CC BY
202
DOI: 10.15690/onco.v3i2.1547
Т.Т. Валиев1, А.М. Ковригина2, Ю.И. Ключагина3, А.И. Сендерович4
НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,
Москва, Российская Федерация Гематологический научный центр Минздрава России, Москва, Российская Федерация Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Минздрава России, Москва, Российская Федерация 4 НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,
Москва, Российская Федерация
Опыт цитогенетических исследований при неходжкинских лимфомах у детей
Неходжкинские лимфомы (НХЛ) представлены гетерогенной группой злокачественных новообразований, возникающих из различных по происхождению и уровню дифференцировки клеток лимфо-идной ткани, различающихся по морфологической картине, иммунологическим и цитогенетическим характеристикам, клиническим проявлениям, ответу на терапию, прогнозу и выживаемости больных. Цитогенетическим характеристикам НХЛ, роли цитогенетических аберраций в лимфомогенезе и месту цитогенетического анализа в диагностике НХЛ у детей посвящена настоящая статья. Особое внимание в работе уделено опыту применения иммуногистохимических (суррогатных) маркеров, позволяющих судить о цитогенетических изменениях при НХЛ.
Ключевые слова: цитогенетическое исследование, неходжкинские лимфомы, диагностика, дети. (Для цитирования: Валиев Т.Т., Ковригина А.М., Ключагина Ю.И., Сендерович А.И. Опыт цитогенетических исследований при неходжкинских лимфомах у детей. Онкопедиатрия. 2016;3(2):125-132. doi: 10.15690/onco.v3i2.1547)
125
АКТУАЛЬНОСТЬ
Эпидемиология
Неходжкинские лимфомы (НХЛ) составляют 7-10% общего числа всех злокачественных опухолей у детей до 15 лет, занимают третье место в структуре
детской заболеваемости злокачественными новообразованиями после острых лейкозов и опухолей центральной нервной системы [1, 2]. Наиболее часто НХЛ диагностируются у детей в возрасте 5-9 лет, значительно реже — на 1-2-м году жизни [1, 3].
T.T. Valiev1, A.M. Kovrigina2, Yu.I. Kluchagina3, A.I. Senderovich4
Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N. Blokhin National Cancer Research Center
of Ministry of Health, Moscow, Russian Federation Hematology Research Center of Ministry of Health, Moscow, Russian Federation I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of Ministry of Health, Moscow, Russian Federation 4 Clinical Oncology Research Institute of N.N. Blokhin National Cancer Research Center of Ministry of Health, Moscow, Russian Federation
Cytogenetic Research Experience in Pediatric Non-Hodgkin's Lymphomas
Non-Hodgkin's lymphomas (NHL) are heterogeneous group of malignant tumours, arising from different types of lymphoid cells differentiation, different in morphology, immunology, and cytogenetic characteristics, clinical features, and treatment response, prognosis, and patients survival. Current article is about NHL cytogenetic features, it's role in lymphomagenesis, and place of cytogenetic method in NHL diagnosis.Practical use of immunohistichemical («surrogate») markers for cytogenetic aberrations prognosis is emphasized.
Key words: cytogenetic analysis, non-Hodgkin,s lymphomas, diagnosis, children.
(For citation: Valiev T.T., Kovrigina A.M., Kluchagina Yu.I., Senderovich A.I. Cytogenetic Research Experience in
Pediatric Non-Hodgkin's Lymphomas. Onkopediatria. 2016;3(2):125-132. Doi:10.15690/onco.v3i2.1547)
Этиология и патогенез
Уникальной особенностью НХЛ является чрезвычайное разнообразие морфоиммунологиче-ских вариантов, несмотря на то, что все они имеют одинаковое происхождение — из лимфоидной ткани.
Несмотря на детальное описание клинических и морфоиммунологических характеристик НХЛ, использование современных программ дифференцированной терапии, этиология НХЛ в большинстве случаев остается неизвестной. По мере накопления сведений о цитогенетических особенностях опухолевой клетки было установлено, что в основе лимфомогенеза при НХЛ лежат мутации, способствующие активации протоонкогенов (MYC, BCL-2, BCL-6, PIM-1, PAX-5) и инактивации антионкогенов (p16INK4a, P53, P27KIP1) на фоне иммунной недостаточности, что более характерно для НХЛ с агрессивным клиническим течением. Сообщается о потенциально онкогенной при НХЛ роли факторов окружающей среды: химических веществ (гербициды, феноксиацетиловая кислота, хлорофенолы, химиотерапия в анамнезе), физических воздействий (лучевая терапия в анамнезе, высокий уровень радиационного фона); врожденных (синдромы Вискотта-Олдрича, Дауна, Клайнфельтера, Луи-Бар) и приобретенных (ВИЧ-инфекция, трансплантация солидных органов) иммунодефицитных состояний; инфекционных агентов (вирус Эпштейна-Барр, Helicobacter pylori, HTLV-1, HHV-8 и др.), аутоиммунных заболеваний (синдром Шегрена, ревматоидный артрит, системная красная волчанка), но их роль при НХЛ у детей продолжает изучаться [4-6].
Диагностика
В диагностике НХЛ следует учитывать морфо-иммунологические и молекулярно-генетические характеристики опухоли. Цитогенетические изменения при НХЛ имеют ряд особенностей: наиболее частыми структурными изменениями являются транслокации, главным образом реципрокные, возникающие в результате разрывов в негомологичных хромосомах, со взаимным (реципрокным) обменом поврежденными участками. Реже в патогенезе НХЛ имеют значение другие цитогенетические изменения: образование изохромосом и численные изменения кариотипа (моносомии, три-сомии, полиплоидия, гиперплоидия). Неслучайно встречающиеся цитогенетические аберрации отражают моноклональный характер опухолевой пролиферации.
Лимфома Беркитта
Наиболее частым (до 50%) вариантом НХЛ у детей является лимфома Беркитта (ЛБ), которая в подавляющем большинстве случаев представлена классическим гистологическим вариантом, с экспрессией CD19, CD20, CD10, CD22, sIgM, высоким уровнем Ki-67 при отсутствии маркеров Т кле-
ток CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8) и клеток-
предшественниц ^34, Т((Т) [7, 8].
Для ЛБ характерны цитогенетические аномалии, затрагивающие 8-ю хромосому, на которой расположен протоонкоген c-MYC — ^8;14) Й24^32), реже ^8;22Хд24;д11), ^2;8)(р11-12,д24). В 80% случаев определяется транслокация ^8;14) ^24^32) — перестройка локусов генов с-MYC (8д24) и тяжелых цепей ^Н (14д32). Реже встречаются перестройки с-MYC с локусами легких цепей иммуноглобулинов в 15% случаев выявляется транслокация ^8;22)(д24;д11) — перестройка с локусом лямбда-цепи иммуноглобулинов и в 5% — транслокация ^2;8)(р11;д24) — перестройка с локусом каппа-цепи иммуноглобулинов. В результате данных транслокаций происходит нарушение регуляции протоонкогена с-MYC, который, попадая под действие активных промоторов, регулирующих экспрессию генов ^Н или приводит к гиперсинтезу протеина c-MYC —активного стимулятора клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [9-11].
Мутация c-MYC в 10% случаев классического гистологического варианта ЛБ не выявляется. Было доказано, что экспрессия с-MYC при ЛБ регулируется на посттранскрипционном и эпигенетическом уровнях. Транскрипционный фактор E2F1 является одним из ключевых белков, осуществляющих контроль активности с-MYC, функционально связан с системой микроРНК (miRNA), роль которых в патогенезе ЛБ активно изучается. miRNA участвуют в регуляции процессов клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [10, 12]. Ряд miRNA (1ла8-тНг-20а, 1ла8-тНг-17-5р, 1ла8-тНг-9) взаимодействует с транскрипционным фактором E2F1 и регулирует активность онкогена c-MYC. Было установлено, что повышение активности Иаз-тиг-20а и 1ла8-тНг-17-5р происходит при ЛБ независимо от наличия или отсутствия транслокаций с вовлечением с-MYC. При диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ) отмечена высокая активность другой miRNA — 1ла8-тНг-9, которая неактивна в случаях ЛБ с отсутствием транслокаций, вовлекающих с-MYC. Выявленные различия в активности miRNA при ДВККЛ и ЛБ могут служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием [11].
Еще одним механизмом, потенцирующим аберрации, затрагивающие с-MYC, является активация сигнальных путей с участием фосфоинозитид-3-ки-назы (Р13К) и циклина D3 [10, 13].
Стандартное цитогенетическое исследование при ЛБ позволяет обнаружить не только патогно-моничные реаранжировки c-MYC, но и аберрации, затрагивающие локусы 1д, 6д, 7д, 17р, а также определить дупликации или трисомии хромосом 1 и 7 и делеции хромосомы 6. Перестройки с участием 6д, 7д, 13д имеют неблагоприятный прогноз. При ЛБ, кроме описанных хромосомных аберраций, встречаются мутации и других генов — /03,
126
GNA13, RET, PIK3R1, SWI/SNF, ARID1A и SMARCA4, прогностическая и диагностическая значимость которых активно изучается [14].
Диффузная В-крупноклеточная лимфома
Частота встречаемости ДВККЛ у детей — до 20% всех НХЛ; представлена центробластным (66,7%), иммунобластным (12,2%), анапластическим (6,1%) и вариантом, богатым Т клетками/гистиоцитами (9,1%) [10, 15, 16]. Более 80% случаев ДВККЛ — это опухоль из В клеток герминального этапа дифференцировки, экспрессирующая CD10, BCL6 — при отсутствии MUM1.
Патогномоничная для взрослых больных транслокация t(14;18)(q32;q21) практически не встречается у детей, что свидетельствует о различных механизмах лимфомогенеза в разных возрастных популяциях [10]. Наиболее частой (20-40%) цито-генетической аберрацией при ДВККЛ является хромосомная транслокация t(3;14)(q27;q32), в результате которой онкоген BCL-6, расположенный в локусе 3q27, активируется за счет перемещения к гену тяжелой цепи IgH (14q32). Продукт этого онкогена — цинксодержащий белок BCL-6 — является фактором транскрипции, регулирующим процессы пролиферации и дифференцировки В клеток. При первичной медиастинальной (тими-ческой) В-крупноклеточной лимфоме (ПМВККЛ) транслокация t(3;14)(q27;q32) обычно не обнаруживается, но определяются транслокации с вовлечением гена JAK2.
В 1/3 случаев ДВККЛ происходит перестройка локусов гена c-MYC (8q24). При одновременном выявлении транслокации c-MYC и BCL-2 данные варианты В-НХЛ называют «double-hit lymphoma», а при одновременном выявлении транслокации c-MYC, BCL-2 и BCL-6 — «triple-hit lymphoma» [4, 10, 17]. Особенностями double- и triple-hit-лимфом являются агрессивное клиническое течение, хими-орезистентность и низкая выживаемость больных. Причина столь агрессивного течения опухолей, предположительно, связана с синергизмом воздействия онкогенов [18], что оказывает протек-тивное действие на В клетки, приводит к индукции пролиферации за счет работы антиапоптотическо-го сигнального каскада [19].
Т-лимфобластные лимфомы/лейкозы
Для Т-лимфобластных лимфом/лейкозов из клеток-предшественников (Т-ЛБЛ/ОЛЛ) характерна клональная перестройка генов Т-клеточного рецептора (TCR), одновременные реаранжировки гена тяжелых цепей IgH встречаются в 20% случаев. Изменения кариотипа выявляют у 50-70% пациентов с Т-ЛБЛ/ОЛЛ. Наиболее часто генетические аберрации затрагивают а- и ö-TCR, локализующиеся на 14q11.2, ß-локус — на 7q35 и у-локус — на 7р14-15 с близкорасположенными генами [20]. В результате эти транслокации приводят к нарушению регуляции транскрипции
соседних генов за счет близкого расположения с локусами TCR.
В 7% случаев Т-ЛБЛ/ОЛЛ в цитогенетические аберрации вовлечены гены, кодирующие транскрипционные факторы, — HOX11(TLX1) (10q24). На реаранжировки с вовлечением HOX11L2(TLX3) (5q35) приходится около 20% случаев. При других транслокациях возможно вовлечение генов MYC (8q24.1), TAL1 (1p32), RBTN1(LMO1) (11p15), RBTN2(LMO2) (11p13) и LYL1 (19p13). Цитоплазматическая тирозинкиназа LCK (lymphocyte kinase) (1p34.3-35) также может участвовать в транслокации. Локус гена TAL1 вовлекается в транслокации в 20-30% случаев Т-ЛБЛ/ ОЛЛ, при этом только в 3% можно определить ^1;14)(р32^11), чаще возможно слияние с геном SIL в результате делеции на хромосоме 1р32. Аберрантная экспрессия TAL1 препятствует клеточной дифференцировке и пролиферации за счет угнетения транскрипционной активности E47/ HEB. Другие важные транслокации при Т-ЛБЛ/ ОЛЛ включают ^10;11)(р13^14) (PICALM-MLLT10 [CALM-AF10]), которые отмечены в 10% случаев, и транслокации, вовлекающие MLL (8%), наиболее часто с соседним геном ENL на 19р13, но ни одна из них не является строго специфичной [10, 21, 22].
При Т-ЛБЛ/ОЛЛ возможны делеции: например, del(9p), которая приводит к утрате опухолевого гена-супрессора CDKN2A (ингибитора циклин-зависимой киназы CDK4) и выявляется в 30% случаев при цитогенетическом исследовании. Примерно у 50% пациентов встречаются мутации, вовлекающие домен внеклеточной гетеродимери-зации и/или конечный С-фрагмент PEST-домена гена NOTCH1, который кодирует белок, играющий ключевую роль в дифференцировке Т клеток. В 30% случаев выявляют мутации гена FBXW7 — обратного регулятора NOTCH1. Эти миссенс-мута-ции возникают в результате увеличения времени существования белка NOTCH1 [10, 21, 22].
В-лимфобластные лимфомы/лейкозы
Если при Т-ЛБЛ/ОЛЛ прогностическая роль цитогенетических аберраций не определена, то в случаях В-лимфобластных лимфом/лейкозов из клеток-предшественников (В-ЛБЛ/ОЛЛ) выявляемые аномалии кариотипа ассоциированы с прогнозом заболевания. Так, благоприятными в прогностическом плане (вероятность выздоровления около 90%) являются варианты опухоли с гипердиплоидным набором хромосом (как правило, от 50 до 66) при отсутствии транслокаций и других хромосомных аномалий. Вариант В-ЛБЛ/ОЛЛ с гипердиплоидностью достаточно распространен у детей (за исключением новорожденных, у которых он не встречается): на его долю приходится до 25% случаев. Определяются дупликация хромосом 21, Х, 14 и 4, реже — 1, 2 и 3. Трисомии с вовлечением хромосом 4, 10 и 17 прогностически наиболее благоприятны [21]. Хороший прогноз отмечен при
В-ЛБЛ/ОЛЛ с t(12;21)(p13;q22), а также при вариантах с транслокацией между геном TEL(ETV6) на хромосоме 12 и геном AML1(RUNX1), расположенным на хромосоме 21, составляющих у детей до 25% случаев. При варианте В-ЛБЛ/ОЛЛ, ассоциированном с t(12;21)(p13;q22) и наличием неблагоприятных факторов прогноза (возраст старше 10 лет, гиперлейкоцитоз), результаты лечения значительно хуже [22, 23].
К прогностически неблагоприятным вариантам В-ЛБЛ/ОЛЛ относят случаи заболевания с транслокацией t(v;11q23), реаранжировками гена MLL, которые чаще встречаются у детей до одного года жизни. У больных старше одного года данный вариант наблюдается все реже, но уже в зрелом возрасте частота его снова возрастает. Случаи В-ЛБЛ/ОЛЛ c t(v;11q23), реаранжировками MLL без вовлечения в процесс костного мозга крайне редки [10, 21, 22].
Гиподиплоидный вариант В-ЛБЛ/ОЛЛ характеризуется числом хромосом в бластных клетках менее 46, плохим прогнозом и встречается редко у детей и взрослых. Наряду с гиподиплоидным числом хромосом возможны дополнительные хромосомные аномалии [10, 21, 22]. Неблагоприятный прогноз характерен и для В-ЛБЛ/ОЛЛ с t(1;19) Й23;р13.3), Е2А/РВХ1 (TCF3-PBX1), который составляет до 6% случаев; встречается чаще у детей. В основе патогенеза этого варианта лежит транслокация t(1;19), при которой образуется химерный ген между генами Е2А (TCF3) на хромосоме 19 и РВХ1 на хромосоме 1. В результате этой транслокации появляется ген, кодирующий белок, выполняющий функцию онкогена, активирующего процессы транскрипции. В ряде случаев определяется транслокация с участием хромосомы 19, в частности t(17;19), и образование химерного гена E2A/HLF [10].
Анапластическая крупноклеточная
лимфома
Анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ) составляет до 15% случаев НХЛ и в детском возрасте наиболее часто (до 88%) представлена ALK-позитивным (ALK+), реже (до 12%) ALK-негативным (ALK-) вариантом [10, 24]. Клеточный субстрат АККЛ характеризуется атипизмом и полиморфизмом [25]. Гистологически преобладает классический вариант (66,7%), реже — мелкоклеточный (15,4%) и лимфогистиоцитарный (12,8%). Диагностически значимой является экспрессия CD30 при отсутствии В-клеточных и гистиоцитар-ных маркеров; выявление ALK (88%) и транслокации t(2;5)(p23;q35) также свидетельствует в пользу АККЛ. Экспрессия Т-клеточных маркеров (CD3, CD4, CD5, CD7, CD8) вариабельная. Методом полимеразной цепной реакции удается обнаружить химерный белок ALK-NMP, который является продуктом транслокации между хромосомами 2 и 5. Локус p23 на хромосоме 2 кодирует киназу ана-
пластической лимфомы (ALK), выполняющую роль трансмембранного рецептора, близкого к тиро-зиновым киназам лейкоцитов, физиологическая экспрессия которого в постнатальном периоде обнаруживается только в клетках центральной нервной системы. Локус q35 на 5-й хромосоме содержит ген нуклеофосмина (NPM), кодирующий кислый фосфопротеин, сосредоточенный в ядре и в зоне расположения ядрышковых организаторов. Так как белок ALK в норме выявляется только в нервной ткани, обнаружение его при АККЛ свидетельствует об аберрантной экспрессии гена, обусловленной транслокацией t(2;5) (p23;q35) [26].
В 50-60% случаев обнаруживается клональ-ная перестройка генов Т-клеточного рецептора, независимо от того, экспрессируются или нет Т-клеточные антигены [27, 28].
У ряда больных ALK+ АККЛ обнаруживается транслокация t(1;2)(q25;p23) с вовлечением гена TPM3 на хромосоме 1, кодирующего а-тропомиозин. Данная транслокация сопровождается экспрессией химерного белка TPM3-ALK. В клетках АККЛ помимо этого обнаруживаются и другие цитогенетические аномалии — t(2;3) (p23:q35) и inv(2)(p23;q35), t(2;17)(p23;q23), t(2;19) (p23;p13.3), t(2;22)(p23;q11.2), t(X;2)(q11-12;p23) [29]. Количественные хромосомные аберрации в виде трисомии (например, хромосомы 7) чаще отмечаются при АККЛ у детей, а моносомии (хромосомы 13 и 15) — у взрослых больных [30]. При развитии рецидивов АККЛ в детском возрасте возможно появление дополнительной транслокации t(3;8)(q26.2;q24), а также реаранжировок с вовлечением генов с-MYC, MCL1 и HOX11/TCL3, локусов 1q21 и 10q24, что значительно ухудшает прогноз.
Перестройки с участием гена ALK не являются строго патогномоничными для АККЛ. Известны ALK-позитивные варианты ДВККЛ, случаи воспалительной миофибробластической опухоли, нейро-бластомы, при которых отмечены аберрации гена ALK [10, 31].
Фолликулярная лимфома,
педиатрический тип
Фолликулярная лимфома, педиатрический тип (пФЛ) представляет собой крайне редкую В-НХЛ (1-2% всех НХЛ у детей), для которой характерен фолликулоподобный рост и редкая трансформация в ДВККЛ в отличие от ФЛ взрослых [10, 32]. Дополнительный дифференциальный критерий для пФЛ — частое отсутствие транслокации t(14;18)(q32;q21) и гиперэкспрессии BCL-2 [33]. Случаи пФЛ с экспрессией BCL2 являются прогностически менее благоприятными [34]. Моноклональная природа В-клеточной популяции подтверждается методами проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции. Клинически у большинства пациентов определяются I-II стадии и хороший прогноз [35].
128
Неклассифицируемая В-клеточная лимфома, занимающая промежуточное положение между ДВККЛ и ЛБ
Неклассифицируемая В-клеточная лимфома, занимающая промежуточное положение между ДВККЛ и ЛБ (ВНЛ), впервые выделена в качестве самостоятельной нозологической единицы в классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения в 2008 г. [10, 22].
Эта довольно редкая лимфома отличается высоким уровнем пролиферации (Ki-67>90%), быстрой диссеминацией опухоли с поражением экстранодальных органов, центральной нервной системы и костного мозга, высокоагрессивным клиническим течением, низким ответом на проводимую терапию и достаточно сложной диагностикой. Фенотип В клеток зародышевого центра (CD20+, CD10+, BCL6+). Для данного варианта НХЛ характерна перестройка гена c-MYC, которая в отличие от ЛБ не сопряжена генами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Довольно редко выявляют транслокации гена BCL6 и сложные аберрации кариотипа, что нехарактерно для классической ЛБ [36]. Морфологически ВНЛ может напоминать ЛБ с атипическим фенотипом (BCL-2-экспрессией) или же, наоборот, — типичный для ЛБ фенотип с атипичной морфологией (бластные характеристики ядер опухолевых клеток с негативной экспрессией TdT или циклина D1). В мировой литературе представлены единичные наблюдения ВНЛ у детей [37-39].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С 2007 по 2016 г. в исследование было включено 53 пациента. Морфоиммунологические характеристики и определение нозологической принадлежности НХЛ проводилось в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ (2008).
Молекулярно-генетический анализ опухолевого субстрата выполнен у 53 больных. При ЛБ (n=26) проводилась флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-реакция) для визуализации транслокации t(8;14) между геном с-MYC, расположенным на участке 8q24, и IgH — на участке 14q32, с использованием флуоресцентного зонда C-MYC/ IGH t(8;14)(q24;q32) (Kreatech, Нидерланды), в котором ген с-MYC окрашен зеленым цветом, а IgH — красным. Таким образом, при наличии транслокации t(8;14) в интерфазном ядре опухолевой клетки регистрировался 1 слитный красно-зеленый или желтый сигнал, свидетельствующий о наличии хромосом с перестройкой der(8) и der(14), а также 1 красный и 1 зеленый сигнал, характерные для нормальных 14-й и 8-й хромосом, соответственно.
Еще одним из генетических признаков ЛБ, изученных в настоящей работе, была транслокация между участком 8q24 и локусом иммуногло-
булина, расположенного либо на участке 22q11 — транслокация t(8;22)(q24;q11), либо на участке 2p11 — транслокация t(2;8)(p11;q24). Более точно определить партнера по транслокации участка 8q24 с помощью FISH-реакции не представляется возможным. Данную вариантную транслокацию определяли после того, как классическая транслокация t(8;14)(q24;q32) не обнаруживалась.
Для этого нами была использована флуоресцентная проба MYC (8q24) Break (Kreatech, Нидерланды), в которой указанный участок окрашен последовательно тремя цветами: проксимальный фрагмент MYC — зеленым, центральный фрагмент — голубым, дистальный — красным. Благодаря данному дизайну пробы удавалось засечь любую форму транслокации участка MYC, будь то с вовлечением дистального, проксимального или центрального отделов 8q24.
В случаях ДВККЛ (n=5) проводился FISH-анализ транслокаций с вовлечением генов BCL2/BCL6, при ПМВККЛ (n=1) — JAK2.
Транслокация с вовлечением локуса гена BCL2/18q21 оценивалась у больных пФЛ (n=2).
Стандартное цитогенетическое исследование выполнено 2 больным ЛБ, 3 больным В-ЛБЛ и 2 — с Т-ЛБЛ с поражением костного мозга.
В случаях АККЛ, ALK+ (n=10) методом FISH определялась транслокация t(2;5)(p23;q35).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенный цитогенетический анализ опухолевого субстрата выявил значительную цитогене-тическую гетерогенность НХЛ (табл.).
При ЛБ в 100% случаев определялись транслокации с вовлечением гена с-MYC: t(8;14) (q24;q32) — в 26 (86,7%) из 30 цитогенетически подтвержденных случаев ЛБ (рис. 1).
Рис. 1. Транслокация t(8;14)(q24;q32) при лимфоме Беркитта на парафиновом срезе. FISH-реакция
129
Таблица. Спектр цитогенетических аномалий при неходжкинских лимфомах (НХЛ) у детей
Аномалия кариотипа +/- Число больных (n=53) Вариант НХЛ
Абс. %
Транслокация ::(8;14)(д24;д32) + 26 49,0 ЛБ
Транслокация :(8;22)(д24;д11) + 3 5,6 ЛБ
Транслокация :(2;8)(р11;д24) + 1 1,9 ЛБ
Гипердиплоидный кариотип (более 50 хромосом) + 2 3,8 В-ЛБЛ
Транслокация :(12;21)(р13;д22) + 1 1,9 В-ЛБЛ
Транслокация :(11;14)(р13;д11) + 2 3,8 Т-ЛБЛ
Транслокация :(2;5)(р23;д35) + 10 18,9 АККЛ,ALK+
Транслокации с вовлечением генов Ба2/Баб - 5 9,4 ДВККЛ
Транслокация с вовлечением локуса гена ЖК2 + 1 1,9 ПМВКЛ
Транслокация с вовлечением локуса гена Ба2/18ц21 - 2 3,8 пФЛ
Примечание. «+» — аномалия кариотипа выявлена, «-» — аномалия кариотипа не выявлена. ЛБ — лимфома Беркитта, В-ЛБЛ/Т-ЛБЛ — В/Т-лимфобластная лимфома, АККЛ — анапластическая крупноклеточная лимфома, ДВККЛ — диффузная В-крупноклеточная лимфома, ПМВКЛ — первичная медиастинальная (тимическая) В-крупноклеточная лимфома, пФЛ — фолликулярная лимфома, педиатрический тип.
Вариантные транслокации с вовлечением c-MYC встречались реже: :(2;8)(р11;д24) — в 1 (3,3%) и 1:(8;22)(д24;д11) — в 3 (10%) случаях ЛБ (рис. 2).
Что касается ДВККЛ, то транслокации с вовлечением генов BCL2/BCL6 в пяти проанализированных нами случаях не обнаружены ни в одном из наблюдений. Реаранжировки протоонкогена c-MYC при ДВККЛ у детей не выявлялись, тем не менее при иммуногистохимическом исследовании определялась гиперэкспрессия протеина c-MYC у 2 из 5 больных.
В одном случае ДВККЛ молекулярно-генетиче-ская картина, полученная при исследовании парафиновых срезов с помощью FISH-реакции, позволила предположить наличие дупликации либо трисомии хромосомы 3.
Единственный случай ПМВКЛ, включенный в цитогенетический анализ, характеризовался
Рис. 2. Транслокация t(8;22)(q24;q11) при лимфоме Беркитта на парафиновом срезе. FIsH-реакция
наличием транслокации с вовлечением локуса гена JAK2 при отсутствии аберраций, затрагивающих BCL2, BCL6 и c-MYC.
Лимфобластные лимфомы из клеток-предшественников отличались гетерогенностью. Так, в 1 случае В-ЛБЛ был выявлен гипердиплоидный набор хромосом с кариотипом 50 XY, +5, +16, +21; в другом — транслокация t(12;21)(p13;q22). При Т-ЛБЛ в 2 случаях определялась транслокация t(11;14)(p13;q11).
При пФЛ ни в одном из 2 проанализированных случаев транслокации с вовлечением локуса гена BCL2/18q21 не обнаружены.
Не только стандартное цитогенетическое и/ или FISH-исследование позволяет выявить хромосомные аберрации, но и экспрессия совокупности определенных иммуногистохимических (суррогатных) маркеров с высокой достоверностью позволяет предположить цитогенетические аберрации. Одним из таких алгоритмов является анализ экспрессии TCL-1, CD38 и CD44, позволяющий предполагать реаранжировки гена с-MYC. Так, при обнаружении на клетках ЛБ CD38, TCL-1 и отсутствии CD44 можно с высокой долей вероятности говорить о наличии аберраций с вовлечением гена c-MYC. В нашей работе мы сопоставили данные иммуногистохимического алгоритма, учитывающего экспрессию CD38, TCL-1 и CD44 при ЛБ (n=10), с результатами FISH. При иммуногистохимическом исследовании в 10 (100%) случаях клетки опухоли были позитивны в реакции с маркерами CD38 и TCL-1, тогда как реакция с CD44 оказалась негативной. В этой же группе больных по результатам FISH в 9/10 случаев была обнаружена транслокация t(8;14)(q24;q32) и в 1/10 — t(8;22)(q34;q11). Следовательно, у всех больных с классическим вариантом ЛБ определялась та или иная транслокация с вовлечением с-MYC. В настоящее время в своей практике мы используем другой сурро-
гатный маркер — антитело к c-MYC (клоны Y69/ EP121); ядерная экспрессия в 100% опухолевых клеток свидетельствует о высокой вероятности реаранжировки гена c-MYC.
Не только при ЛБ иммуногистохимические маркеры позволяют прогнозировать наличие соответствующей генетической аберрации, но и при АККЛ на основании характера экспрессии белка ALK возможно предположить наличие транслокации t(2;5)(p23;q35). Так, если в опухолевых клетках АККЛ ALK определяется и в ядре, и в цитоплазме клетки, то с большой вероятностью можно говорить о наличии транслокации t(2;5)(p23;q35). По данным иммуногистохимического исследования у 7 из 10 детей в опухолевых клетках присутствовала транслокация t(2;5)(p23;q35). У 2 отмечалась цитоплазматическая реакция на ALK и у 1 больного — ядерная, что позволило предположить вариантные транслокации, затрагивающие ген ALK. Для подтверждения данной гипотезы мы сопоставили результаты иммуногистохимического исследования с результатами FISH, и в 9 из 10 случаев была обнаружена транслокация с вовлечением гена ALK — t(2;5)(p23;q35), что свидетельствует о высокой информативности иммуногистохимиче-ских (суррогатных) маркеров.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в нашем исследовании генетический анализ опухолевых клеток позволил подтвердить диагноз того или иного варианта НХЛ, установленного на основании морфоиммунологи-ческого исследования. Мы не наблюдали случаев расхождения морфоиммунологического и генетического диагнозов, что, вероятно, обусловлено преобладанием классических морфологических вариантов НХЛ у детей.
Проведение цитогенетического исследования абсолютно обосновано и оправдано в случаях double- и triple-hit-лимфом, ВНЛ, поскольку позволяет
выявить перестройки генов c-MYC, BCL2, BCL6, обнаружить дополнительные хромосомные аберрации, отражающие этапы лимфомогенеза и опухолевой прогрессии.
Иммуногистохимический алгоритм, определяющий экспрессию CD38, TCL-1 и CD44, с высокой долей достоверности свидетельствует о самом факте реаранжировки протоонкогена с-MYC, но не позволяет четко идентифицировать, в какую из транслокаций вовлечен с-MYC. Тем не менее получаемые таким образом данные в комплексе с морфоиммунологической характеристикой заболевания позволяют провести дифференциальную диагностику ЛБ с ДВККЛ, при которой реаранжировки с вовлечением с-MYC встречаются редко.
Для дифференциальной диагностики ЛБ и гетерогенной группы double- и triple-hit-лимфом одного факта наличия/отсутствия аберрации с вовлечением с-MYC недостаточно. В данных клинических случаях иммуногистохимический алгоритм, прогнозирующий перестройки с-MYC, не позволяет установить диагноз, что диктует необходимость проведения стандартного цитогенетического исследования или FISH с изучением транслокаций протоонкогена с-MYC, а также генов BCL2 и BCL6.
Если при В-НХЛ и АККЛ цитогенетическое исследование необходимо для уточнения диагноза, то при В-ЛБЛ выявляемые цитогенетические аномалии достоверно сопряжены с прогнозом заболевания и в последующем, возможно, станут дополнительными критериями стратификации больных на прогностические группы риска.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Не указан
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1. Киселев А.В., Махонова Л.А., Петерсон И.С. и соавт. Неходжкинские лимфомы. В кн.: Злокачественные новообразования кроветворной и лимфоидной ткани у детей. М.: Медицина. 2001. С. 187-203.
2. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г. Под ред. М.И. Давыдова и Е.М. Аксель. М.: Изд. группа РОНЦ. 2014. 226 с.
3. Patte C. Non-Hodgkin's lymphoma. In: Pediatric oncology. Clinical practice and controversies. London etc: Chapman a Hall Medical. 1997. 278 р.
4. Гематология: национальное руководство. Под ред. О.А. Рукавицина. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2015. 776 с.
5. Arnold S. Freedman, Lee M. Nadler. Chapter 130: Non-Hodgkin's Lymphomas. Holland-Frei Cancer Medicine / Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR, Bast RS, Gansler TS, Holland JF, Frei E. 5th. Hamilton, Ont: B.C. Decker. 2000. SBN 1-55009-113-1.
6. Kramer S, Hikel S, Adams K, Hinds D, Moon K. Current Status of the Epidemiologic Evidence Linking Polychlorinated
Biphenyls and Non-Hodgkin Lymphoma, and the Role of Immune Dysregulation. Environmental Health Perspectives. 2012. P. 1067.
7. Барях Е.А., Кравченко С.К., Обухова Т.Н. и др. Лимфома Беркитта: клиника, диагностика, лечение. Фундаментальные исследования и клиническая практика. Клиническая онкогематология. 2009;2(2):137-146.
8. Барях Е.А. Лейкоз/лимфома Беркитта: клинические особенности, диагностические критерии, терапевтическая тактика / Е.А. Барях, С.К. Кравченко, А.М. Кременецкая и др. Клиническая онкогематология. 2010;3(2):138-143.
9. Croce C. Role of chromosome translocations in human neoplasia / C. Croce. Cell. 1987;49(2):155-156.
10. Валиев Т.Т. Современная стратегия диагностики и лечения неходжкинских лимфом у детей. Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2014. 239 с.
11. Валиев Т.Т., Барях Е.А. Эволюция взглядов на диагностику и лечение лимфомы Беркитта. Клиническая онкогематология. 2014;7(1):46-56.
12. Tagawa H, IkedaS, Sawada K. Role of microRNA in the pathogenesis of malignant lymphoma. Cancer Sci. 2013;10:121-126.
13. Sander S, Calado DP, Srinivasan L, et al. Synergy between PI3K signaling and MYC in Burkitt lymphomagenesis. Cancer Cell. 2012;22(2):167-179.
14. Love C, Sun Z, Jima D. The genetic landscape of mutations in Burkitt lymphoma. Nat Genet. 2012;44(12):1321-1325.
15. Ковригина А.М. Лимфома Ходжкина и крупноклеточные лимфомы / А.М. Ковригина, Н.А. Пробатова. М.: МИА.
2007. 214 с.
16. Слугин А.И. Крупноклеточные лимфомы у детей (клиника, диагностика, лечение). Автореф. дис. ...канд. мед. наук. М., 2002. 145 с.
17. Nakayama S, Yokote T, Iwaki K. Triple-hit B-cell lymphoma, unclassified with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma associated with a novel complex karyotype including t(2;3)(q21;q27), t(8;14)(q24;q32) and t(14;18)(q32;q21). Br J Haematol. 2013;160(5):569.
18. Fanidi A, Harrington EA, Evan G. Cooperative interaction between c-MYC and BCL-2 protooncogenes. Nature. 1992;359(6395):554-556.
19. Aukema SM, Siebert R, Schuuring E, et al. Double-hit B-cell lymphomas. Blood. 2011;117(8):2319-2331.
20. Graux C, Cools J, Michaux L, et al. Cytogenetics and molecular genetics of T-cell acute lymphoblastic leukemia: from thymocyte to lymphoblast. Leukemia. 2006;20:1496-1510.
21. Лейкозы у детей. Под ред. Г.Л. Менткевича, С.А. Маяковой. М.: Практическая медицина. 2009. 381 с.
22. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoetic and Lymphoid tissues. 4th Ed. International Agency for Research on Can-cer. Lyon.
2008. Р. 439.
23. Бойченко Э.Г. Сравнительный анализ программ химиотерапии различной интенсивности в лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей. Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2012. 267 с.
24. Oschlies I, Lisfeld J, Lamant L, et al. ALK-positive anaplastic large cell lymphoma limited to the skin: clinical, histo-patho-logical and molecular analysis of 6 pediatric cases. A report from the ALCL99 study. Haematol. 2013;98(1):50-56.
25. Атлас опухоли лимфатической системы. Под ред. А.И. Воробьева, А.М. Кременецкой. М.: Ньюдиамед. 2007. 292 с.
26. Pulford K, Morris SW, Turturro F. Anaplastic lymphoma kinase proteins in growth control and cancer. J Cell Physiol. 2004;199:330-358.
27. Amin HM, Lai R. Pathobiology of ALK+ anaplastic large-cell lymphoma. Blood. 2007;110(7):2259-2267.
28. Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. Revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood. 1994;84(5):1361-1392.
29. Trinei M, Lanfrancone L, Campo E, et al. A new variant neoplastic lymphoma kinase (ALK)-fusion protein (ATIC-ALK) in a case of ALK-positive anaplastic large cell lymphoma. Cancer Res. 2000. Р. 793.
30. Mussolin L, Pillon M, Bonato P, et al. Cytogenetic analysis of pediatric anaplastic large cell lymphoma. Pediatr Blood Cancer. 2010;55(3):446-451.
31. Subramaniam MM, Piqueras M, Navarro S, et al. Aberrant copy numbers of ALK gene is a frequent genetic alteration in neuroblastomas. Hum Pathol. 2009;40:1638-1640.
32. Ribeiro RC, Pui CH, Murphy SB, et al. Childhood malignant non-Hodgkins lymphomas of uncommon histology. Leukemia. 1992;6:761-765.
33. Cook JR. Paraffin section interphase fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and classification of non-Hodgkin lymphoma. Diagn Mol Pathol. 2004;13(4):197-206.
34. Oschlies I, Salaverria I, Mahn F. Pediatric follicular lympho-ma-a clinico-pathological study of a population-based series of patients treated within the Non-Hodgkin's LymphomaBerlin-Frankfurt-Munster (NHL-BFM) multicenter trials. Haematol. 2010;95(2):253-259.
35. O'Suoji C, Welch JJ, Perkins SL, Smith LM, Weitzman S, Simko SJ, Galardy PJ, Bollard CM, Gross TG, Termuhlen AM. Rare Pediatric Non-Hodgkin Lymphomas: A Report From Children's Oncology Group Study ANHL 04B1. Pediatr Blood Cancer. 2016;63:794-800.
36. Liang X, Greffe B, Cook B, et al. Gray zone lymphomas in pediatric patients. Pediatr. Dev Pathol. 2011;14(1):57-63.
37. Jain D, Agrawal S, Chopra P. B-cell lymphoma unclassifiable with features intermediate between diffuse large B cell and Burkitt lymphoma-presented with multiple lymphomatous polyposis of gastrointestinal tract. J Gastrointest Cancer. 2011;42(4):282-6.
38. Gualco G, Weiss LM, Harrington WJ Jr, et al. Nodal diffuse large Bcell lymphomas in children and adolescents: immu-nohistochemical expression patterns and c-MYC translocation in relation to clinical outcome. Am J Surg Pathol. 2009;33(12):1815-22.
39. Ahn JY, Seo YH, Park PW, et al. A case of B-cell lymphoma, unclassifiable, with features intermediate between diffuse large B-cell lymphoma and Burkitt lymphoma in a Korean child. Ann Lab Med. 2012;32(2):162-6.
132
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Валиев Тимур Теймуразович, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 23, e-mail: timurvaliev@mail.ru
Ковригина Алла Михайловна, доктор биологических наук, заведующая патологоанатомическим отделением ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ
Адрес: 125167, Москва, Новозыковский пр-д, д. 4а, e-mail: kovrigina.alla@gmail.com
Ключагина Юлия Ивановна, студентка 5-го курса ЦИОП «Медицина будущего», факультета «лечебное
дело» ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ
Адрес: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, e-mail: klyuchagina92@mail.ru
Сендерович Анастасия Ильинична, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории
молекулярной патологии отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической
онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ
Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 23, e-mail: a.senderovich@mail.ru
