было проведено двумерное иерархическое кластерирование данных ОТ-ПЦР. Все сигналы были нормированы на среднегеометрическое значение данных всех генов с ненулевым значением интенсивности (SILV, SPP1, MCAM, BCL6, TIMP1, FN1, MIA, TYR, MLANA, NME1 и G3PDH), логарифмированы по основанию 2 и центрированы. Центрирование производили по обоим измерениям, по генам и по группам пациентов, так что средние значения логарифма интенсивности сигнала в каждой строчке и в каждом столбце таблицы перед кластерированием были равны нулю. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм использовали корреляцию по Пирсону и эвклидово расстояние [22]. Результаты кластерирования данных представлены на рис. 1. Стабильность иерархического кластерирования проверяли путем последовательного исключения из анализа одного пациента или одного гена из каждой группы.

Корреляционный анализ данных. Корреляцию активности каждого из генов или среднего значения логарифма групп генов с клинико-морфологическими данными проводили по Пирсону, для чего последние оцифровывали, как показано в табл. 2.

результаты и обсуждение

На основании результатов предыдущего исследования и данных литературы [23—25], ассоциирующих увеличение активности РТА генов с инициацией метаста-зирования, мы ожидали наличия обратной корреляции между активностью РТА генов в первичной меланоме с продолжительностью жизни пациентов. В настоящей работе, как и в предыдущей, была проанализирована транскрипционная активность стандартного набора генов, ответственных за синтез меланосом (SILV, MLANA, TYR, WARS), и генов маркеров меланомы (S100B, ITGB3, MFI2, MIA, MCAM, TIMP1). Кроме перечисленных мы включили 8 генов различной этиологии, из которых 4, согласно данным литературы, ассоциированы с инициацией мета-стазирования (BCL6, SPP1, TNC, FN1) [26—40], а 4 других служат скорее онкосупрессорами (репрессорами мета-стазирования), и утрата их активности ассоциирована с инициацией метастазирования — NME1, CDKN2A (INK и ARF), TRPM1, DPP4 [41—50]. Это давало основание предполагать наличие разнонаправленной корреляции между их активностью и прогнозом заболевания. Полученная в результате картина экспрессии оказалась более сложной, чем ожидалось.

Анализ экспрессии генов по картине двумерного кластерирования

На рис. 1 приведены результаты двумерного кластерного анализа транскрипционной активности 32 генов в 26 препаратах первичной меланомы кожи человека. Дендрограмма в верхней части рис. 1 выделяет 3 кластера (группы) пациентов С1, С2 и С3 с резко различной судьбой, отвечающей 5-летней выживаемости 11, 100 и 89% соответственно (отношение шансов ORC1/(C2+c3) = 128, относительный риск RRC1/(C2+C3) = 15,1), со средней продолжительностью жизни после операции для первой группы 25 ± 23 мес (95% доверительный интервал 14—36 мес; р = 0,001, вероятность риска смерти 89%, риска метастазирования 100%) и с ожидаемым средним временем появления метастазов 6,2 ± 4 мес.

Группа С3 характеризуется столь же высокой 5-летней выживаемостью, как и группа С2 (р = 0,57), но значительно отличается от последней по вероятности мета-стазирования опухоли за 5-летний срок с вероятностью метастазирования для С2 = 0, а для С3 = 56%, при ожидаемом времени появления метастазов для С3 18,6 ± 14 мес (95% доверительный интервал 12,6—24,6 мес; р = 0,015). Вся картина двумерного кластерирования (см. рис. 1) очень устойчива, и исключение из анализа любых 2 не соседних по дендрограмме пациентов или любых 2 генов принципиально не изменяет дендрограмму. В этом случае в дендрограмме исчезают соответствующие исключенным данным ветви, не влияя на общий профиль и топографию дендрограммы.

Если рассматривать отнесение пациента (в соответствии с генной экспрессией в первичной опухоли) к кластеру С1 в качестве независимого прогностического теста 5-летней выживаемости, то специфичность и чувствительность такого теста в соответствии с приведенными данными составляет 90 и 94% соответственно, что значительно превышает показатели других прогностических тестов, включая измерение МИ, гистологических

Таблица 2

Коэффициенты корреляции клинико-морфологических признаков со среднегеометрическими величинами экспрессии групп генов3’6

Признаки Пациенты

О) <о eg О eg N eg О «я- N eg О eg О 00 <0 eg О со <о О) О <о О) о о о о о <о о со <о О <0 О) о h- CN о о <о eg О <о <о eg О о о о ю о о о <0 eg о О 00 <о о

Клинико-морфологические признаки

Пол Ж ж ж ж ж ж ж М М ж м м ж ж ж ж М М

Возраст, годы 49 71 15 15 15 55 47 63 32 49 48 52 61 49 69 53 50 49

Локализация опухоли НК НК НК НК Т НК НК Т ГШ ВК ВК Т Т НК НК ВК НК ВК

Площадь опухоли, см2 1 2 0 0 1 2 2 3 3 7 2 3 2 2 1 1 3 7

Лимфоидная инфильтрация +++ + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ + + +++ +++ +++ +++ ++ +++

Изъязвление - - - - + + + + + + + + + - + + + +

Толщина по Breslow, мм 2 2 3 3 3 3 4 7 10 8 4 8 5 2 2 3 7 13

Стадия по С1агк III III III III III III III III III III III III III II III III III III

Стадия по AJCC IB IB IIA IIA IIB IIB IIB IIC IIC IIC IIC IIC IIC IB IIA IIB IIC IIC

Наличие метастазов за все время наблюдения + + + + +

Локализация метастазов МТ, ЛУ ЛУ ЛУ Р Л ЛУ

Наличие метастазов на момент операции

Время до появления новых метастазов, мес 68 28 8 21 1

Митотический индекс (М^ число митозов на 1 мм2) 12 4 5 5 10 24 7 28 13 11 1 14 7 3 3 4 7 10

Число митозов на 1 мм2 более или менее 6 > 6 < 6 < 6 < 6 > 6 > 6 > 6 > 6 > 6 > 6 < 6 > 6 > 6 < 6 < 6 < 6 > 6 > 6

Исход ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж

Продолжительность жизни после операции для умерших больных, мес

+ — есть / слабая; ++ — умеренная; +++ — выраженная;-----нет; ВК — верхние конечности; ГШ — голова и шея; Ж — женский; ж — жив; Л — легкие;

ЛУ — лимфатические узлы; М — мужской; м — мертв; МТ — мягкие ткани; НД — нет данных; НК — нижние конечности; ПО — подколенная область; Р — послеоперационный рубец; С — стопа; Т — туловище; Ш — шея. а Жирным шрифтом отмечены данные с достоверностью p < 0,05.

б G2b(26) состоит из NME1, MCAM, WARS, SILV, MLANA, TRPM1, CTAG1, MFI2. G2a(26) состоит из SPP1, TNC, FN1, DDP4, ITGB3, BCL6, TIMP1. G состоит из DPP4, NME1, FN1, TIMP1, MAGEC1. B состоит из MCAM, TYR. P состоит из SPP1, CTAG1, ITGB1, MIA, S100B. R состоит из WARS, SILV, MFI2.

Пациенты Жив/умер Продолжительность жизни Митотический индекс Митотический индекс > 6 Время до появления новых метастазов .2 2 о я 2 О <8 2 О 1 .2 2 О О т 0. СЕ 0. 1 со СЕ 1 О

0) 0) о о сд <о О о О <0 О «Я со ю о сд N 00 О N о О о N сд О <о 0) о о

Клинико-морфологические признаки Основные характеристики Группы генов

м ж м ж м ж м ж м - - - - - - - - - - - - - -

73 40 75 75 84 74 63 46 80 - - - - - - - - - - - - - -

НК НК Т НК гш Т т Т НК - - - - - - - - - - - - - -

4 3 8 10 10 3 14 9 5 0,66 -0,61 0,29 0,40 0,38 0,39 -0,60 0,57 -0,62 0,08 -0,03 0,48 0,07 -0,64

++ ++ ++ + ++ +++ + +++ + -0,28 -0,06 0,10 0,16 0,11 -0,11 0,24 -0,19 0,27 0,12 -0,23 -0,19 0,22 0,27

+ - + + + + + + + 0,15 -0,43 0,18 0,31 0,03 0,09 -0,02 0,05 -0,36 -0,17 0,22 0,11 -0,25 -0,27

10 8 6 6 11 18 14 9 12 0,66 -0,61 0,29 0,40 0,38 0,39 -0,60 0,57 -0,62 0,08 -0,03 0,48 0,07 -0,64

V III III IV III IV III IV V 0,62 0,48 0,13 -0,15 0,21 0,44 -0,33 0,45 -0,33 0,06 0,26 0,23 -0,13 -0,32

ІІС ІІВ ІІС НС НС ШС ШС ШВ ШС 0,57 -0,51 0,30 0,21 0,08 0,37 -0,32 0,40 -0,51 0,21 -0,04 0,35 0,15 -0,50

+ + + + НД + + + + 0,57 0,27 -0,04 -0,17 0,46 -0,18 0,38 -0,07 0,38 0,18 0,04 0,09 -0,07

Р П, ЛУ мт, ЛУ, Р Л НД Р НД ЛУ ЛУ ЛУ ЛУ - - - - - - - - - - - - - -

+ + + + 0,59 -0,51 0,21 0,05 0,42 -0,54 0,57 -0,45 0,47 -0,21 0,44 0,41 -0,52

6 35 7 4 НД 0,30 0,28 -0,26 -0,34 -0,13 0,11 -0,08 0,58 0,72 -0,70 -0,38 0,75 0,51

6 19 9 22 13 23 12 19 5 0,31 -0,41 -0,14 0,39 -0,33 0,41 -0,28 -0,12 0,01 0,44 -0,07 -0,42

< 6 > 6 > 6 > 6 > 6 > 6 > 6 > 6 < 6 0,13 -0,37 -0,20 0,02 -0,22 0,13 -0,22 -0,15 -0,16 0,30 0,02 -0,31

м м м м м м м м м 0,31 0,13 0,64 -0,61 0,73 -0,57 0,30 0,05 0,43 0,14 -0,57

104 71 23 23 10 15 12 9 1 -0,41 -0,37 -0,42 0,67 -0,60 0,78 -0,46 0,54 -0,78 -0,55 0,80

Время появления метастазов, мес ^ооюо I оь-ю

митотический индекс 29 21 2 6 3 2 3 59 3 5 8 2 0 7 3 1 11 4 2 0 7 3 7 4 2 9 4 4

Продолжительность наблюдения, мес 4 29 11 4 0 5 0 9 -2 9 7 4 8 4 8 2 5 4 8 8 9 4 9 8 9 4 8 4 8 8 2 6 8 8 8 4 8 9 8 8 6 6 7 8 9

А — жив, D — умер -О О - а - а - а - а -а а <с - а

01

Г

-НЕ ^ ■■

*1

ь|

сим

Гены 0А0Е-1-8 0А0 Е- 4-6 МА0Е-С1 ВА0Е М0-А3 М0-А2 МА0Е-А4 МА0Е-А1 МА0Е-А10 МА0Е-В2 МА0Е- В1 0А0 Е- 3 DPP4 TNC BCL6 Т1МР1 FN 1 SPP1 1Т0В3 CDKH2A SILV TRPM 1 СТА01 MFI2 МСАМ М1А S100B TYR

М LANA WARS NME1 03PDH

Митотический индекс -0,34 -0,41

06

14

45

06

11

08

26

41

32

17

20

32 28 13 08 22 35 56 11 44 02 12

33 30 41 66 51 68 07 62 16 06

26

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

40

43

21

18

00

12

06

10

25

31

49

22

07

08 34 06 70 07 69

17

18 55 38 48 20 33

17 45

18 51

Отностительная концентрация мРНК

Рисунок 1. Результаты двумерного кластерного анализа экспрессии генов, кодирующих раково-тестикулярные и мелано-цитодифференцировочные антигены, методом ОТ-ПЦР в первичных меланомах кожи человека. Представлены результаты полносвязного кластерирования (по обоим направлениям) данных по экспрессии 32 генов в 26 первичных меланомах. Кластерирова-нию подвергался весь набор логарифмированных по основанию 2 данных ОТ-ПЦР, нормированных для каждой первичной меланомы и генов на среднегеометрическое значение интенсивности сигнала по обоим направлениям. Обозначение генов такое же, как в табл. 1, пациентов — как в табл. 2. Справа от картины двумерного кластерирования приведена таблица коэффициентов корреляции между уровнем экспрессии генов и временем появления новых метастазов и уровнем экспрессии генов и временем между операцией по удалению первичной меланомы и смертью пациента. Уровни коэффициентов с р < 0,08 отмечены зеленым цветом при благоприятном прогнозе (позитивной корреляции), красным и розовым — при негативной корреляции.

и других описанных в литературе тестов для больных с меланомой [16—19] (см. табл. 2).

Отнесение пациента по картине экспрессии генов к группе С2 со специфичностью 78% и с чувствительностью 100% прогнозирует полное выздоровление, а отнесение пациента по карте экспрессии генов к группе С3 прогнозирует высокую вероятность прожить более 5 лет, при том что с вероятностью 56% за 5-летний период после операции у пациента появятся метастазы.

Таким образом, используя группу генов и закономерность их экспрессии для характеристики первичной опухоли, можно предложить дополнительный прогностический тест для больных с меланомой кожи.

Анализ экспрессии генов по кривым Каплана—Майера

Несмотря на высокую специфичность и чувствительность, метод двумерного кластерирования обладает существенным недостатком для практического применения из-за необходимости одновременного анализа данных о нескольких пациентах. В то же время анализ каждого отдельного гена не обеспечивает специфичности и чувствительности теста, значительно превышающих чувствительность и специфичность других известных прогностических критериев. Например, для пациентов, включенных в данное исследование, МИ обратно коррелирует с продолжительностью жизни с коэффициентом —0,41 и с продолжительностью жизни без метастазов с коэффициентом —0,31 (см. табл. 2). При этом чувствительность и специфичность теста при оптимальном для данной выборки пациентов пороговом значении митозов (6 на 1 мм2) составляет 89 и 45% соответственно. Недостатком теста являются не только невысокая специфичность, но и произвольность порогового значения МИ. В приведенных ссылках [16—19] авторы используют в качестве порогового значения величины между 1-м и 6-м митозами на 1 мм2.

Картина двумерного кластерирования генов (левая дендрограмма на рис. 1) и анализ корреляции активности генов с продолжительностью жизни пациентов после операции и временем появления у них новых метастазов, а также с другими клинико-морфологическими признаками позволил выявить группы генов, значимо (р < 0,05) коррелирующих или антикоррелирующих с ними (см. табл. 2). Это группы G2a и G2b, отмеченные на рис. 1 слева, и отдельные гены, отмеченные справа на том же рисунке цветными цифрами: зелеными — свидетельствующими (при увеличении транскрипции гена) о благоприятном прогнозе по обоим клиническим признакам, красными — о неблагоприятном по выживаемости, а розовыми — о неблагоприятном по скорости появления метастазов.

Объединение генов в группы со сходным прогнозом (см. табл. 2) и вычисление разности средних значений логарифма нормированной концентрации соответствующих мРНК позволяет получить несколько независимых прогностических критериев (см. табл. 2, правые колонки), пригодных для характеристики индивидуального пациента без необходимости проведения кластерного анализа. Видно, что 3 групповых критерия (G2b—G2a), (B—P) и (G—R) обеспечивают абсолютные значения коэффициентов корреляции с продолжительностью жизни и продолжительностью жизни без метастазов более

0,7, тогда как МИ дает максимум 0,41, а разные способы определения стадии — не выше 0,61.

Применение одного из таких критериев (G2b—G2a) для анализа прогноза течения заболевания по кривым Каплана—Майера показано на рис. 2. При (G2b—G2a) < 0 все 100% пациентов живут более 80 мес после операции и только 1/4 — с медленно прогрессирующими метастазами. В то же время 75% пациентов с (G2b—G2a) > 0 умирают за 80 мес, а 60% — за 20 мес. Новые метастазы у этих пациентов появляются в основном в течение 10 мес, а смерть наступает через 20 мес после этого.

Специфичность и чувствительность разделения на группы с использованием критерия (G2b—G2a) относительно наступления смерти в течение 80 мес составляют 75 и 100%, относительно отсутствия метастазов за тот же период — 83 и 75% соответственно (OR = 7,5 и RR = 2,6).

Критерии (B—P) и (G—R) дают сходные кривые Каплана—Майера (не показаны), позволяя, как и кластерный анализ, разделить всех пациентов на 3 почти равные группы — с высоким риском скорой смерти, высокой 80-месячной выживаемостью при высокой доле пациентов с метастазами и пациентов без признаков заболевания (см. табл. 2).

Таким образом, выбранная для исследования группа генов и при другом методе анализа позволяет прогнозировать течение заболевания.

Отдельные гены

Экспрессия генов РТА, за исключением CTAG1 и MAGEC1, не коррелирует значимо ни с МИ, ни с выживаемостью больных. Возможно, это обусловлено практически полным отсутствием их экспрессии в первичных опухолях у 2/3 всех пациентов. В субпопуляции с участием пациентов, у которых экспрессируется хотя бы один из генов РТА (все пациенты, приписанные к группе С3, и несколько пациентов групп С1 и С2), определяется значимая (р < 0,06) положительная корреляция (г > 0,4) генов MAGEB2, MAGEB4, MAGEA1, MAGEA4 & MAGEA10 с продолжительностью жизни пациентов после операции. Более значимые величины положительной корреляции определяются для генов DDP4, TNC и SPP1 и отрицательной для генов SILV, MLANA (р < 0,02; |г| > 0,6) для всей популяции больных.

Необходимо отметить, что наличие положительной корреляции активности генов TNC и SPP1 не согласуется с данными литературы по этим генам [36; 39; 40]. Следует также подчеркнуть, что часть генов, таких, как MAGEA1, SPP1, CDKN2A, CTAG1 и S100B, активность которых коррелирует с отрицательным прогнозом появления метастазов, не коррелируют со смертностью; более того, активность генов MIA и ITGB2 коррелирует с положительным прогнозом продолжительности жизни пациентов и в то же время с отрицательным прогнозом появления метастазов, а TYR и MCAM наоборот (см. рис. 1).

У большинства пациентов группы С1 (из группы высокого риска смерти) не экспрессируются гены РТА, включенные в данное исследование (за исключением CTAG1), и, следовательно, эти лица должны быть рефрактерными к вакцинотерапии продуктами указанных генов; напротив, пациенты группы С3 должны быть восприимчивыми к такой вакцинотерапии.

Ограничения и недостатки

Настоящее исследование является предварительным, проведенным на очень ограниченном количестве данных

о пациентах, не позволяющим разделение их на подгруппы по морфологическому или клиническому признаку.

Исследование не включает в анализ генетические признаки, такие, как наличие полиморфизма в генах, ассоциированных с меланомой кожи: наследуемые мутации — CDKN2A, CDK4, MC1R, MDM2 и ненаследуемые (соматические) мутации — BRAF, EGF, NRAS, HRAS, RET, PIK3CA, WT1 [51—61].

В наборе генов, использованных для анализа, отсутствуют пригодные для нормирования экспрессии генов для каждого пациента в отдельности, а не для всей совокупности пациентов.

Данные, полученные для ряда генов, противоречат данным литературы, что может быть обусловлено различными подходами в клинико-морфологическом анализе первичного материала.

заключение

Таким образом, используя группу генов и закономерность их экспрессии для характеристики первичной опу-

Время, мес

Рисунок 2. Выживаемость и метастазирование в группах пациентов G2L и G2H (метод Каплана—Майера). Пациентов относили к группе G2L, если отношение среднегеометрических концентраций мРНК генов, входящих в кластер G2a, к среднегеометрическому концентраций мРНК генов, входящих в кластер G2b, было больше 1. В кластер генов G2a входят SPP1, TNC, FN1, DDP4, ITGB3, BCL6 и TIMP1. Среднегеометрическое для них вычисляется с весовыми коэффициентами 6,6, 1,5, 0,3, 104,1, 13,4, 17,3, 0,2, обратно пропорциональными представленности данных мРНК в клетке. В кластер генов G2b входят NME1, MCAM, WARS, SILVMLANA, TRPM1, CTAG1, MFI2. Среднегеометрическое для них вычисляется с весовыми коэффициентами 3,6, 1,3, 0,8, 0,1, 0,2, 71,9, 87,7, 32,0, обратно пропорциональными представленности мРНК этих генов в клетке.

1 — выживаемость в группе G2L (G2b < G2a); 2 — метастазирование в группе G2L (G2b < G2a); 3 — выживаемость в группе G2H (G2b > G2a); 4 — метастазирование в группе G2H (G2b > G2a).

холи, можно предложить дополнительный высокочувствительный и высокоспецифичный прогностический тест для больных с меланомой кожи.

В целом использование примененного метода анализа кажется очень перспективным и заслуживает проведения исследования на более широкой выборке клинически и морфологически охарактеризованных препаратов первичной опухоли пациентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kirkin A. F., Dzhandzhugazyan K., Zeuthen J. Melanoma-associated antigens recognized by cytotoxic T-lymphocytes // APMIS. — 1998. — Vol. 106. — P. 665—679.

2. Identification of human cancer deficient in antigen processing / Restifo N. P., Esquivel F., Kawakami Y., Yewdell J. W., Mule J. J., Rosenberg S. A., Bennink J. R. // J. Exp. Med. — 1993. — Vol. 177. — P. 265—272.

3. Rapid evolution of cancer/testis genes on the X chromosome / Stevenson B. J., Iseli C., Panji S., Zahn-Zabal M., Hide W., Old L. J., Simpson A. J., Jongeneel C. V. // BMC Genomics. — 2007. — Vol. 8. — P. 129.

4. Scanlan M. J., Simpson A. J., Old L. J. The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary // Cancer Immun. — 2004. — Vol. 4. — P. 1—15.

5. Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer / Gure A. O., Chua R., Williamson B., Gonen M., Ferrera C. A., Gnjatic S., Ritter G., Simpson A. J., Chen Y. T., Old L. J., Altorki N. K. // Clin. Cancer Res. — 2005. — Vol. 11. — P. 8055—8062.

6. Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer / Simpson A. J., Caballero O. L., Jungbluth A., Chen Y. T., Old L J. // Nat. Rev. Cancer. — 2005. — Vol. 5. — P. 615—625.

7. Cancer/testis Database [Электронный ресурс] // — URL: http://www.cta.lncc.br/index.php/ (дата обращения: 01.12.2009).

8. Caballero O. L., Chen Y. T. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy // Cancer Sci. — 2009. — Vol. 100. — P. 2014—2021.

9. Old L. J. Cancer vaccines: an overview // Cancer Immun. —

2008. — Vol. 8. — P. 1—4.

10. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clo-nogenic CD133+ melanoma cells / Gedye C., Quirk J., Browning J., Svobodova S., John T., Sluka P., Dunbar P. R., Corbeil D., Cebon J., Davis I. D. // Cancer Immunol. Immunother. — 2009. — Vol. 58. — P. 1635—1646.

11. Immunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ESO-1 protein using TLR7 agonist imiquimod as vaccine adjuvant / Adams S., O'Neill D. W., Nonaka D., Hardin E., Chiriboga L., Siu K., Cruz C. M., Angiulli A., Angiulli F., Ritter E., Holman R. M., Shapiro R. L., Berman R. S., Berner N., Shao Y., Manches O., Pan L., Venhaus R. R., Hoffman E. W., Jungbluth A., Gnjatic S., Old L., Pavlick A. C., Bhard-waj N. // J. Immunol. — 2008. — Vol. 181, N 1. — P. 776—784.

12. Induction of immune response against NY-ESO-1 by CHP-NY-ESO-1 vaccination and immune regulation in a melanoma patient / Tsuji K., Hamada T., Uenaka A., Wada H., Sato E., Isobe M., Asagoe K., Yamasaki O., Shiku H., Ritter G., Murphy R., Hoffman E. W., Old L. J., Nakayama E., Iwatsuki K. // Cancer Immunol. Immunother. — 2008. — Vol. 57. — P. 1429—1437.

13. The TAG family of cancer/testis antigens is widely expressed in a variety of malignancies and gives rise to HLA-A2-restricted epitopes / Adair S. J., Carr T. M., Fink M. J., Slingluff C. L. Jr, Hogan K. T. // J. Immunother. — 2008. — Vol. 31, N 1. — P. 7—17.

14. Jager D., Jager E., Knuth A. Vaccination for malignant melanoma: recent developments // Oncology. — 2001. — Vol. 60. — P. 1—7.

15. Melanoma: molecular pathogenesis and emerging target therapies / Russo A. E., Torrisi E., Bevelacqua Y., Perrotta R., Libra M., McCu-brey J. A., Spandidos D. A., Stivala F., Malaponte G. // Int. J. Oncol. —

2009. — Vol. 34, N 6. — P. 1481—1489.

16. Biologic and prognostic significance of dermal Ki67 expression, mitoses, and tumorigenicity in thin invasive cutaneous melanoma / Gi-motty P. A., Van Belle P., Elder D. E., Murry T., Montone K. T., Xu X., Hotz S., Raines S., Ming M. E., Wahl P., Guerry D. // J. Clin. Oncol. — 2005. — Vol. 23. — P. 8048—8056.

17. Prognostic factors in localized invasive cutaneous melanoma: high value of mitotic rate, vascular invasion and microscopic satelli-tosis / Nagore E., Oliver V., Botella-Estrada R., Moreno-Picot S., Insa A., Fortea J. M. // Melanoma Res. — 2005. — Vol. 15. — P. 169—177.

18. The prognostic importance of tumor mitotic rate confirmed in 1317 patients with primary cutaneous melanoma and long follow-up / Francken A. B., Shaw H. M., Thompson J. F., Soong S. J., Accortt N. A., Azzola M. F., Scolyer R. A., Milton G. W., McCarthy W. H., Colman M. H., McGovern V. J. // Ann. Surg. Oncol. — 2004. — Vol. 11. — P. 426—433.

19. Melanoma Molecular Map Project (MMMP) Database [Электронный ресурс] — URL: http://www.mmmp.org/MMMP/ (дата обращения: 01.12.2009).

20. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines / Mikhaylova I. N., Kovalevsky D. A., Morozova L. F., Golubeva V. A., Cheremushkin E. A., Lukashina M. I., Voronina E. S., Burova O. S., Utya-shev I. A., Kiselev S. L., Demidov L. V., Beabealashvilli R. Sh., Baryshnikov A. Y. // Melanoma Res. — 2008. — Vol. 18. — P. 303—313.

21. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma / Balch C. M., Buzaid A. C., Soong S. J., Atkins M. B., Cascinelli N., Coit D. G., Fleming I. D., Gershenwald J. E., Houghton A. Jr, Kirkwood J. M., McMasters K. M., Mihm M. F., Morton D. L., Reintgen D. S., Ross M. I., Sober A., Thompson J. A., Thompson J. F. // J. Clin. Oncol. — 2001. — Vol. 19. — P. 3635—3648.

22. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns / Eisen M. B., Spellman P. T., Brown P. O., Botstein D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol. 95. — P. 14 863—14 868.

23. Expression of the cancer/testis antigen NY-ESO-1 in primary and metastatic malignant melanoma (MM) — correlation with prognostic factors / Velazquez E. F., Jungbluth A. A., Yancovitz M., Gnjatic S., Adams S., O'Neill D., Zavilevich K., Albukh T., Christos P., Mazumdar M., Pavlick A., Polsky D., Shapiro R., Berman R., Spira J., Busam K., Osman I., Bhardwaj N. // Cancer Immun. — 2007. — Vol. 7. — P. 11—18.

24. Expression profile of genes coding for melanoma differentiation antigens and cancer/testis antigens in metastatic lesions of human cutaneous melanoma / Zendman A. J., de Wit N. J., van Kraats A. A., Wei-dle U. H., Ruiter D. J., van Muijen G. N. // Melanoma Res. — 2001. — Vol. 11. — P. 451—459.

25. Concordant loss of melanoma differentiation antigens in synchronous and asynchronous melanoma metastases: implications for immunotherapy / Trefzer U., Hofmann M., Reinke S., Guo Y. J., Audring H., Spag-noli G., Sterry W. // Melanoma Res. — 2006. — Vol. 16. — P. 137—145.

26. Sondak V. K., Messina J. L. Current status of biomarkers for melanoma metastasis // I. Drugs. — 2006. — Vol. 9. — P. 627—631.

27. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness / Topczewska J. M., Postovit L. M., Margaryan N. V., Sam A., Hess A. R., Wheaton W. W., Nickoloff B. J., T opc-zewski J., Hendrix M. J. // J. Nat. Med. — 2006. — Vol. 12. — P. 925—932.

28. Expression of multiple molecular phenotypes by aggressive melanoma tumor cells: role in vasculogenic mimicry / Seftor E. A., Melt-zer P. S., Schatteman G. C., Gruman L. M., Hess A. R., Kirschmann D. A., Seftor R. E., Hendrix M. J. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. — 2002. — Vol. 44. — P. 17—27.

29. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases / Xu L., Shen S. S., Hoshida Y., Subramanian A., Ross K., Brunet J. P., Wagner S. N., Ra-maswamy S., Mesirov J. P., Hynes R. O. // Mol. Cancer Res. — 2008. — Vol. 6. — P. 760—769.

30. Winnepenninckx V., van den Oord J. J. Gene expression profiling of primary cutaneous melanoma // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. — 2007. — Vol. 69. — P. 23—45.

31. Molecular plasticity of human melanoma cells / Hendrix M. J., Seftor E. A., Hess A. R., Seftor R. E. // Oncogene. — 2003. — Vol. 22. — P. 3070—3075.

32. Osteopontin as a molecular prognostic marker for melanoma / Rangel J., Nosrati M., Torabian S., Shaikh L., Leong S. P., Haqq C., Miller J. R. 3rd, Sagebiel R. W., Kashani-Sabet M. // Cancer. — 2008. — Vol. 112. — P. 144—150.

33. Roadmap for new opportunities in melanoma research / Her-lyn M., Halaban R., Ronai Z., Schuchter L., Berwick M., Pinkel D. // Semin. Oncol. — 2007. — Vol. 34. — P. 566—576.

34. Varney M. L., Johansson S. L., Singh R. K. Tumour-associated macrophage infiltration, neovascularization and aggressiveness in malignant melanoma: role of monocyte chemotactic protein-1 and vascu-

lar endothelial growth factor-A // Melanoma Res. — 2005. — Vol. 15. — P. 417—425.

35. Progression in cutaneous malignant melanoma is associated with distinct expression profiles: a tissue microarray-based study / Alonso S. R., Ortiz P., Pollan M., Perez-Gomez B., Sanchez L., Acuna M. J., Pajares R., Martinez-Tello F. J., Hortelano C. M., Piris M. A., Rodriguez-Peralto J. L. // Am. J. Pathol. — 2004. — Vol. 164. — P. 193—203.

36. Tenascin C: a defensive role in sentinel lymph nodes of melanoma patients? / Gazzaniga P., Cigna E., Vincenzi B., Bottoni U., Vasatu-ro F., Alfano C., Calvieri S., Frati L., Scuderi N., Agliano A. M., Gradilo-ne A. // J. Dermatol. Sci. — 2009. — Vol. 53. — P. 239—241.

37. Quinones L. G., Garcia-Castro I. Characterization of human melanoma cell lines according to their migratory properties in vitro // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. — 2004. — Vol. 1—2. — P. 35—42.

38. Tumor-derived fibronectin is involved in melanoma cell invasion and regulated by V600E B-Raf signaling pathway / Gaggioli C., Robert G., Bertolotto C., Bailet O., Abbe P., Spadafora A., Bahadoran P., Ortonne J. P., Baron V., Ballotti R., Tartare-Deckert S. // J. Invest. Dermatol. — 2007. — Vol. 127. — P. 400—410.

39. Tenascin-C in primary malignant melanoma of the skin / Ilmo-nen S., Jahkola T., Turunen J. P., Muhonen T., Asko-Seljavaara S. // His-topathology. — 2004. — Vol. 45. — P. 405—411.

40. Switch to an invasive growth phase in melanoma is associated with tenascin-C, fibronectin, and procollagen-I forming specific channel structures for invasion / Kaariainen E., Nummela P., Soikkeli J., Yin M., Lukk M., Jahkola T., Virolainen S., Ora A., Ukkonen E., Saksela O., Holt-ta E. // J. Pathol. — 2006. — Vol. 210. — P. 181—191.

41. Aberrant miR-182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia-associated transcription factor / Segura M. F., Hanniford D., Menendez S., Reavie L., Zou X., Alvarez-Di-az S., Zakrzewski J., Blochin E., Rose A., Bogunovic D., Polsky D., Wei J., Lee P., Belitskaya-Levy I., Bhardwaj N., Osman I., Hernando E. // Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. — 2009. — Vol. 106. — P. 1814—1819.

42. Cytoplasmic expression of nm23 predicts the potential for cerebral metastasis in patients with primary cutaneous melanoma / Sarris M., Scolyer R. A., Konopka M., Thompson J. F., Harper C. G., Lee C. S. // Melanoma Res. — 2004. — Vol. 14. — P. 23—27.

43. Dermatopathological indicators of poor melanoma prognosis are significantly inversely correlated with the expression of NM23 protein in primary cutaneous melanoma / Ferrari D., Lombardi M., Ricci R., Michiara M., Santini M., De Panfilis G. // J. Cutan. Pathol. — 2007. — Vol. 34. — P. 705—712.

44. Gene expression profiling of primary cutaneous melanoma and clinical outcome / Winnepenninckx V., Lazar V., Michiels S., Des-sen P., Stas M., Alonso S. R., Avril M. F., Ortiz Romero P. L., Robert T., Balacescu O., Eggermont A. M., Lenoir G., Sarasin A., Tursz T., van den Oord J. J., Spatz A.; Melanoma Group of the European Organization for Research and Treatment of Cancer // J. Natl. Cancer Inst. — 2006. — Vol. 98. — P. 472—482.

45. Utikal J., Schadendorf D., Ugurel S. Serologic and immunohisto-chemical prognostic biomarkers of cutaneous malignancies // Arch. Dermatol. Res. — 2007. — Vol. 298. — P. 469—477.

46. The gene expression signatures of melanoma progression / Haqq C., Nosrati M., Sudilovsky D., Crothers J., Khodabakhsh D., Pulliam B. L., Federman S., Miller J. R. 3rd, Allen R. E., Singer M. I., Leong S. P., Ljung B. M., Sagebiel R. W., Kashani-Sabet M. // Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. — 2005. — Vol. 102. — P. 6092—6097.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

47. Transcriptional regulation of the melanoma prognostic marker melastatin (TRPM1) by MITF in melanocytes and melanoma / Miller A. J., Du J., Rowan S., Hershey C. L., Widlund H. R., Fisher D. E. // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. — P. 509—516.

48. Molecular diagnostics in melanoma / Carlson J. A., Ross J. S., Slo-minski A., Linette G., Mysliborski J., Hill J., Mihm M. Jr. // J. Am. Acad. Dermatol. — 2005. — Vol. 52. — P. 743—775.

49. Human melastatin 1 (TRPM1) is regulated by MITF and produces multiple polypeptide isoforms in melanocytes and melanoma / Zhiqi S., Soltani M. H., Bhat K. M., Sangha N., Fang D., Hunter J. J., Setaluri V. // Melanoma Res. — 2004. — Vol. 14. — P. 509—516.

50. Chromogenic in situ hybridization analysis of melastatin mRNA expression in melanomas from American Joint Committee on Cancer stage I and II patients with recurrent melanoma / Hammock L., Cohen C., Carlson G., Murray D., Ross J. S., Sheehan C., Nazir T. M., Carlson J. A. // J. Cutan. Pathol. — 2006. — Vol. 33. — P. 599—607.

51. BRAF, NRAS and HRAS mutations in spitzoid tumours and their possible pathogenetic significance / Da Forno P. D., Pringle J. H., Fletcher A., Bamford M., Su L., Potter L., Saldanha G. // Br. J. Dermatol. — 2009. — Vol. 161. — P. 364—372.

52. NRAS and BRAF mutations in melanoma tumours in relation to clinical characteristics: a study based on mutation screening by pyrose-quencing / Edlundh-Rose E., Egyhazi S., Omholt K., Mansson-Brahme E., Platz A., Hansson J., Lundeberg J. // Melanoma Res. — 2006. — Vol. 16. — P. 471—478.

53. Cutaneous melanoma subtypes show different BRAF and NRAS mutation frequencies / Saldanha G., Potter L., Daforno P., Pringle J. H. // Clin. Cancer Res. — 2006. — Vol. 12. — P. 4499—4505.

54. BRAF polymorphisms and risk of melanocytic neoplasia / James M. R., Roth R. B., Shi M. M., Kammerer S., Nelson M. R., Stark M. S., Dumenil T., Montgomery G. W., Hayward N. K., Martin N. G., Braun A., Duffy D. L. // J. Invest. Dermatol. — 2005. — Vol. 125. — P. 1252—1258.

55. BRAF and NRAS mutations are frequent in nodular melanoma but are not associated with tumor cell proliferation or patient survival / Akslen L. A., Angelini S., Straume O., Bachmann I. M., Molven A., Hemminki K., Kumar R. // J. Invest. Dermatol. — 2005. — Vol. 125. — P. 312—317.

56. Mutational analysis of the BRAF gene in human congenital and dysplastic melanocytic naevi / Papp T., Schipper H., Kumar K., Schiff-mann D., Zimmermann R. // Melanoma Res. — 2005. — Vol. 15. — P. 401—407.

57. Functional RET G691S polymorphism in cutaneous malignant melanoma / Narita N., Tanemura A., Murali R., Scolyer R. A., Huang S., Arigami T., Yanagita S., Chong K. K., Thompson J. F., Morton D. L., Hoon D. S. // Oncogene. — 2009. — Vol. 28. — P. 3058—3068.

58. Distinct sets of genetic alterations in melanoma / Curtin J. A., Fridlyand J., Kageshita T., Patel H. N., Busam K. J., Kutzner H., Cho K. H., Aiba S., Brocker E. B., LeBoit P. E., Pinkel D., Bastian B. C. // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 353. — P. 2135—2147.

59. Malignant melanoma in the 21st century: the emerging molecular landscape / Sekulic A., Haluska P. Jr, Miller A. J., Genebriera De Lamo J., Ejadi S., Pulido J. S., Salomao D. R., Thorland E. C., Vile R. G., Swanson D. L., Pockaj B. A., Laman S. D., Pittelkow M. R., Markovic S. N.; Melanoma Study Group of Mayo Clinic Cancer Center // Mayo Clin. Proc. — 2008. — Vol. 83. — P. 825—846.

60. Melanoma: molecular pathogenesis and emerging target therapies / Russo A. E., Torrisi E., Bevelacqua Y., Perrotta R., Libra M., McCu-brey J. A., Spandidos D. A., Stivala F., Malaponte G. // Int. J. Oncol. —

2009. — Vol. 34. — P. 1481 — 1489.

61. WT 1 expression in nevi and melanomas: a marker of melanocytic invasion into the dermis / Garrido-Ruiz M. C., Rodriguez-Pinilla S. M., Perez-Gomez B., Rodriguez-Peralto J. L. // J. Cutan. Pathol. — 2010. — Vol. 37, N 5. — P. 542—548.

Поступила 12.01.2010

Irina Nikolayevna Mikhaylova1, Dmitry Anatolyevich Kovalevsky2,

Yana Vladimirovna Vishnevskaya3, Igor Aglyamovich Utyashev4,

Valentina Alekseyevna Golubeva5, Eugeniy Aleksandrovich Cheremushkin6, Somasundaram Subramanian7, Tatiana Tikhonovna Kondratyeva8,

Sergey Lvovich Kiselev9, Lev Vadimovich Demidov10,

Anatoliy Yuryevich Baryshnikov11, Robert Shalvovich Bibilashvilli12

CANCER/TESTIS ANTIGENIC GENE EXPRESSION IN PRIMARY HUMAN MELANOMA

‘MD, PhD, Leading Researcher, Tumor Biotherapy Department, Clinical Oncology Research. Institute,