CC BY
42
Д. А. Широков1, Е. Н. Шолохова1, В. Э. Гурцевич2, Н. Н. Тупицын1 ЭКСПРЕССИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО И ВИРУСНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 ПРИ
неходжкинских лимфомах
1 НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2 НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Исследована внутриклеточная экспрессия человеческого и вирусного интерлейкина-6 при неходжкинских лимфомах на уровне мРНК. Изучен биопсийный материал, полученный от 36 больных. Показано, что мРНК человеческого интерлейкина-6 экспрессируют 75% неходжкинских лимфом, а мРНК вирусного интерлейкина-6 — 11%. Полученные данные позволяют выявить группу больных не-ходжкинскими лимфомами, экспрессирующими вирусный интерлейкин-6. Этот цитокин может служить объектом специфической иммунотерапии, т. к. не содержит антигенных детерминант, присущих человеческому интерлейкину-6.
Ключевые слова: вирусный интерлейкин-6, интерлейкин-6 человека, неходжкинские лимфомы, HHV-8.
Интерлейкин-6 человека ф^-6) по многообразию клеточных источников продукции и мишеней биологического действия является одним из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции. Секретируемый hIL-6 состоит из 184 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 21 кДа. В зависимости от степени гликозилирования наблюдается гетерогенность hIL-6 по молекулярной массе. Интерлейкин-6 входит в семейство gp130-цитокинов (цитокинов hIL-6), которые имеют общую мембранную рецепторную молекулу. Помимо hIL-6 в это семейство входят еще 5 цитокинов: лейкоз-ингиби-рующий фактор ^Ш), онкостатин М (OSM), кардиотро-фин-1 (СТ-1), цилиарный нейротрофный фактор (CNTF) и интерлейкин-11 (^-11). Молекула gp130 является одновременно и рецептором цитокинов, и трансдуктором сигнала с мембраны в цитоплазму клеток.
Убедительно доказано, что hIL-6 регулирует размножение опухолевых клеток и развитие резистентности к химиотерапии и гормонотерапии при множественной миеломе и неходжкинских лимфомах (НХЛ). Так, целый ряд авторов отметили выраженную экспрессию hIL-6 при диффузной B-крупноклеточной лимфоме [10], лим-фоме Беркитта [5], фолликулярной лимфоме [4], а также при Т-клеточных лимфомах [11]. Исследования проводили как серологическими, так и молекулярно-биологическими методами.
Проблема осложняется тем, что недавно открыт новый цитокин семейства hIL-6, который способен непос-
© Широков Д. А., Шолохова Е. Н., Гурцевич В. Э., Тупицын Н. Н., 2007 УДК 616-006.441-085.37
редственно воздействовать на gp130 и вызывать его гомо-димеризацию на поверхности нормальных и опухолевых клеток. Это вирусный интерлейкин-6 ^^-6) — цитокин вирусного происхождения, закодированный в геноме вируса герпеса человека 8 типа (HHV-8) [7]. Этот цитокин по аминокислотному составу на 24% гомологичен Ь^-6, способен действовать на клетки человека и воспроизводить почти все эффекты Ь^-6 [8].
HHV-8 — последний из открытых онкогенных вирусов человека [3]. Хорошо изучена этиологическая роль этого вируса при саркоме Капоши и мультицентрической болезни Кастельмана. Связана с данным вирусом и крайне редкая периферическая крупноклеточная НХЛ — описанная недавно первичная лимфома серозных полостей [2]. Важную роль в стимуляции роста этих опухолей играет продуцируемый инфицированными клетками vIL-6. Связь с HHV-8 показана не только для первичной лимфомы серозных полостей, но и для других В-крупно-клеточных лимфом, а также для фолликулярной лимфо-мы и мальтомы. Вероятно, vIL-6 участвует в развитии и этих НХЛ [1].
В нашей работе исследована экспрессия Ь^-6 и vIL-6 на уровне мРНК при разных периферических НХЛ и лимфомах из клеток-предшественников. Сравнение экспрессии этих двух цитокинов в нашей стране проведено впервые. Диагноз НХЛ подтверждали при гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях, а также при проточной цитометрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РНК выделяли по стандартной методике. К клеточной суспензии добавляли гуанидин-тиоцианатный буферный раствор (4 М гуанидина тиоцианат, 25 мМ цитрата
натрия, pH 7,0, 0,5% N-лауроилсаркозилат натрия, 0,1% Р-меркаптоэтанол), выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 10% по объему 3 М раствора ацетата натрия (рН 5,0), активно перемешивали содержимое пробирки. Далее добавляли равный объем фенола, выдерживали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли смесь хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), активно перемешивали и центрифугировали со скоростью 13 400 об/мин в течение 10 мин. Затем отбирали верхнюю фазу, переносили в новую пробирку и повторяли экстракцию с фенолом и хлороформом. После этого отбирали водную фазу, добавляли 2,5 объема этилового спирта и ставили на ночь в морозильную камеру при температуре —20°С. Далее отделяли от спирта на центрифуге со скоростью 13 400 об/мин в течение 10 мин. Осадок высушивали и ресуспендировали деионизованной водой.
Обратную транскрипцию проводили стандартным методом в объеме 40 мкл. К 20 мкл РНК добавляли 2 мкл политимидинового олигонуклеотида (18 звеньев). После этого помещали пробирку в термостат при температуре 70°С на 5 мин. Затем добавляли 8 мкл буферного раствора для обратной транскрипции, 4 мкл смеси дезоксирибо-нуклеотидов, 4 мкл ингибитора рибонуклеазы и помещали пробирку в термостат при температуре 37°С на 5 мин. После этого добавляли 2 мкл обратной транскриптазы MMulV (Molony mouse leukemia virus — вирус мышиного лейкоза Молони) и помещали пробирку в термостат при температуре 42°С на 1 ч. Фермент инактивировали в течение 10 мин при температуре 70°С.
Полимеразную цепную реакцию проводили на ампли-фикаторе «Терцик» (Россия). Для каждой пары праймеров использовали индивидуальную программу. Для амплификации использовали следующие пары праймеров:
1) прямой праймер гена vIL-6: 5'-CAGCCATATGATGT GCTGGTTCAAGTTGTG-3', обратный праймер гена vIL-6: 5'-AGCACTCGAGTTACTTATCGTGGACGTCAG-3';
2) прямой праймер гена hIL-6: 5'-
CCTGAACCTTCCAAAGATGG-3', обратный праймер гена hIL-6: 5'-CATTTGCCGAAGAGCCCTCA-3';
3) прямой праймер гена Р-глобина: 5'-
CTGGGCAGGCTGCTGGTG-3', обратный праймер гена Р-глобина: 5'-GCTTGTCACAGTGCAGCTC-3';
4) прямой праймер гена ORF26: 5'-
AGCCGAAAGGATTCCACCAT-3'; обратный праймер гена ORF26: 5'- CTGGACGTAGACAACACGGA-3';
5) прямой праймер гена K1: 5'-GACCTTGTTGGACAT CCCGTACAATC-3', обратный праймер гена K1: 5'-AGGC CATGCTGTAAGTAGCACGGTT-3';
6) прямой праймер гена GAPDH: 5'-
AGTCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3', обратный праймер гена GAPDH: 5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3'.
Для разделения амплифицированных фрагментов использовали 1,7% легкоплавкую агарозу в трис-боратном буферном растворе с добавлением бромистого этидия.
Для проточной цитометрии брали отмытые клетки, которые в течение 30 мин инкубировали при температуре 4°С с мечеными флуорохромами моноклональными антителами, разведенными в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% NaN3. После двойной промывки в этом буферном растворе анализировали клетки на проточном цитометре FACScan («Becton Dickinson», Mountain View, США). Использовали моноклональные антитела к маркерам дифференцировки лейкоцитов: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD61, CD64, CD138, HLA-DR, гликофори-ну А, CD45 («Dako», Дания). Для точной идентификации лимфомных клеток использовали тройное флуоресцентное окрашивание.
Для иммуногистохимического исследования замороженные срезы толщиной 4—6 мкм помещали по три на обезжиренные предметные стекла, фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 с. Перед окраской антителами срезы фиксировали в ацетоне в течение 10 мин при температуре 4°С. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Срезы инкубировали в течение 10 мин в среде 199 (рН 7,2—7,4). Моноклональные антитела наносили на 30 мин. Отмывали в среде 199 в течение 10 мин. Затем на 30 мин наносили антисыворотки к глобулинам белой мыши, меченные флуоресцеина изотиоцианатом по F(ab)2-фрагментам. Отмывали 10 мин в среде 199. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы закрывали покровными стеклами и определяли антигеноположительные клетки и структуры.
При иммунологическом фенотипировании биопсийного материала по криостатным срезам мы использовали панель моноклональных антител к следующим антигенам: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20, CD21, CD23, CD37, CD38, HLA-DR.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследование были включены 36 образцов опухолевой ткани (в основном биопсийный материал), полученных от больных разными вариантами НХЛ. Всего таких вариантов было выявлено 10. Изучены 12 случаев фолликулярной лимфомы, 10 случаев диффузной В-крупноклеточной лимфомы, 4 случая Ki-1-крупнокле-точной анапластической лимфомы, 3 случая лимфомы из предшественников Т-лимфоцитов, 2 случая лимфомы Беркитта, 1 случай первичной медиастинальной В-круп-ноклеточной лимфомы, 1 случай лимфомы из малых лимфоцитов (хронический лимфолейкоз), 1 случай периферической Т-клеточной лимфомы, 1 случай лимфомы маргинальной зоны селезенки и 1 случай первичной лим-фомы серозных полостей. В большинстве случаев изучали биопсийный материал, в 3 случаях изучали клетки, полученные из плевральной полости, клетки, полученные из полости перикарда, и бласты крови.
Диагноз у всех больных был верифицирован при им-муногистохимическом исследовании на криостатных срезах с применением широкой панели моноклональных антител. Во всех случаях использовали антитела к CD3, CD5, CD7 (Т-клеточные маркеры), CD10 (CALLA — общий антиген острого лимфобластного лейкоза), CD19, CD20 (В-клеточные маркеры), CD38 (НАД-рибозилцик-лаза, активационный антиген), CD45 (общий лейкоцитарный антиген) и HLA-DR (часть HLA класса II). Для верификации диагноза использовали дополнительные маркеры, такие, как CD^, CD2, CD4, CD8, CD13, CD15, CD21, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD35, CD56, CD61, CD64, CD138, Ki-67, bcl2, PCNA, IgM, IgG, IgA, легкие цепи иммуноглобулинов к и X.
Результаты исследования экспрессии мРНК hIL-6 и vIL-6 представлены в табл. 1. Экспрессию hIL-6 наблюдали в 27 (75%) из 36 случаев, vIL-6 — в 4 (11%). Экспрессию vIL-6 обнаружили у 1 больного с фолликулярной лимфо-мой, у 2 пациентов с лимфомой из предшественников Т-лимфоцитов и у 1 больного с первичной лимфомой серозных полостей. Экспрессия обоих цитокинов при каждом типе НХЛ представлена в табл. 2.
Представленные результаты являются, с одной стороны, ожидаемыми, с другой — совершенно новыми. Ожидаемой явилась высокая частота экспрессии hIL-6 при большинстве НХЛ. Экспрессия vIL-6 для наиболее распространенных форм НХЛ не характерна. Она практически отсутствует при периферических лимфомах Т-, В-клеточной и нулевой (Ki-1) природы. Экспрессию vIL-6 выявили лишь в 1 наблюдении фолликулярной лимфомы. Этот случай, по нашим данным, не имел иммунофеноти-пических особенностей.
Совершенно неожиданной явилась высокая частота обнаружения vIL-6 при лимфомах из предшественников Т-лимфоцитов. Это очень редкие НХЛ. Нами изучено 3 случая, в 2 из них выявлен vIL-6. Для статистической достоверности, безусловно, необходимо проанализировать большее число таких НХЛ. Лимфомы из предшественников Т-лимфоцитов представляют особый интерес, потому что основным резервуаром HHV-8 считаются В-лимфоциты, менее значимыми — моноциты, клетки эндотелия и эпителия. Тем не менее в литературе описаны случаи HHV-8-ассоциированных опухолей Т-клеточ-ной природы. В частности, известны HHV-8-позитивные первичные лимфомы серозных полостей с Т-клеточным фенотипом [6; 10]. Таким образом, наши данные подтверждают возможность присутствия HHV-8 в предшественниках Т-лимфоцитов.
Важным достижением стало выявление и детальное описание первого в России случая HHV-8-позитивной первичной лимфомы серозных полостей. Эта лимфо-ма достаточно трудна для диагностики, т. к. экссудаты в серозных полостях встречаются и при других НХЛ. Помимо этого, будучи В-клеточной по своей природе, эта лимфома может не экспрессировать В-клеточных марке-
ров. Выявленный нами случай первичной лимфомы серозных полостей отличался высоким уровнем экспрессии В-клеточного антигена CD20, активационного антигена CD38 и HLA-DR. Необычным было отсутствие экспрессии синдекана-1 (CD138), которая весьма характерна для данной патологии.
Плевральный экссудат, полученный от больного, исследован в реакции непрямой иммунофлуоресценции на наличие антител к белкам 2 герпесвирусов — HHV8 и вируса Эпштейна—Барр. Выявлены высокие титры антител к белкам обоих вирусов. При полимеразной цепной реакции на 3 гена HHV8 (K1, K2 и ORF26) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на экспрессию мРНК hIL-6 и vIL-6 в опухолевых клетках выявлены все гены-мишени и экспрессия hIL-6 и vIL-6.
Уникальность обнаруженного нами случая первичной лимфомы серозных полостей заключается в том, что больной не был инфицирован ВИЧ, хотя по литературным данным известно, что эта патология практически всегда развивается на фоне СПИДа. Этот случай оказался всего лишь 23-й ВИЧ-негативной первичной лимфомой серозных полостей, описанной в мировой литературе.
Практическая значимость работы складывается из двух аспектов: диагностического и, в перспективе, имму-нотерапевтического. Диагностический аспект заключается в разработке и внедрении в клиническую практику молекулярной диагностики периферичеких В-клеточных НХЛ (в первую очередь первичной лимфомы серозных полостей) и лимфом из предшественников Т-лимфоцитов, основанной на выявлении экспрессии опухолевыми клетками vIL-6. Этот цитокин имеет уникальные антигенные детерминанты, что делает его потенциальной мишенью для иммунотерапии, если он экспрессируется при НХЛ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ablashi D. V., Chatlynne L. G, Whiteman G. E. et al. Spectrum of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, or human herpesvirus 8, diseases // Clin. Microbiol. Rev. — 2002. — Vol. 15, N 3. — P. 439—464.
2. Ansari M. Q, Dawson D. B., Nador R. et al. Primary body cavity-based AIDS-related lymphomas // Am. J. Clin. Pathol. — 1996. — Vol. 105, N 2. — P. 221—229.
3. Chang Y., Cesarman E., Pessin M. S. et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma // Science. — 1994. — Vol. 266. — P. 1865—1869.
4. Emilie D, Leger-Ravet M.-B, Devergne O. et al. Intratumoral production of IL-6 in B cell chronic lymphocytic leukemia and B lymphomas // Leuk. Lymphoma. — 1993. — Vol. 11. — P. 411—417.
5. Klein S. C., Jucker M., Abts H. et al. IL6 and IL6 receptor expression in Burkitt's lymphoma and lymphoblastoid cell lines: promotion of IL6 receptor expression by EBV // Hematol. Oncol. — 1995. — Vol. 13, N 3. — P. 121—130.
6. Lechapt-Zalcman E., Challine D., Delfau-Larue M. H. et al. Association of primary pleural effusion lymphoma of T-cell origin and human herpesvirus 8 in a human immunodeficiency virus-seronegative man // Arch. Pathol. Lab. Med. — 2001. — Vol. 125. — P. 1246—1248.
7. Neipel F., Albrecht J. C., Ensser A. et al. Human herpesvirus 8 encodes a homolog of interleukin-6 // J. Virol. — 1997. — Vol. 71. — P. 839—842.
8. Osborne J., Moore P. S., Chang Y. KSHV-encoded viral IL-6 activates multiple human IL-6 signaling pathways // Hum. Immunol. — 1999. — Vol. 60. — P. 921—927.
Таблица 1
Экспрессия hlL-6 и vlL-6 при разных НХЛ
Код больного Диагноз Экспрессия
hlL-6 ^-6
ЕМС Фолликулярная лимфома + -
ССБ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ВВФ Лимфома маргинальной зоны селезенки + -
ВЛК Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ЗФК Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ААР Фолликулярная лимфома + -
ВВЯ Фолликулярная лимфома + -
ММС Фолликулярная лимфома - -
РАА Лимфома Беркитта + -
ОХМ Периферическая Т-клеточная лимфома + -
ННЩ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ТИК Фолликулярная лимфома - -
ЛСК Лимфома из малых лимфоцитов (хронический лимфолейкоз) + -
АГУ КИ-крупноклеточная анапластическая лимфома + -
НАБ Фолликулярная лимфома + -
НИН Фолликулярная лимфома - +
АИБ Фолликулярная лимфома + -
ВИА Фолликулярная лимфома + -
ГКБ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ТПГ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ГЛЗ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ПНГ Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома + -
АЕЗ Диффузная В-крупноклеточная лимфома + -
ЛНС Фолликулярная лимфома + -
ВАС Лимфома из Т-предшественников - +
АИК КИ-крупноклеточная анапластическая лимфома + -
ААК КИ-крупноклеточная анапластическая лимфома - -
ЮАВ Лимфома из предшественников Т-лимфоцитов + +
ВИИ КИ-крупноклеточная анапластическая лимфома - -
НАД Фолликулярная лимфома + -
ЗНО Фолликулярная лимфома + -
ИАК Диффузная В-крупноклеточная лимфома - -
ЮБЕ Диффузная В-крупноклеточная лимфома - -
АИЧ Лимфома из предшественников Т-лимфоцитов - -
КТИ Лимфома Беркитта + -
АХА Первичная лимфома серозных полостей + +
Таблица a
Экспрессия vIL-6 и h IL-6 клетками НХЛ
Тип НХЛ Общее число случаев Экспрессия vIL-6 Экспрессия hIL-6
абс. % абс. %
Фолликулярная 12 i 8,3 g 75
Диффузная В-крупноклеточная io o o 8 8o
Ki-i-крупноклеточная анапластическая 4 o o 2 5o
Из предшественников Т-лимфоцитов 3 2 66,7 i 33,3
Беркитта 2 o o 2 ioo
Маргинальной зоны селезенки i o o i ioo
Первичная медиастинальная В-крупно-клеточная i o o i ioo
Из малых лимфоцитов (хронический лимфолейкоз) i o o i ioo
Периферическая Т-клеточная i o o i ioo
Первичная серозных полостей i i ioo i ioo
9. Preti H. A., Cabanillas F., Talpaz M. et al. Prognostic value of serum interleukin-6 in diffuse large-cell lymphoma // Ann. Intern. Med. — 1997. — Vol. 127. — P. 186—194.
10. Said J. W., Shintaku I. P., Asou H. et al. Herpesvirus 8 inclusions in primary effusion lymphoma. Report of a unique case with T-cell phenotype // Arch. Pathol. Lab. Med. — 1999. — Vol. 123. — P. 257—260.
11. Yamamura M., Yamada Y., Momita S. et al. Circulating interleukin-6 levels are elevated in adult-T cell leukemia/lymphoma patients and correlate with adverse clinical features and survival // Br. J. Haematol. — 1998. — Vol. 100. — P. 129—134.
Поступила 15.11.2006
D. A. Shirokov1, E. N. Sholokhova1, V. E. Gurtsevich2, N. N. Tupitsyn1
HUMAN AND VIRAL INTERLEUKIN-6 EXPRESSION IN NON-HODGKIN'S LYMPHOMAS
1 Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
2 Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
Intracellular expression of human and viral interleukin-6 mRNA was studied in biopsy specimens from 36 patients with non-Hodgkin's lymphomas. Human interleukin-6 mRNA expression was found in 75% and viral interleukin-6 mRNA was expressed in 11% of non-Hodgkin's lymphomas. This test may therefore identify a group of patients with non-Hodgkin's lymphomas expressing viral interleukin-6. The virokine may be a useful target for specific immunotherapy because it has no antigen determinants specific of human interleukin-6.
Key words: human interleukin-6, viral interleukin-6, non-Hodgkin's lymphomas, HHV-8.
